中圖版高中生物考點加強課6限制酶的選擇原則

考點加強課6限制酶的選擇與口的基因的檢測

為藤?練~與鑒定

I展現(xiàn)肆方法|技法必備巧攻關(guān)

1.限制酶的選擇原則

Pst

PstISmaIPsiI

L+

sLI抗病法國京RI

圖中

(1)根據(jù)目的基因兩端的限制酶切點確定限制酶的種類

①應(yīng)選擇切點位于目的基因兩端的限制酶，以便將目的基因"切出"，如圖甲可選擇

PstT。

②不能選擇切點位于目的基因內(nèi)部的限制酶，以防破壞目的基因，如圖甲不能選擇

Smal?

③為避免目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化和隨意連接，也可使用不同的限制酶切割目的基

因和質(zhì)粒，如圖甲也可選擇用PstI和EcoRI兩種限制酶(但要確保質(zhì)粒上也有這兩種酶

的切點)，而且這種切點不致于破壞所有的“標(biāo)記基因”以及啟動子和終止子。

(2)根據(jù)質(zhì)粒的特點確定限制酶的種類

因其切點

不在啟動;

其會破壞啟動子不

子與終止M〃din—一宜選擇

子之間不

宜選擇其位『啟動子、終

，抗性赳終止天'BamH1止子之間宜選擇

■EcoRI

因其位于其會破壞終止子不

“標(biāo)記基因宜選擇

內(nèi)不宜選

此位點切割會導(dǎo)致

擇“

終止子丟失不宜選

因其位于或制原點內(nèi).如制原點被破壞或擇

切掉后不能在受體細胞中或制保存.而不

宜選擇

①所選限制酶要與切割目的基因的限制酶相一致，以確保具有相同的黏性末端。

②質(zhì)粒作為載體必須具備標(biāo)記基因等，所以所選擇的限制酶盡量不要破壞這些結(jié)構(gòu)，

應(yīng)至少含有一個完好的標(biāo)記基因，如圖乙中限制酶夕stI因其會破壞標(biāo)記基因而不宜選擇。

③所選限制酶切點不應(yīng)位于復(fù)制原點處以防破壞復(fù)制原點，如果所選酶的切點不止一

個，則切割重組后可能會丟失某些片段，若丟失的片段含復(fù)制原點區(qū)，則切割重組后的片

段進入受體細胞后不能自主復(fù)制。

④所選限制酶，其切點應(yīng)位于啟動子與終止子之間，如圖乙中》〃7din會破壞啟動子,

FcoRI會破壞終止子，而A/del和BarriaI切出的切口可讓目的基因嵌入啟動子與終止

子之間。

(3)參考Ti質(zhì)粒的T-DNA片段選擇限制酶

若質(zhì)粒上標(biāo)出T-DNA片段，則所選限制酶切點應(yīng)位于T-DNA片段中，從而有利

于將目的基因嵌入到T-DNA片段上——因為Ti質(zhì)粒的T-DNA片段最易轉(zhuǎn)移至受體細

胞并且整合到受體細胞染色體DNA上,如用兩種限制酶XbaI和SacI(兩種酶切出的

黏性末端不同)切割某DNA,獲得含目的基因的片段。若利用該片段構(gòu)建基因表達載體，

則下圖中甲、乙、丁，Ti質(zhì)粒均不宜選擇，而丙Ti質(zhì)粒宜選取。(分析如下)

T-DNAT-DNAXbaISacIXbalXba\

切點不位于上而且含XbaI,T-DNA上

T-DNA上SacI兩種切點恰但缺乏Sac\

與目的基因兩端切點

切點相同

2.目的基因的檢測與鑒定

(1)界定〃標(biāo)記基因〃與〃DNA分子雜交技術(shù)〃在目的基因檢測中的作用：

①載體上標(biāo)記基因的標(biāo)記原理

載體上的標(biāo)記基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要轉(zhuǎn)入的受體細胞沒有抵

抗相關(guān)抗生素的能力。當(dāng)含有抗生素抗性基因的載體進入受體細胞后，抗性基因在受體細

胞內(nèi)表達，使受體細胞能夠抵抗相應(yīng)抗生素，所以在受體細胞的培養(yǎng)體系中加入該種抗生

素就可以只保留轉(zhuǎn)入載體的受體細胞，倘若在選擇培養(yǎng)基中不能存活，則表明無質(zhì)粒轉(zhuǎn)入，

當(dāng)然不會有〃目的基因〃轉(zhuǎn)入，能存活時必含該載體,原理如下圖所示：

進入受_________在含南城節(jié)青尊隸I

的培養(yǎng)基上培養(yǎng)

只有含有載體.

含有氨節(jié)育

IQI并且載體上的

大腸桿菌中有的

霉素抗性基基因表達的大

因的質(zhì)粒有載體進入,有

腸桿菌才能存

的沒有載體進入

活井增殖

②"標(biāo)記基因"篩選后為何還需應(yīng)用"DNA分子雜交技術(shù)”確認(rèn)目的基因是否轉(zhuǎn)

入？

經(jīng)上述步驟篩選得到的受體細胞，只是含特定的標(biāo)記基因的質(zhì)粒，然而，該質(zhì)粒上是

否成功嵌入了目的基因，還不能確定，故仍需使用"目的基因"作探針，利用DNA分子

雜交技術(shù)，檢測受體細胞的質(zhì)粒上是否含目的基因。

(2)使用"目的基因"作探針，運用"分子雜交技術(shù)”檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出特定

mRNA。

(3)采用"抗原一抗體雜交技術(shù)"，從轉(zhuǎn)基因生物中提取蛋白質(zhì)(作抗原)與相應(yīng)抗體雜

交，依據(jù)是否出現(xiàn)雜交帶確認(rèn)目的基因是否"指導(dǎo)"特定蛋白質(zhì)的合成。

(4)采用抗蟲、抗病毒等"接種實驗”進行目的基因成功表達的"個體生物學(xué)"水平的

檢測。

|探高考真題|探究高考明考百

【例證】(2016?全國卷IH,40)圖⑻中的三個DNA片段上依次表示出了EcoRI、

8amHI和Sau3AI三種限制性內(nèi)切酶的識別序列與切割位點，圖(b)為某種表達載體的示

意圖(載體上的EcoRI、Sa=3AI的切點是唯一的)。

—GAATTCGGATCC—GATC

——Cl'TAAGCCTAGG——CTAG

,Sau3AI

抗生素抗性基因

圖(b)

根據(jù)基因工程的有關(guān)知識，回答下列問題：

(1)經(jīng)BarriaI酶切后得到的目的基因可以與上述表達載體被酶切后的產(chǎn)物

連接，理由是__________________________________________________

(2)若某人利用圖(b)所示的表達載體獲得了甲、乙、丙三種含有目的基因的重組DNA

分子，如圖(c)所示，這三種重組DNA分子中，不能在宿主細胞中表達目的基因產(chǎn)物的

有,不能表達的原因是

目的H的基因

基因

目的

基因

圖(C)

(3)DNA連接酶是將兩個DNA片段連接起來的酶，常見的有和，其

中既能連接黏性末端又能連接平末端的是_______________________O

［慧眼識圖獲取信息］

(1)三種限制酶切割結(jié)果分析

&?RI切割后的黏性末端I切割后的新性末端

-GAATTC——G{GATC}C—

—errAAG——CCTAG—A"G一

3AI切割后的黏性末端

GATC—

Tta?-此兩類黏性末端

▲可相互.配對”

..............一故可連接

(2)表達載體與重組DNA分子分析

由此可見,只有乙所示目的基因其首端為

啟動于.尾端燧止于，故其能正常表達

答案(l)Sa=3Al兩種酶切割后產(chǎn)生的片段具有相同的黏性末端(2)甲、丙甲中

目的基因插入在啟動子的上游，丙中目的基因插入在終止子的下游，二者的目的基因均不

能被轉(zhuǎn)錄(3)￡co//DNA連接酶T4DNA連接酶T4DNA連接酶

|練經(jīng)典模擬|技法體驗志必得

1.（2019?湖南長沙長郡中學(xué)月考）下圖是利用工程菌（大腸桿菌）生產(chǎn)人生長激素的實驗

流程。所用的PBR322質(zhì)粒含有限制酶PstI、EcoRI和HindHI的切點各一個，且三種

酶切割形成的末端各不相同，而Ampr表示氨莘青霉素抗性基因，TeV表示四環(huán)素抗性基

因。請回答以下相關(guān)問題：

構(gòu)建基因表二大

一達載體腸

桿

赭

無菌牙簽

含四

壞素

切割后的啦粒人

生

培養(yǎng).分離純化

代

丙激

人生長激素

素基因（器器臺01僦

三人生長激凝mRNA」一人的某組織細胞

（1）過程①所用到的組織細胞是,過程④所用的酶是o⑤過程常用

溶液處理大腸桿菌。

（2）經(jīng)②過程得到的互補DNA片段，稱為。

（3）如果用限制酶R?I、￡coRI和477dHI對圖中質(zhì)粒進行切割，用一種酶、兩種

酶和三種酶分別切割時形成的DNA片段種類與用一種酶和兩種酶分別切割時形成的DNA

片段種類（填"相同"或"不同"），這些種類的DNA片段中含有完整氨節(jié)青霉素

抗性基因的DNA片段和四環(huán)素抗性基因的DNA片段分別有種和種。

（4）如果只用限制酶PstI切割目的基因和質(zhì)粒，完成過程④、⑤后（受體大腸桿菌不含

Amp、TeV）,將三角瓶內(nèi)的大腸桿菌先接種到甲培養(yǎng)基上，形成菌落后用無菌牙簽挑取培

養(yǎng)基甲上的單個菌落，分別接種到乙和丙兩個培養(yǎng)基的相同位置上，一段時間后，菌落的

生長狀況如圖乙、丙所示。接種到甲培養(yǎng)基上的目的是篩選的大腸桿菌;

接種到培養(yǎng)基乙上的大腸桿菌菌落，能存活的大腸桿菌體內(nèi)導(dǎo)入的是.含有

目的基因的大腸桿菌在培養(yǎng)基乙和丙上的生存情況是

______________________________________________________________________________________________________________________________________________________O

（5）將大腸桿菌培養(yǎng)在含氨茉青霉素、四環(huán)素培養(yǎng)基上的過程，屬于基因工程基本操作

中的___________________________________________________

步驟。該基因工程中的PBR322質(zhì)粒徹底水解的產(chǎn)物是___________________

______________________________________________________________________________________________________________________________________________________O

解析（1）過程①獲得的是人生長激素mRNA,所以組織細胞取自人垂體組織細胞；過

程④構(gòu)建基因表達載體的酶是DNA連接酶；過程⑤將基因表達載體導(dǎo)入大腸桿菌前，常

用CaCL溶液處理大腸桿菌，使之成為感受態(tài)細胞。（2）②過程是人的生長素mRNA逆轉(zhuǎn)

錄形成cDNA的過程。（3）為？1、Ecc^I和/■/力dm三種酶的切點分別用1、2、3表示，

一種酶酶切時，一共可以得到3種相同長度的片段；兩種酶酶切時，可得至I」1-2,2-1,

2-3,3-2,1-3,3-1六種片段;三種酶酶切時,可得到1-2,2-3,3-1三種片

段，與前面重復(fù)，因此用一種酶、兩種酶和三種酶分別切割時形成的DNA片段種類與用

一種酶和兩種酶分別切割時形成的DNA片段種類相同。這些種類的DNA片段中含有完整

氨萃青霉素抗性基因的DNA片段和四環(huán)素抗性基因的DNA片段分別有3種和3種。（4）

在甲中能生長的是具有四環(huán)素抗性的細菌，含有四環(huán)素抗性基因；在乙培養(yǎng)基中能生長的

是具有四環(huán)素和氨莘青霉素抗性的細菌，所以導(dǎo)入的是完整的PBR322質(zhì)粒或含有Amp1

Tetr的質(zhì)粒。與丙相比，乙培養(yǎng)基中少了兩個菌落，說明丙培養(yǎng)基中這兩個菌落中的大腸

桿菌成功導(dǎo)入了重組質(zhì)粒，而且目的基因插入質(zhì)粒后，破壞了氨莘青霉素抗性基因，使含

有目的基因的大腸桿菌不能在含有氨茉青霉素的乙培養(yǎng)基上生長，但四環(huán)素抗性基因是完

好的，則含有目的基因的大腸桿菌能在含有四環(huán)素的丙培養(yǎng)基上生長。（5）將大腸桿菌培養(yǎng)

在含氨莘青霉素、四環(huán)素培養(yǎng)基上的過程，屬于基因工程中的篩選含目的基因的受體細胞

步驟。該基因工程中的pBR322質(zhì)粒的化學(xué)本質(zhì)是DNA,其徹底水解的產(chǎn)物是磷酸、脫

氧核糖和四種含氮堿基。

答案（1）人垂體組織細胞DNA連接酶CaCI2

（2）cDNA⑶相同33⑷含四環(huán)素抗性基因完整的pBR322質(zhì)粒（或含有

Amp'Tetr的質(zhì)粒）在丙中能存活，在乙中不能存活（5）篩選含目的基因的受體細胞磷

酸、脫氧核糖、四種含氮堿基

2.（2019?河南名校聯(lián)盟調(diào)研）如圖所示為培育轉(zhuǎn)基因細菌的操作流程，回答下列問題：

◎+1細菌在培養(yǎng)液中

繁殖后,在固體

培養(yǎng)基生長建一

我體外源DNA-重。制質(zhì)粒

轉(zhuǎn)染

—市組DNA增殖篩選含重組

細菌咬粒的細菌

2

（1）圖中①過程所用工具酶有o為了防止載體和外源DNA自連，應(yīng)

如何操作?.

(2)當(dāng)細菌的轉(zhuǎn)化過程中吸收的外源DNA是病毒DNA時，該轉(zhuǎn)化過程又稱轉(zhuǎn)染。圖

中外源DNA來自。為了提高轉(zhuǎn)染效率，應(yīng)使用處理細菌。

⑶圖中②過程，重組DNA增殖時需要哪些條件？

_______________________________________________________O

(4)圖中③過程，篩選含重組質(zhì)粒的細菌需用到基因的功能。已知所用載體內(nèi)

有青霉素抗性基因和四環(huán)素抗性基因兩種抗性基因，請寫出能在含四環(huán)素的培養(yǎng)基上生長，

但不能在含青霉素的培養(yǎng)基上生長的細菌即為含外源DNA細菌的前提條件：

_________________________________________________(答出兩點即可)。

解析根據(jù)轉(zhuǎn)染的定義可知，培育圖示轉(zhuǎn)基因細菌的外源DNA應(yīng)來自(DNA)病毒。

另外，限制酶也可以答成限制性核酸內(nèi)切酶。

答案Q)限制酶和DNA連接酶應(yīng)使用兩種限制酶同時切割載體和外源DNA

(2)(DNA)病毒Ca2+

(3)模板、原料、酶和能量等

(4)標(biāo)記原細菌不具有青霉素和四環(huán)素的抗性基因，外源DNA插入到載體的青霉素

抗性基因內(nèi)部

課后?加強訓(xùn)練

（時間：15分鐘）

1.（2016?全國卷I,40）某一質(zhì)粒載體如圖所示，外源DNA插入到Ampr或Tet「中會

導(dǎo)致相應(yīng)的基因失活（Ampr表示氨茉青霉素抗性基因，Tet「表示四環(huán)素抗性基因）。有人將

此質(zhì)粒載體用BamHI酶切后,與用8a6HI酶切獲得的目的基因混合，加入DNA連接

酶進行連接反應(yīng)，用得到的混合物直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌，結(jié)果大腸桿菌有的未被轉(zhuǎn)化，有的

被轉(zhuǎn)化。被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌有三種，分別是含有環(huán)狀目的基因、含有質(zhì)粒載體、含有插入

了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌?；卮鹣铝袉栴}：

啟動于

⑴質(zhì)粒載體作為基因工程的工具，應(yīng)具備的基本條件有

（答出兩點即可）,而作為基因表達載體，除滿足上述基本條件外，還需具有啟動子和

終止子。

（2）如果用含有氨萃青霉素的培養(yǎng)基進行篩選，在上述四種大腸桿菌細胞中，未被轉(zhuǎn)化

的和僅含環(huán)狀目的基因的細胞是不能區(qū)分的，其原因是

并且和的細胞也是不能區(qū)分的，其原因是

在上述篩選的基礎(chǔ)上，若要篩選含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌的單菌落,

還需使用含有的固體培養(yǎng)基。

（3）基因工程中，某些噬菌體經(jīng)改造后可以作為載體，其DNA復(fù)制所需的原料來自于

解析（1）作為運載體必須具備如下特點：①能自主復(fù)制，從而在受體細胞中穩(wěn)定保存；

②含標(biāo)記基因，以供重組DNA的鑒定和篩選；③具一個至多個限制酶切割位點以便外源

DNA插入。（2）在含有氨莘青霉素的培養(yǎng)基上,只有具有Ampr的大腸桿菌才能夠生長。

而Ampr位于質(zhì)粒上，故未被轉(zhuǎn)化的和僅含環(huán)狀目的基因的大腸桿菌細胞中無Ampr,不

能在培養(yǎng)基中生長，而僅含有質(zhì)粒載體的和含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌均

具有Ampr因而能在培養(yǎng)基中生長。目的基因的插入破壞了質(zhì)粒載體的TeV,故含有插入

了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌不能在含有四環(huán)素的平板上生長，從而與僅含有質(zhì)粒載

體的大腸桿菌得以區(qū)分。（3）噬菌體是病毒，無細胞結(jié)構(gòu)，無法自主合成DNA,需借助宿

主細胞完成DNA復(fù)制。

答案Q）能自我復(fù)制、具有標(biāo)記基因

（2）二者均不含有氨節(jié)青霉素抗性基因，在該培養(yǎng)基上均不生長含有質(zhì)粒載體含有

插入了目的基因的重組質(zhì)粒（或答含有重組質(zhì)粒）二者均含有氨芋青霉素抗性基因，在該

培養(yǎng)基上均能生長四環(huán)素

（3）受體細胞

2.（2019?湖北武漢市調(diào)研）人類是乙型肝炎病毒的唯一宿主，現(xiàn)有的肝硬化、肝癌多從

乙肝發(fā)展而來，接種乙肝疫苗是預(yù)防乙肝病毒感染的最有效方法。乙肝疫苗的研制先后經(jīng)

歷了血源性疫苗和基因工程疫苗階段。血源性乙肝疫苗是取用乙肝病毒感染者的血液，用

高速離心法提純血液中的乙肝病毒，之后再將其滅活，制成乙肝疫苗，具有一定的感染風(fēng)

險。如圖所示為乙肝基因工程疫苗的生產(chǎn)和使用過程（注：質(zhì)粒中后cZ基因可使細菌利用

培養(yǎng)基中的物質(zhì)X-gal,從而使菌落呈藍色，若無該基因，則菌落呈白色）。請回答下列

問題：

BtimHI

青毒素

基因|導(dǎo)入,廝桿菌日|乙肝病即外殼|

抗性基因/"'Z

粒|I注射?按種

BamHI目的BamHI/?l

匚您“I/

IH加抗體I

EroRVEcoRI

（1）過程①最好選用的限制酶方案可以是,

A.&TJRV和6a/77HIB.Ba/nHI和&'oRI

C.FcoRV和EcoRID.只用88mHI

⑵由圖中過程③可知，該目的基因的具體功能是

⑶若要迅速獲取大量的目的基因，以提高重組質(zhì)粒產(chǎn)生的效率，常用的技術(shù)是

（寫中文全稱）。圖中過程②常需要用處理，使大腸桿菌細胞轉(zhuǎn)化為感受態(tài)細胞。

（4）為了篩選、獲取含重組質(zhì)粒的大腸桿菌，需在培養(yǎng)大腸桿菌的通用培養(yǎng)基中額外加

入,培養(yǎng)一段時間挑選出呈（填"藍色"或"白色"）的菌落進一步

培養(yǎng)獲得大量目的菌。

（5）用基因工程疫苗接種比血源性疫苗更安全，試從疫苗的結(jié)構(gòu)特點解釋原因

解析Q）分析題意可知，切割目的基因和運載體應(yīng)用相同的限制酶，所用限制酶要保

證目的基因的完整性，并且把目的基因插入質(zhì)粒中，故選用BamHI和EcoRI（用一種限

制酶切割時，目的基因和運載體可能會發(fā)生自身環(huán)化或隨意連接）。（2）從過程③可知，目的

基因在大腸桿菌體內(nèi)可表達出乙肝病毒外殼，故該目的基因的功能是指導(dǎo)乙肝病毒外殼蛋

白的合成。（3）獲取大量目的基因通常采用PCR技術(shù)擴增，即多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。將目的基

因?qū)氪竽c桿菌細胞的方法通常是用Ca2+處理細胞，使其變成易于接受外源DNA的感受

態(tài)細胞。（4）篩選含重組質(zhì)粒的大腸桿菌，可在培養(yǎng)大腸桿菌的通用培養(yǎng)基中加入青霉素和

X-gal,青霉素可以篩選出轉(zhuǎn)入了含目的基因的重組質(zhì)粒和正常質(zhì)粒的大腸桿菌，由于重

組質(zhì)粒中/acZ基因被破壞，而后叱基因可使細菌利用培養(yǎng)基中的物質(zhì)X-gal,使菌落呈

藍色，若無該基因，菌落呈白色，故挑選出白色菌落即可。（5）研制血源性疫苗需滅活破壞

乙肝病毒的核酸結(jié)構(gòu)，有可能由于意外因素導(dǎo)致其沒有被滅活，導(dǎo)致乙肝病毒在宿主細胞

內(nèi)大量增殖，從而使接種者患病，而基因工程疫苗不含核酸，其中起作用的是蛋白質(zhì)，不

會引發(fā)病毒增殖和感染。

答案Q)B(2)指導(dǎo)合成乙肝病毒外殼蛋白(3)多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)Ca2+(4)青霉素

和X-gal白色(5)研制血源性疫苗需滅活破壞乙肝病毒的核酸結(jié)構(gòu)，滅活不成功則會導(dǎo)

致接種者患病，而基因工程疫苗不含核酸，其中起作用的是蛋白質(zhì)，不會引發(fā)病毒增殖和

感染

3.(2018?河南名校一聯(lián))胰島素是治療糖尿病的重要藥物?，F(xiàn)利用基因工不毀術(shù)讓大腸

桿菌生產(chǎn)人胰島素，下圖為大腸桿菌質(zhì)粒，請據(jù)圖作答：

補充說明：〃/力加、8amHI、&oRI是限制酶切位點和廣、az*是抗生素抗性

基因

Q)獲取目的基因時，應(yīng)從人的