DB34∕T 2562-2015 大曲酯酶活力的檢測 酶聯(lián)免疫法(ELISA)

大曲酯酶活力的檢測酶聯(lián)免疫法(ELISA)HYPERLINK安徽省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布I本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由安徽省濃香型白酒標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：安徽瑞思威爾科技有限公司、安徽古井貢酒股份有限公司、安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：周慶伍、李安軍、蔣軍、湯有宏、江昌俊、梁紹勛、李曉歡、何宏魁、吳文睿、劉國英、汪君、李紅歌、馬俠。1大曲酯酶活力的檢測酶聯(lián)免疫法(ELISA)本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了大曲酯酶活力的檢測酶聯(lián)免疫法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于大曲酯酶活力的測定。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。酯酶活力單位esteraseactivityunit在37℃、pH6.0條件下，15min水解α-乙酸萘酯轉(zhuǎn)化為α-萘酚，每產(chǎn)生1nmolα-萘酚為1個(gè)酯酶活力單位(U)。HYPERLINK試樣中的酯酶與微孔中包被的羧酸酯酶抗體結(jié)合，在酶標(biāo)記物的作用下，形成的酶標(biāo)抗體抗原復(fù)合物與顯色劑發(fā)生反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測定吸光度，根據(jù)吸光度值得出試樣中酯酶活力。HYPERLINK5試劑和材料5.1本實(shí)驗(yàn)所用試劑除非另有說明，均為分析純，水為符合GB/T6682二級(jí)水。5.2酯酶試劑盒：2～8℃冰箱中保存。5.2.1包被羧酸酯酶抗體的聚苯乙烯微量反應(yīng)板。5.2.2羧酸酯酶標(biāo)準(zhǔn)品：450U/L。5.2.3羧酸酯酶標(biāo)記物。5.2.4羧酸酯酶標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液。5.2.5試樣稀釋液。5.2.6洗板母液。25.2.7顯色劑A。5.2.8顯色劑B。5.2.9反應(yīng)終止液。5.3磷酸二氫鈉(NaH?PO4·2H?O):優(yōu)級(jí)純。5.4磷酸氫二鈉(Na?HPO4·12H?O):優(yōu)級(jí)純。5.5氯化鈉(NaCl):優(yōu)級(jí)純。5.6磷酸鹽緩沖溶液：pH=7.4。分別稱取0.62g磷酸二氫鈉(5.3)、5.73g磷酸氫二鈉(5.4)和9g氯化鈉(5.5),加水溶解至1000mL,在pH計(jì)上調(diào)節(jié)溶液pH=7.4。5.7羧酸酯酶標(biāo)準(zhǔn)溶液：根據(jù)酯酶試劑盒(5.2)的線性范圍，用羧酸酯酶標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液(5.2.4)將羧酸酯酶標(biāo)準(zhǔn)品(5.2.2)稀釋成不同活力的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，每次測定現(xiàn)配現(xiàn)用。5.8洗滌液：將洗板母液(5.2.6)按照酯酶活力試劑盒中規(guī)定的比例用水稀釋，混勻后備用。6儀器和設(shè)備6.1酶標(biāo)儀(配備450nm濾光片)。6.2分析天平：感量1mg6.3冷凍離心機(jī)。6.4振蕩器。6.5恒溫培養(yǎng)箱。6.6超聲波細(xì)胞破碎儀。7測定步驟7.1粗酶液制備7.1.1稱取0.1～0.5g試樣，精確到0.001g,置于100mL燒杯中，加50mL磷酸鹽緩沖溶液(5.6),振蕩10min。將燒杯置于超聲波細(xì)胞破碎儀(6.6)中，超聲探頭直徑6～8mm、超聲溫度4～8℃、超聲時(shí)間3～5s、間歇時(shí)間3～5s、超聲功率300～350W、總超聲時(shí)間5～10min,制成試樣液。7.1.2試樣液于4～8℃、5000r/min離心10min,取1mL上清液于250mL容量瓶中，加磷酸鹽緩沖溶液(5.6)至刻度，搖勻，制成粗酶液。保存過程中如有沉淀，應(yīng)再次離心。7.2測試程序流使用，請勿傳播或其他用途7.2.1以下所有操作應(yīng)在20～25℃室溫下進(jìn)行。7.2.2酶標(biāo)儀測定條件：酶標(biāo)儀測定波長450nm。7.2.3酯酶試劑盒(5.2)中所有的試劑的溫度均應(yīng)回升到室溫(20～25℃)后方可使用。7.2.4洗板條件7.2.4.1人工洗板次數(shù)5次以上，每次注水量250μL。7.2.4.2自動(dòng)洗板可以設(shè)定5個(gè)周期。7.2.5記錄空白、標(biāo)準(zhǔn)品和試樣在微孔板上的位置。37.3.1吸取50μL羧酸酯酶標(biāo)準(zhǔn)工作溶液(5.7)依次加入標(biāo)準(zhǔn)溶液孔底(5.2.5)加入試樣孔底部，再加10μL粗酶液(7.1),混合均勻。7.3.2封板膜封板后置于37℃恒溫培養(yǎng)箱(6.5)中孵育30min。7.3.3取出微量反應(yīng)板，棄去液體，甩干，立即用洗滌液(5.8)按7.2.4條件進(jìn)行洗板，每次靜置7.3.4吸取50μL羧酸酯酶標(biāo)記物(5.2.3)于空白孔外的每一個(gè)微孔。用封板膜密封孔口，于37℃孵育30min。7.3.5按7.3.3步驟重復(fù)操作。7.3.6加入50μL顯色劑A(5.2.7)和50μL顯色劑B(5.2.8)于每一個(gè)微孔底部，搖勻后于37℃孵7.3.7迅速加入反應(yīng)終止液(5.2.9)50μL于每一個(gè)微孔底部，搖勻(此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色)。7.3.8將微量反應(yīng)板置于酶標(biāo)儀(6.1)中，在450nm處用空白孔調(diào)零點(diǎn)，測定吸光度(加入反應(yīng)終止7.4平行試驗(yàn)7.5空白試驗(yàn)8結(jié)果計(jì)算以吸光度值為縱坐標(biāo)，酯酶的活力(U/L)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線上得到試樣中相應(yīng)的酯酶活力，結(jié)果按公式(1)進(jìn)行計(jì)算。...................