大腸桿菌化轉(zhuǎn)流程

大腸桿菌化轉(zhuǎn)流程大腸桿菌化轉(zhuǎn)（即大腸桿菌轉(zhuǎn)化）是分子生物學(xué)研究中的一項基本技術(shù)，它允許外源DNA（如質(zhì)粒DNA或重組DNA）導(dǎo)入大腸桿菌受體細(xì)胞中進行復(fù)制、增殖和表達(dá)。以下是詳細(xì)的大腸桿菌化轉(zhuǎn)流程：一、實驗準(zhǔn)備1.材料與試劑：-大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞（如DH5α等）-質(zhì)粒DNA或重組DNA-LB培養(yǎng)基（包括固體和液體培養(yǎng)基，可添加適當(dāng)抗生素如Amp或Kan用于抗性篩選）-無菌ddH2O-20%IPTG（M/V）和2%X-gal（M/V）（用于藍(lán)白斑篩選，可選）-其他實驗所需器材如超凈工作臺、酒精燈、玻璃涂棒、恒溫培養(yǎng)箱、制冰機、恒溫?fù)u床、微量移液取樣器等2.培養(yǎng)基準(zhǔn)備：-制備LB液體培養(yǎng)基，高壓蒸汽滅菌后冷卻備用。-制備LB固體培養(yǎng)基，加入瓊脂粉并高壓蒸汽滅菌，冷卻至60℃左右時加入抗生素（如需要），倒入培養(yǎng)皿中待其凝固。二、大腸桿菌轉(zhuǎn)化步驟1.感受態(tài)細(xì)胞處理：-從超低溫冰柜（通常為-80℃）中取出一管感受態(tài)細(xì)胞，立即置于冰上融化。可手指輕彈試管壁檢查是否完全溶解，避免放置較長時間以保持高轉(zhuǎn)化效率。2.加入質(zhì)粒DNA：-在超凈臺中，向融化的感受態(tài)細(xì)胞中加入適量的質(zhì)粒DNA（通常為1-10μL，DNA含量10-100ng），輕輕旋轉(zhuǎn)或輕彈管壁使質(zhì)粒DNA與感受態(tài)細(xì)胞混合均勻，避免劇烈晃動。3.冰?。?將加入質(zhì)粒DNA的感受態(tài)細(xì)胞置于冰上，冰浴20-30分鐘，使DNA分子充分吸附到感受態(tài)細(xì)胞的表面。4.熱激：-將感受態(tài)細(xì)胞與質(zhì)粒DNA的混合物放入預(yù)熱至42℃的水浴鍋中進行熱激處理，通常為30秒至90秒不等（具體時間根據(jù)實驗需求而定）。熱激后立即將離心管放回冰上，靜置2-3分鐘以冷卻。5.復(fù)蘇：-在超凈臺中向感受態(tài)細(xì)胞中加入適量無抗生素的LB液體培養(yǎng)基（通常為800-1000μL），輕輕混勻后置于37℃恒溫?fù)u床上，以200-220rpm的速度振蕩培養(yǎng)1-2小時，使感受態(tài)細(xì)胞復(fù)蘇并表達(dá)質(zhì)粒DNA上的基因。6.涂布平板：-復(fù)蘇結(jié)束后，將培養(yǎng)液進行低速離心（如4000-5000rpm離心1-2分鐘），去掉大部分上清液，用剩余的少量培養(yǎng)液將細(xì)胞重懸。取適量細(xì)胞懸液（通常為100-300μL）均勻涂布在含有適當(dāng)抗生素的LB固體培養(yǎng)基上。7.培養(yǎng)與觀察：-將涂布好的培養(yǎng)皿先置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中30-60分鐘，使表面液體滲透到培養(yǎng)基里。然后倒置培養(yǎng)皿，繼續(xù)在37℃恒溫培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)（通常為12-16小時），直至單菌落出現(xiàn)。8.后續(xù)處理：-觀察平板上長出的菌落克隆，記錄菌落生長情況。根據(jù)實驗需求，可進一步進行單克隆挑菌、菌落PCR鑒定、質(zhì)粒抽提及測序等后續(xù)處理。三、注意事項-在整個實驗過程中，必須保持無菌操作，避免污染。-感受態(tài)細(xì)胞剛?cè)诨瘯r轉(zhuǎn)化效率最高，因此應(yīng)避免長時間放置。-熱激處理是轉(zhuǎn)化過程中的關(guān)鍵步驟，必須嚴(yán)格控制溫度和時間。-