T-LNSI 007-2024 人羊膜間充質(zhì)干細胞庫

ICS11.020CCSC05I 2規(guī)范性引用文件 3術語和定義 4縮略詞 5建設要求 6管理要求 7通則 8技術要求 9數(shù)據(jù)管理 10檢驗方法 11檢驗規(guī)則 12使用說明 14包裝、儲存及運輸 15不合格產(chǎn)品的處理 T/LNSI007-2024本文件按照GB/T1.1-2020《標準化工作導則第1部分：標準化的文件結構和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件由沈陽艾米奧生物工程技術研發(fā)中心有限公司、沈陽市再生生物醫(yī)學重點實驗室提出。本文件由遼寧省免疫學會歸口。本文件起草單位：沈陽艾米奧生物工程技術研發(fā)中心有限公司、中國醫(yī)科大學干細胞與再生醫(yī)學研究室、沈陽市再生生物醫(yī)學重點實驗室、沈陽市干細胞與再生醫(yī)學重點實驗室、遼寧艾米奧干細胞與再生醫(yī)學研究院、遼寧省細胞生物學學會、遼寧省生物技術協(xié)會、沈陽市干細胞與再生醫(yī)學產(chǎn)業(yè)技術創(chuàng)新聯(lián)盟、沈陽藥科大學、中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院、中國醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院、中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院、艾米奧國際干細胞醫(yī)院。本文件主要起草人：龐希寧、龐然、施萍、單風平、王莉莎、赫甡、宋揚、徐東芬、荊晶、姜雯宇、高航、謝光麟、邵錫柱、王竟、孟濤、蘇航、張美玲、聶宏光、郎宏鑫、劉曉玉、王喜良、張濤、趙峰、張殿寶、王瑞、李彩虹、李宏圖、潘長偉、孔娟、王哲、王蔚、殷軍、郭然、張寧、李曉航、王嬌。本標準的制訂基于相關技術的綜合考慮，旨在推動行業(yè)的發(fā)展和規(guī)范化。在編寫過程中，團體成員充分研究了現(xiàn)有技術和專利信息，并積極尋求相關權益方的支持和參與。特此聲明，在編寫本標準期間，我們已經(jīng)采取了合理的努力來促進并保護涉及的知識產(chǎn)權。鑒于技術的不斷創(chuàng)新和發(fā)展，如果其他相關專利或權益未在本標準中明確聲明，請權益人及時聯(lián)系標準制定團體，以便進行進一步的溝通和許可。本標準中使用的專利聲明如下：[CN2013100323661]：[沈陽艾米奧生物工程技術研發(fā)中心有限公司]，[CN]，[人羊膜間充質(zhì)干細胞庫的構建方法]。以上聲明是為了更好地保護知識產(chǎn)權，遵循了國家相關法律法規(guī)和知識產(chǎn)權的規(guī)定。我們鼓勵所有使用本標準的相關方與專利權人合作，以確保公平的利益分配和技術發(fā)展。1T/LNSI007-2024人羊膜間充質(zhì)干細胞庫本文件規(guī)定了人羊膜間充質(zhì)干細胞庫的構建過程，其中包括制備、凍存、復蘇等的規(guī)范性操作和推薦方法。本文件適用于醫(yī)療機構等構建人羊膜間充質(zhì)干細胞儲備庫。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構成文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件。不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。T/CSCB0009-2022《人干細胞研究倫理審查技術規(guī)范》GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB/T5458液氮生物容器GB50457醫(yī)藥工業(yè)潔凈廠房設計標準WS213丙型肝炎診斷WS279梅毒診斷WS293-2019《艾滋病和艾滋病病毒感染診斷標準》干細胞制劑質(zhì)量控制及臨床前研究指導原則（試行）中華人民共和國藥典（2020年版）全國臨床檢驗操作規(guī)程3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。3.1羊膜amnioticmembrane2T/LNSI007-2024子宮內(nèi)包被胎兒的一層薄膜。胎膜的最內(nèi)層，是人體最厚的一層基底膜。3.2人羊膜間充質(zhì)干細胞humanamnioticmesenchymalstemcells一類來源于人羊膜間充質(zhì)，貼壁培養(yǎng)后呈成纖維細胞樣形態(tài)（紡錘形和梭形）、可在體外自我更新并具有成骨、成脂、成軟骨等分化能力的間充質(zhì)干細胞。3.3人羊膜間充質(zhì)干細胞庫humanamnioticmesenchymalstemcellbank用于儲存人羊膜間充質(zhì)干細胞的專門機構。3.4凍存的細胞cryopreservedcells性而進行長期儲存的細胞。3.5非凍存的細胞non-cryopreservedcells是指未經(jīng)過深低溫冷凍儲存的活細胞。4縮略語下列縮略適用于本文件。CD——分化簇（ClusterofDifferentiation）DNA——脫氧核糖核酸（DeoxyribonucleicAcid）EBV——皰疹病毒（Epstein-BarVirus）HBV——乙型肝炎病毒（HepatitisBVirus）HCMV——人巨細胞病毒（HumanCytomegalovirus）HCV——丙型肝炎病毒（HepatitisCVirus）HIV——人類免疫缺陷病毒（HumanImmunodeficiencyVirus）HLA-DR——人類白細胞抗原-DR（HumanLeukocyteAntigen-DR）HTLV——人類嗜T細胞病毒（HumanT-lymphotropicVirus）IDO——吲哚胺2,3-雙加氧酶（Indoleamine2,3-dioxygenase）IFN-γ——干擾素-γ（Interferon-γ)TNF-α——腫瘤壞死因子-α（TumorNecrosisFactor-α)PCR——聚合酶鏈式反應（PolymeraseChainReaction）STR——短串聯(lián)重復序列（ShortTandemRepeat）3T/LNSI007-2024TP——梅毒螺旋體（TreponemaPallidum）5建設要求5.1總體原則范》的要求。5.2機構設置5.2.1人羊膜間充質(zhì)干細胞庫或其所屬機構應是依法成立并能夠承擔相應法律責任的法人或其他組5.2.2人羊膜間充質(zhì)干細胞庫應遵循《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》的要求，設置與質(zhì)量管理、技術運作相匹配的職能部門。5.2.3人羊膜間充質(zhì)干細胞庫應建立統(tǒng)一領導、分級管理、職責明確的管理機構，并有明確的組織架構圖。5.2.4人羊膜間充質(zhì)干細胞庫管理機構應有相匹配的人員配置，關鍵人員應至少包括最高管理者、醫(yī)學負責人、技術負責人、質(zhì)量負責人等。5.2.5人羊膜間充質(zhì)干細胞庫關鍵人員職責及能力要求應符合《干細胞制劑質(zhì)量控制及臨床前研究指導原則（試行）》的相關要求6管理要求6.1設備管理6.1.1設備采購及驗收6.1.1.1設備采購前應完成性能需求、用途及設備供應商的調(diào)研，保證設備符合預期細胞制備及檢測要求。6.1.1.2設備采購應簽訂采購合同。6.1.1.3儀器設備在安裝驗收合格后，應配置唯一識別碼，安裝調(diào)試記錄納入設備確認文件中。6.1.2設備計量4T/LNSI007-20246.1.2.1具有測量功能的設備應在檢定/校準合格后方可投入使用。6.1.2.2設備檢定/校準應由有資質(zhì)的計量單位執(zhí)行，所有檢定/校準的結果和數(shù)據(jù)須經(jīng)設備使用部門確認。6.1.2.3設備經(jīng)修理、更新升級或搬運后，應對其性能是否滿足使用要求進行重新確認。6.1.3設備使用6.1.3.1設備現(xiàn)場應配有操作規(guī)程。6.1.3.2設備應有明確的狀態(tài)標識。6.1.3.3設備使用人員應及時填寫使用記錄。6.1.4設備維護維修6.1.4.1儀器設備均應按照維護規(guī)程進行維護保養(yǎng)，并予以記錄。6.1.4.2應建立完善的儀器設備維修程序，內(nèi)部維修人員應經(jīng)廠家工程師培訓考核后方可執(zhí)行維修工作，委外維修應保留維修記錄。6.1.5儲存設備管理6.1.5.1人羊膜間充質(zhì)干細胞庫的液氮安全應符合GB/T5458的規(guī)定。6.1.5.2應定期檢查液氮容量，并建立相應的檢查登記制度。6.1.5.3工作人員在操作中接觸到液氮時，需使用防護面罩和防凍手套，并做好其它防凍措施。6.2物料管理6.2.1采購6.2.1.1應建立完善的供應商篩選、登記、考察、年度資格評審程序。新增或變更物料供應商應進行質(zhì)量審計或評估，并對新物料開展試驗驗證，確認符合細胞產(chǎn)品工藝要求。6.2.1.2應按照《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》的相關要求審查生產(chǎn)商、經(jīng)銷商提供的資質(zhì)說明及證明材料。6.2.2驗收應制定物料質(zhì)量標準，建立物料接收、檢驗、放行程序。檢驗合格的物料方可放行入庫；檢驗不合格的物料，應將信息及時反饋至供應商，在未換貨之前應放置在指定區(qū)域并加以標識。5T/LNSI007-20246.2.3庫存管理應配置與產(chǎn)能相匹配的物料存放區(qū)，關鍵物料（包括采集運輸容器、制備、凍存、檢測等所用物料）應按廠家說明書和具體的技術要求進行儲存。應對未經(jīng)檢驗或臨時緊急采購的物料進行單獨管控。6.2.4使用6.2.4.1物料應嚴格按照其說明書進行使用，不得超范圍使用。6.2.4.2物料使用過程中應及時填寫記錄，確保其可追溯性。6.3環(huán)境控制6.3.1潔凈區(qū)凈化環(huán)境檢測應采用第三方檢測和自檢相結合的方式進行，第三方檢測應由具有資質(zhì)的省級以上專業(yè)機構進行。6.3.2第三方檢測項目應符合GB50457的要求。檢測周期不得低于兩年一次。6.3.3自檢項目應符合GB50457的要求。6.4記錄控制6.4.1應建立和保持記錄管理程序，對記錄的標識、存放、檢索、保留和處置加以規(guī)范。6.4.2記錄內(nèi)容應覆蓋整個管理體系，包括質(zhì)量記錄、技術記錄，每項記錄信息應充分。6.4.3所有記錄的存放條件應有安全保護措施，對電子儲存的記錄也應采取與書面記錄同等措施以防止未經(jīng)授權的侵入或修改，電子記錄應加以備份。6.5文件管理6.5.1應建立控制干細胞庫管理體系的內(nèi)部和外部文件的程序。6.5.2應依據(jù)制定的文件管理程序，對文件的編制、審核、批準、發(fā)布、標識、變更、和廢止等各個環(huán)節(jié)實施控制。6.6.3保密文件應按保密制度嚴格管控，不得隨意借閱、復印。6.7.4應對文件時效性進行定期檢查，防止使用無效或作廢文件。7通則7.1方案制定人羊膜間充質(zhì)細胞庫研究項目啟動前應當制訂工作方案。工作方案的內(nèi)容包括但不限于：目標與任6T/LNSI007-2024務、操作流程、工作條件、生物安全等級、操作人員資質(zhì)、供體選擇要求、人羊膜間充質(zhì)干細胞質(zhì)量控制標準、參考文獻等。7.2知情同意人羊膜組織的獲取，在充分尊重、告知人體組織提供者權益的前提下簽署知情同意書，告知內(nèi)容包括但不限于：組織的處置方案及可能涉及的應用場景。宜對組織提供者的個人信息進行隱私保護，嚴禁泄露可識別供體及親屬身份的信息，如：姓名、肖像、證件、社會關系等。7.3隱私保護應當對樣本提供者的個人信息采取保密措施。8技術要求8.1原材料和輔料8.1.1應符合T/CSCB0009-2022要求。8.1.2應建立供者細胞采集的供者評估與篩選標準、采集方法、運輸標準和交接標準，保證供者和細胞的安全。8.1.3供體應篩查HIV、HBV、HCV、HTLV、EBV、HCMV和TP，并記錄結果。8.2采集與培養(yǎng)方法8.2.1樣本采集8.2.1.1人羊膜組織樣本采集應由專業(yè)的醫(yī)護人員完成。8.2.1.2羊膜的采集場所應達到Ⅲ級潔凈手術室要求。8.2.2樣本運輸8.2.2.1樣本運輸人員應是經(jīng)過培訓合格的專門人員。8.2.2.2羊膜樣本的運輸溫度為2℃~8℃,樣本離體時間不宜超過24h。8.2.2.3樣本運輸過程應受控并建立記錄檔案。8.2.3樣本接收8.2.3.1接收樣本時應先檢查容器外觀有無破損，并記錄。7T/LNSI007-20248.2.3.2檢查《樣本采集信息記錄表》的信息是否齊全，確認無誤后對樣本進行唯一性標識。8.2.3.3用75%的醫(yī)用酒精對容器外表面進行消毒，依據(jù)樣本接收標準，對檢測達標后的樣本進行接收；檢測不達標的樣本拒收后進行銷毀，并做好相應記錄。8.2.4分離及提取人羊膜組織樣本剪至片狀，用胰酶消化法去除羊膜上皮細胞。然后將人羊膜組織剪碎，用膠原酶消化法分離人羊膜間充質(zhì)干細胞。進行人羊膜間充質(zhì)干細胞原代培養(yǎng)。8.2.5人羊膜間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)根據(jù)細胞的生長情況換液和傳代。8.2.6人羊膜間充質(zhì)干細胞凍存凍存細胞程序降溫后置液氮中保存。8.2.7人羊膜間充質(zhì)干細胞復蘇取出凍存管進行快速融化、離心洗滌后進行培養(yǎng)。8.2.8人羊膜間充質(zhì)干細胞溶液人羊膜間充質(zhì)干細胞溶液應為均質(zhì)狀態(tài)，無絮狀沉淀，細胞存活率≥90％。8.3關鍵質(zhì)量屬性8.3.1細胞形態(tài)細胞貼壁培養(yǎng)時呈紡錘形和梭形的成纖維細胞態(tài)，形態(tài)均一。8.3.2染色體核型正常核型應為46,XX或46,XY。8.3.3細胞存活率未凍存細胞存活率≥90%且凍存復蘇后細胞存活率≥70%。8.3.4細胞標志蛋白CD105、CD73、CD90陽性率均≥95%；CD11b、CD19、CD31、CD34、CD45、HLA-DR陽性率8T/LNSI007-2024≤2%。8.3.5免疫調(diào)節(jié)經(jīng)炎癥因子（IFN-γ或者IFN-γ聯(lián)合TNF-α)誘導后表達吲哚胺2,3-雙加氧酶（IDO）。與T淋巴細胞共培養(yǎng)能抑制T淋巴細胞增殖及分泌IFN-γ、TNF-α。8.3.6三系分化具有成骨、成脂和成軟骨的分化潛能。8.3.7成瘤性免疫缺陷動物（如小鼠）體內(nèi)成瘤試驗結果為陰性。8.3.8微生物真菌、細菌、支原體、HIV、HBV、HCV、HTLV、EBV、HCMV、TP為陰性。8.4過程控制8.4.1擴增、凍存、復蘇等過程控制應符合T/CSCB0009-2022要求。8.4.2細胞STR檢測結果應與供體細胞保持一致。9數(shù)據(jù)管理9.1數(shù)據(jù)采集將凍存后的人羊膜間充質(zhì)干細胞的詳細信息（包括供者姓名、年齡、住院號、新生兒性別和化驗檢查信息等）輸入電腦數(shù)據(jù)庫，建立完善的數(shù)據(jù)檔案備查詢。9.2人羊膜間充質(zhì)干細胞庫構建按人羊膜間充質(zhì)干細胞提取日期進行保存，建立可供檢索的人羊膜間充質(zhì)干細胞信息檔案，即構建出人羊膜間充質(zhì)干細胞儲備庫。9.2.1入庫9.2.1.1干細胞產(chǎn)品入庫前應有雙人復核，確認信息無誤。9.2.1.2干細胞入庫過程應記錄完整，確保信息的可追溯性。9T/LNSI007-20249.2.2深低溫儲存9.2.2.1干細胞產(chǎn)品應保存在-130℃及以下。9.2.2.2干細胞產(chǎn)品標簽及記錄應標明保存溫度及儲存效期。9.2.2.3處于儲存狀態(tài)的干細胞產(chǎn)品未經(jīng)批準不得隨意變更儲存位置和狀態(tài)。9.2.2.4干細胞產(chǎn)品的儲存應注意以下事項：——儲存區(qū)不應存放可對干細胞產(chǎn)品產(chǎn)生不良影響的物料及試劑；——對于浸沒在液氮中的干細胞產(chǎn)品應采用避免發(fā)生交叉污染的措施——干細胞產(chǎn)品應確保其標識清晰易認。9.2.2.5應制定凍存的干細胞產(chǎn)品穩(wěn)定性考察計劃，定期對儲存系統(tǒng)穩(wěn)定性及干細胞產(chǎn)品活性進行監(jiān)測。9.2.3出庫9.2.3.1應建立干細胞產(chǎn)品出庫相關制度。9.2.3.2干細胞產(chǎn)品應經(jīng)質(zhì)量評價及負責人審核確認后方可出庫。9.2.4非凍存的干細胞產(chǎn)品9.2.4.1確認根據(jù)客戶要求制備的干細胞產(chǎn)品，應經(jīng)客戶及相關負責人確認。9.2.4.2發(fā)放9.2.4.3干細胞產(chǎn)品應經(jīng)過質(zhì)量評價，產(chǎn)品合格并經(jīng)負責人審核確認后發(fā)放。9.2.4.4發(fā)放時應有雙人復核細胞產(chǎn)品及發(fā)放信息，并確保細胞產(chǎn)品包裝容器的完整性。10檢驗方法10.1細胞形態(tài)二維培養(yǎng)條件下，用明視場細胞顯微鏡×40倍進行觀察。10.2染色體核型按照《中華人民共和國藥典（2020年版）》中“生物制品生產(chǎn)檢定用動物細胞基質(zhì)制備及檢定規(guī)程”項檢驗。T/LNSI007-202410.3細胞存活率按照附錄A的方法檢驗。10.4細胞表面標志物按照附錄B的方法檢驗。10.5免疫調(diào)節(jié)10.5.1誘導IDO表達按照附錄C的方法檢驗。10.5.2抑制T淋巴細胞增殖按照附錄D的方法檢驗。10.5.3抑制T淋巴細胞分泌IFN-γ、TNF-α按照附錄E的方法檢驗。10.6三系分化10.6.1成骨分化按照附錄F的方法檢驗。10.6.2成脂分化按照附錄G的方法檢驗。10.6.3成軟骨分化按照附錄H的方法檢驗。10.7成瘤性按照附錄I的方法檢驗。10.8微生物10.8.1真菌按照《中華人民共和國藥典（2020年版）》中“1101無菌檢查法”項檢測。T/LNSI007-202410.8.2細菌按照《中華人民共和國藥典（2020年版）》中“1101無菌檢查法”項檢測。10.8.3支原體按照《中華人民共和國藥典（2020年版）》中“3301無菌檢查法”項檢測。10.8.4HBV按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程（2020年版）》核酸法檢驗。10.8.5HCV按照WS213核酸法檢驗。10.8.6HIV按照WS293-2019核酸法檢驗。10.8.7HTLV按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》核酸法檢驗。10.8.8EBV按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》核酸法檢驗。10.8.9HCMV按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》核酸法檢驗。10.8.10TP按照WS273核酸法檢驗。11檢驗規(guī)則11.1抽樣方法和數(shù)量11.1.1在一個生產(chǎn)周期中，同一生產(chǎn)線、同一來源、同一代次、同一方法制備出來的產(chǎn)品為一批。11.1.2在同一批的產(chǎn)品中隨機抽取3個最小包裝單元。T/LNSI007-202411.2出廠檢驗11.2.1每批產(chǎn)品應進行出廠檢驗，并附檢驗報告。11.2.2出廠檢驗項目應包括8.3規(guī)定的所有項目。11.3復核檢驗根據(jù)需要，應由第三方專業(yè)細胞檢驗機構/實驗室進行復核檢驗，檢驗項目應包括第8章規(guī)定的所有項目。11.4判定規(guī)則11.4.1出廠檢驗項目全部符合8.3規(guī)定，判定為合格品；有1項及以上不符合本文件規(guī)定，則判為不合格品。11.4.2復核檢驗項目全部符合8.3規(guī)定，判定為合格品；有1項及以上不符合本文件規(guī)定，則判為不合格品。12使用說明應至少包括以下內(nèi)容：a）產(chǎn)品名稱；b）細胞代次；c）細胞數(shù)量；d）生產(chǎn)日期；e）生產(chǎn)批號；f）生產(chǎn)組織；g）儲存條件；h）運輸條件；i）使用方法；j）執(zhí)行標準號；k）生產(chǎn)地址；l）聯(lián)系方式；T/LNSI007-2024n）注意事項。注：根據(jù)用戶需求，可標注內(nèi)毒素含量。13標簽應至少包括以下內(nèi)容：c）細胞數(shù)量；e）生產(chǎn)組織；f）生產(chǎn)日期。14包裝、儲存及運輸14.1包裝非凍存細胞應選擇對人羊膜上皮干細胞關鍵質(zhì)量屬性無影響的袋或瓶中，應選用100毫升0.9%生理鹽水袋或瓶。14.2儲存14.2.1應符合T/CSCB0009-2022要求。14.2.2應在低于-130℃環(huán)境下儲存。14.3運輸14.3.1應符合T/CSCB0009-2022要求，應建立運輸和轉(zhuǎn)運程序，以確保干細胞產(chǎn)品運輸?shù)陌踩浴?4.3.2凍存的細胞應在干冰或低于-130℃條件下運輸，非凍存細胞建議在2℃~8℃下運輸。14.3.3用于運輸和轉(zhuǎn)運干細胞產(chǎn)品的容器，其材質(zhì)應防漏、抗震、抗壓力變化，并應對其安全性進行定期檢查。14.3.4干細胞產(chǎn)品在運輸或轉(zhuǎn)運前應制定詳細計劃，并明確以下信息：——確保運輸路徑和時間最短；——有緊急情況下可替換運輸方式的應急計劃；T/LNSI007-2024——干細胞產(chǎn)品不應通過X射線設備檢查；——能夠連續(xù)監(jiān)控轉(zhuǎn)運容器的溫度。14.3.5干細胞產(chǎn)品運輸和轉(zhuǎn)運過程應有記錄。15不合格產(chǎn)品的處理15.1.不符合質(zhì)量標準的干細胞產(chǎn)品，按照醫(yī)療廢物處理，應按照T/CSCB0009-2022中的規(guī)定處理。15.2儲存干細胞產(chǎn)品的處理應經(jīng)醫(yī)學負責人批準同意后方可執(zhí)行。15.3因干細胞產(chǎn)品不合格而導致的退貨及召回，應按照《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》執(zhí)行。T/LNSI007-2024（規(guī)范性）細胞存活率檢測細胞計數(shù)法A.1儀器和設備A.1.1明視場顯微鏡。A.1.2血球計數(shù)板。A.2試劑除特殊說明外，所用試劑均為分析純，檢測用水均為18.2MΩ去離子水。A.2.1磷酸鹽緩沖液：pH為7.4。A.2.2臺盼藍染液：使用時，用磷酸鹽緩沖液（A.2.1）稀釋至0.4%（質(zhì)量濃度）。A.3檢測步驟A.3.1細胞懸液制備收集待檢測細胞，用磷酸鹽緩沖液（A.2.1）配制細胞懸液，稀釋至合適的濃度。每個血球計數(shù)板（A.1.2）的1mm2的方格中的細胞數(shù)量應為20個~50個細胞。如果高于200個細胞，則需要進行稀釋。A.3.2細胞染色按1:1的體積比將臺盼藍染液（A.2.2）與細胞懸液（A.3.1）混合均勻。A.3.3細胞計數(shù)將蓋玻片蓋在血球計數(shù)板（A.1.2）計數(shù)槽上，取10μL混合液（A.3.2）滴在一側計數(shù)室的蓋玻片邊緣，另取10μL混合液，滴在另一側計數(shù)室的蓋玻片邊緣，使混合液充滿蓋玻片和計數(shù)板之間，靜止30s，將計數(shù)板置明視場顯微鏡（A.1.1）下對被染色的細胞和細胞總數(shù)分別進行計數(shù)。對16×25規(guī)格的計數(shù)室，按對角線位，取左上、右上、左下、右下4個1mm2的中格（即100個小格）計數(shù)。對25×16規(guī)格的計數(shù)室，按對角線位，取左上、右上、左下、右下和中央5個中格（即80個小格）計數(shù)。當遇到位于大格線上的細胞，一般只計數(shù)大方格的上方和左線上的細胞（或只計數(shù)下方和右方線上的細胞）。按步驟A.3.2~A.3.3在重復測定一個樣品。T/LNSI007-2024A.3.4細胞存活率計算A.4計算與分析細胞存活率按式（A.1）進行計算：X=（M―S）/M×100％.........................................（A.1）式中：X—細胞存活率；M—細胞總數(shù)；S—染色的細胞數(shù)。計算兩次計數(shù)細胞存活率結果的平均值，記為細胞平均存活率。A.5精密度在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不得超過算數(shù)平均值的10%。T/LNSI007-2024（規(guī)范性）細胞標志蛋白檢測流式細胞法B.1儀器和設備B.1.1流式細胞儀。B.1.2水平離心機。B.1.3電子天平。B.2試劑本方法所用試劑均為分析純，除特別說明外，實驗用水均為GB/T6682規(guī)定的一級水。B.2.1磷酸鹽緩沖液：pH7.4。B.2.2牛血清白蛋白（BSA）：純度≥98%。B.2.3疊氮鈉（NaN3）。B.2.4抗人CK19、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD31、CD34、CD45、CD49d抗體及同型對照抗體。B.2.5按照相應要求使用電子天平（B.1.3）配置流式檢測所需的液體：洗滌液、抗體稀釋液。B.3樣品保存洗滌液和標記后的樣品于2℃~8℃保存。相關抗體遵照說明書保存。B.4檢測步驟B.4.1樣品準備收集細胞，使用水平離心機（B.1.2）300g離心4min，棄上清。然后，用洗滌液清洗1次，使用水平離心機（B.1.2）300g離心4min，棄上清。B.4.2抗體孵育按照抗體說明書進行稀釋使用?？贵w孵育結束后用洗滌液清洗兩遍，使用水平離心機（B.1.2）300g離心4min，棄上清。T/LNSI007-2024B.4.3過濾上機用洗滌液重懸細胞，然后通過40μm濾網(wǎng)轉(zhuǎn)移到流式管中，按流式細胞儀（B.1.1）應用手冊上機檢測。B.4.4圈門設定原則首先根據(jù)細胞大小和顆粒度設門圈出目標細胞分群1，排除死細胞和其他雜細胞，然后根據(jù)Isotype對照組熒光強度，在分群1的基礎上畫出陽性細胞群2，排除沒有被熒光抗體標記的陰性細胞?？贵wIsotype作為陰性對照。B.5結果分析得到的檢測結果用軟件綜合分析，具體參考其軟件使用說明。T/LNSI007-2024（規(guī)范性）誘導IDO表達檢測PCR法C.1儀器和設備C.1.1核酸含量測定儀。C.1.2PCR擴增儀。C.1.3電泳儀。C.1.4凝膠成像儀。C.2試劑本方法所用試劑均為分析純，除特別說明外，實驗用水均為GB/T6682規(guī)定的一級水。C.2.1人重組IFN-γ和人重組TNF-α。C.2.2RNA提取試劑盒。C.2.3RNA逆轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒。C.2.4PCR引物。C.2.5TaqDNA聚合酶。C.2.6Ladder內(nèi)標。C.3檢測步驟C.3.1IFN-γ或IFN-γ+TNF-α處理根據(jù)附錄A方法測定，計算人羊膜間充質(zhì)干細胞懸液活細胞濃度。按細胞（1×105~4×105）個/cm2接種，在人羊膜間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)體系中添加IFN-γ（10ng/mL~30ng/mL）或IFN-γ（10ng/mL~30ng/mL）+TNF-α（10ng/mL~30ng/mL），正常培養(yǎng)12h~36h。同時設立未使用IFN-γ或IFN-γ+TNF-α處理的人羊膜間充質(zhì)干細胞為對照組，培養(yǎng)同樣時間。C.3.2人羊膜間充質(zhì)干細胞總RNA提取根據(jù)RNA提取試劑盒產(chǎn)品說明進行，并使用核酸含量測定儀（C.1.1）進行核酸含量測定。C.3.3逆轉(zhuǎn)錄PCRT/LNSI007-2024根據(jù)RNA逆轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒產(chǎn)品說明書進行，使用PCR擴增儀（C.1.2）獲得cDNA，并擴增IDO基因。C.3.4PCR產(chǎn)物電泳根據(jù)電泳應用手冊進行電泳檢測。C.3.5凝膠成像根據(jù)凝膠成像儀應用手冊，使用電泳儀（C.1.3），進行電泳檢測。C.4結果分析使用凝膠成像儀（C.1.4）進行成像，未使用IFN-γ或IFN-γ+TNF-α處理的人羊膜間充質(zhì)干細胞檢測不到IDO條帶，IFN-γ或IFN-γ+TNF-α刺激后檢測到IDO條帶。T/LNSI007-2024（規(guī)范性）抑制T細胞增殖檢測CFSE標記法D.1儀器和設備D.1.1血球計數(shù)板。D.1.2倒置顯微鏡。D.1.3水平離心機。D.1.4流式細胞儀。D.2試劑本方法所用試劑均為分析純，除特別說明外，實驗用水均為GB/T6682規(guī)定的一級水。D.2.1磷酸緩沖液：pH為7.4。D.2.2消化酶。D.2.3臺盼藍染液：使用時，用磷酸鹽緩沖液（D.2.1）稀釋至0.4%（質(zhì)量濃度）。D.2.4植物凝集素。D.2.5淋巴細胞分離液。D.2.6抗體（anti-CD3抗體）。D.2.7羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯（CFSE）染料。D.3檢測步驟D.3.1T細胞分離及染色D.3.1.1T細胞分離利用淋巴細胞分離液（D.2.5分離外周血單核細胞（PBMC用適量無菌磷酸鹽緩沖液（D.2.1）使用水平離心機（D.1.3）洗滌2次。然后孵育抗體；用適量無菌磷酸鹽緩沖液（D.2.1）使用水平離心機（D.1.3）洗滌2次。重懸細胞至濃度為5×107細胞/mL，40μm濾網(wǎng)轉(zhuǎn)移到流式管中，按流式細胞儀應用手冊上機分選。D.3.1.2T細胞染色T/LNSI007-2024根據(jù)附錄A方法測定，使用血球計數(shù)板（D.1.1）及顯微鏡（D.1.2）計算細胞懸液活細胞濃度。然后進行CFSE標記，根據(jù)CFSE產(chǎn)品說明書進行。D.3.2T細胞與人羊膜間充質(zhì)干細胞共培養(yǎng)D.3.2.1T細胞增殖根據(jù)附錄A方法測定，使用血球計數(shù)板（D.1.1）及顯微鏡（D.1.2）計算T細胞懸液活細胞濃度，按1×106細胞/mL接種培養(yǎng)，并用（2~5）μg/mL植物凝集素（D.2.4）刺激T細胞增殖，設立未用植物凝集素（D.2.4）刺激的T細胞培養(yǎng)作為對照，培養(yǎng)96h，用于檢測刺激后T細胞增殖百分比A。D.3.2.2人羊膜間充質(zhì)干細胞抑制T細胞增殖利用消化酶消化人羊膜間充質(zhì)干細胞并制備成單細胞懸液，根據(jù)附錄A方法測定，計算T細胞與人羊膜間充質(zhì)干細胞細胞懸液活細胞濃度。人羊膜間充質(zhì)干細胞按2×105細胞/mL接種，細胞貼壁后，將T細胞按5:1（T細胞：人羊膜間充質(zhì)干細胞）的比例進行共培養(yǎng)，并用（2~5）μg/mL的植物凝集素（D.2.4）刺激T細胞增殖，培養(yǎng)96h，用于檢測人羊膜間充質(zhì)干細胞抑制后T細胞增殖百分比C。D.3.3T細胞收集并檢測收集培養(yǎng)后的T細胞，用適量無菌磷酸鹽緩沖液（D.2.1）使用水平離心機（D.1.3）洗滌2次，通過40μm濾網(wǎng)轉(zhuǎn)移到流式管中，按流式細胞儀（D.1.4）應用手冊上機檢測。D.3.4圈門設定原則首先根據(jù)細胞大小和顆粒度設門圈出目標細胞分群1，排除死細胞和其他雜細胞，排除沒有被熒光抗體標記的陰性細胞。然后根據(jù)未用植物凝集素刺激的T細胞的熒光強度，在分群1的基礎上畫出CFSE母代細胞位置，根據(jù)CFSE母代細胞位置畫出自代細胞群2（即為T細胞增殖的百分比）。D.4結果分析得到的檢測結果用軟件綜合分析，具體參考其軟件使用說明。并計算人羊膜間充質(zhì)干細胞對T增殖的抑制率。抑制率按式（D.1）進行計算：Y=（A―C）/A×100％............................................（D.1）式中：T/LNSI007-2024Y—抑制率；A—單獨T細胞（刺激）CFSE子代細胞的百分比；C—與人羊膜間充質(zhì)干細胞共培養(yǎng)T細胞（刺激）CFSE子代細胞百分比。T/LNSI007-2024（規(guī)范性）抑制T細胞分泌檢測胞內(nèi)因子染色法E.1儀器和設備E.1.1血球計數(shù)板。E.1.2倒置顯微鏡。E.1.3水平離心機。E.1.4流式細胞儀。E.2試劑本方法所用試劑均為分析純，除特別說明外，實驗用水均為GB/T6682規(guī)定的一級水。E.2.1磷酸鹽緩沖液：pH為7.4。E.2.2消化酶。E.2.3臺盼藍染液：使用時，用磷酸鹽緩沖液（E.2.1）稀釋至0.4%（質(zhì)量濃度）。E.2.4佛波酯（PMA）。E.2.5淋巴細胞分離液。E.2.6抗體（如：anti-IFN-γ抗體、anti-TNF-α抗體）。E.2.7布雷非德菌素A（BFA）。E.2.8離子霉素。E.2.9皂苷（Saponin）。E.2.104%多聚甲醛。E.3檢測步驟E.3.1T細胞分離利用淋巴細胞分離液（E.2.5），分離外周血PBMC，用適量無菌磷酸鹽緩沖液（E.2.1）使用水平離心機離心（E.1.3）洗滌2次。然后，孵育抗體（E.2.6）；用適量無菌磷酸鹽緩沖液（E.2.1）使用水平離心機離心（E.1.3）洗滌2次。重懸細胞至細胞濃度為5×107細胞/mL，40μm濾網(wǎng)轉(zhuǎn)移到流式管中，按流式細胞儀應用手冊上機分選。T/LNSI007-2024E.3.2T細胞與人羊膜間充質(zhì)干細胞共培養(yǎng)E.3.2.1T細胞炎癥因子分泌根據(jù)附錄A方法測定，使用血球計數(shù)板（E.1.1）及顯微鏡（E.1.2）計算T細胞懸液濃度，按1×106細胞/mL接種培養(yǎng)，培養(yǎng)48h。結束培養(yǎng)前4h~6h往培養(yǎng)體系添加50ng/mL佛波酯（E.2.4）、1布雷非德菌素A（E.2.7）和1μg/mL離子霉素（E.2.8用于檢測IFN-γ陽性的T細胞比例A1，和TNF-α陽性的T細胞比例A2。E.3.2.2人羊膜間充質(zhì)干細胞抑制T細胞炎癥因子分泌利用消化酶消化人羊膜間充質(zhì)干細胞并制備成單細胞懸液，根據(jù)附錄A方法測定，使用血球計數(shù)板（E.1.1）及顯微鏡（E.1.2）計算T細胞與人羊膜間充質(zhì)干細胞懸液活細胞濃度，人羊膜間充質(zhì)干細胞按2×105細胞/mL接種，細胞貼壁后，將T細胞按5:1（T細胞：人羊膜間充質(zhì)干細胞）的比例進行共培養(yǎng)，培養(yǎng)48h。結束培養(yǎng)前4h~6h往培養(yǎng)體系添加50ng/mL佛波酯（E.2.4）、10μg/mL布雷非德菌素A（E.2.7）和1μg/mL離子霉素（E.2.8），用于檢測人羊膜間充質(zhì)干細胞抑制IFN-γ陽性的T細胞比例C1，和TNF-α陽性的T細胞比例C2。E.3.3T細胞收集并標記收集培養(yǎng)后的T細胞，用適量無菌磷酸鹽緩沖液（E.2.1）使用水平離心機離心（E.1.3）洗滌2次，4%多聚甲醛（E.2.10）固定細胞，用適量無菌磷酸鹽緩沖液（E.2.1）使用水平離心機離心（E.1.3）洗滌1次，0.1%~0.2%皂苷（E.2.9）處理穿膜，孵育IFN-γ和TNF-α抗體，用適量無菌磷酸鹽緩沖液（E.2.1）使用水平離心機離心（E.1.3）洗滌1次，通過40μm濾網(wǎng)轉(zhuǎn)移到流式管中，按流式細胞儀應用手冊上機檢測。E.3.4圈門設定原則首先根據(jù)細胞大小和顆粒度設門圈出目標細胞分群1，排除死細胞和其他雜細胞，然后根據(jù)Isotype組熒光強度，在分群1的基礎上畫出IFN-γ陽性的細胞群2和TNF-α陽性的細胞群3，排除沒有被熒光抗體標記的陰性細胞。E.4結果分析得到的檢測結果用軟件綜合分析，具體參考其軟件使用說明。并計算人羊膜間充質(zhì)干細胞對T細胞分泌IFN-γ、TNF-α的抑制率。T/LNSI007-2024抑制率按式（E.1）和式（E.2）進行計算：IFN-γ抑制率=（A1―C1）/A1×100％......................（E.1）式中：A1—單獨T細胞的IFN-γ陽性率；C1—與人羊膜間充質(zhì)干細胞共培養(yǎng)T細胞的IFN-γ陽性率。TNF-α抑制率=（A2―C2）/A2×100％.....................（A.1）式中：A2—單獨T細胞的TNF-α陽性率；C2—與人羊膜間充質(zhì)干細胞共培養(yǎng)T細胞的TNF-α陽性率。T/LNSI007-2024（規(guī)范性）成骨分化檢測茜素紅S染色法F.1儀器和設備F.1.1血球計數(shù)板。F.1.2明視場顯微鏡。F.1.3水平離心機。F.2試劑本方法所用試劑均為分析純，除特別說明外，實驗用水均為GB/T6682規(guī)定的一級水。F.2.1磷酸鹽緩沖液：pH為7.4。F.2.2消化酶。F.2.3臺盼藍染液：使用時，用磷酸鹽緩沖液（F.2.1）稀釋至0.4%（質(zhì)量濃度）。F.2.4成骨誘導液。F.2.5茜素紅S染色試劑盒。F.3檢測步驟F.3.1細胞樣品的準備F.3.1.1細胞消化使用水平離心機（F.1.3）離心收集細胞于離心管中，用無菌磷酸鹽緩沖液輕輕重懸細胞，避免形成氣泡或者殘留細胞團塊。F.3.1.2細胞計數(shù)根據(jù)附錄A方法測定，使用血球計數(shù)板（F.1.1）及明視場顯微鏡（F.1.2）計算細胞懸液活細胞濃度。F.3.2細胞接種并誘導細胞接種方式、密度及誘導步驟均遵循成骨誘導液產(chǎn)品說明書，誘導14d~21d。F.3.3鈣結節(jié)染色T/LNSI007-2024鈣結節(jié)染色根據(jù)茜素紅S染色試劑盒說明書進行。F.4結果分析顯微鏡下可見散在大量橘紅色的鈣結節(jié)。T/LNSI007-2024（規(guī)范性）成脂分化檢測油紅O染色法G.1儀器和設備G.1.1血球計數(shù)板。G.1.2明視場顯微鏡。G.1.3水平離心機。G.2試劑本方法所用試劑均為分析純，除特別說明外，實驗用水均為GB/T6682規(guī)定的一級水。G.2.1