題目雞傳染性支氣管炎毒株

摘要 摘要 引言 實(shí)驗(yàn)材 其 HQ毒株P(guān)10和P110N基因的克隆與序列測(cè)定分 4.11病毒RNA提 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(Reverse pGEM-TEasy載體與純化PCR產(chǎn)物的連 4.1.10HQ4.1.10HQ毒株P(guān)10與P110N基因序列測(cè)定與分析比 試驗(yàn)結(jié) HQ毒株P(guān)10和P110N基因的克隆與序列測(cè)定分 HQ毒株P(guān)10與P110N基因序列測(cè)定與分 討 結(jié) 參考文 致 序列測(cè)定分析比較，N294位、355位、634位、86012024NNHQNHQ關(guān)鍵詞：雞傳染性支氣管炎病毒HQ毒 N基Abstract：TheuseofSPFchickwillcontinuousHQstrainattenuated,tothe110AnalysisandcomparisonofsequencingNgeneonP10andP110,Ngenein294,355,634,and1202changes,andresultedina4aminoacidresiduesmutated.ThisstudyprovidestheforthecorrelationbetweenbeforeandafterHQstrainpassagedNgenechangeandstrainsofserotypesandKeywords：Avianinfectiousbronchitis(IB)；HQ Ninfectiousbronchitis，IBV）引起的雞的一種急性、高度接觸性傳染病。病毒血清型復(fù)雜，來(lái)，IB的流行呈上升趨勢(shì)，尤其是腎型、腺胃型雞傳染性支氣管炎的發(fā)生，給養(yǎng)禽業(yè)造成RNA，全長(zhǎng)27.6kb，主要結(jié)構(gòu)RNARNAIBVS1NIBV的進(jìn)化中高度保守；但近年研究發(fā)現(xiàn)，N基因也存在廣泛的變異，并且這些變異分布于抗原表位和相關(guān)功能區(qū)HQbronchitis，IB傳染病之二。由雞傳染性支氣管炎病毒（Avianinfectiousbronchitis，IBV）引起的一種急1-4周齡的雛雞[1，2]IB巨大損失[3]；IB可侵害生殖系統(tǒng)，發(fā)生輸卵管炎，導(dǎo)致輸卵管堵塞，造成產(chǎn)蛋障礙綜合征[4]。該病呈世界流行，在近年來(lái)成為了嚴(yán)重危害世界養(yǎng)禽業(yè)的傳染病之一[5-8]。IBV在國(guó)內(nèi)但雞傳染性支氣管炎病毒不會(huì)垂直傳播[9]但雞傳染性支氣管炎病毒不會(huì)垂直傳播[9]RNA和磷酸化核蛋白組成IBVC定等研究十分有效的方法。IBVNDVNDV（Spike，S（Envelope，E（S（M（EmRNA1、mRNA3mRNA5編碼。N蛋白。NmRNA6編碼，是病毒內(nèi)部核衣殼的組成部分，由是決定了病毒的復(fù)制和組裝的重要蛋白[15]。N蛋白的組成中堿性氨基酸占17.2%-19.6%，其中包括199個(gè)組氨酸、42個(gè)賴氨酸和3個(gè)精氨酸，80%IBVFigThestructureofIBVNRNA上，參BELISA2.7NIBVS1NIBV的進(jìn)化中高度保守；但近年研究發(fā)現(xiàn)，NHQ科學(xué)依據(jù)[17]科學(xué)依據(jù)[17]IBV3.1GIBCO 生工生物工程（上海）TRIzolInvitrogen公司，DNAMarkerDL2000購(gòu)自寶生物工程（大連）有?ReverseTranscriptionSystem（A5001）反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自promega公司，2×TaqMasterMix購(gòu)自天根生化科技有限公司，JM109BioTeke3.2PHSW-CJ-LCN-BIOTEKSartoriusarium631DI-3Thermo公司上海雷磁(pHS-單道移液器（0-單道移液器（0-100-PCR儀SPFSPF44.1HQP104.11RNARNA提取。Rnase-free1.5mL離心管，加入300μL混合液和400μLTRIzol，劇烈振蕩后于4℃、12000r/min離心15min。沉淀30min，之后4℃、13000rpm離心15min，棄上清。RNA沉淀溶解，立即進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，或-20℃保存?zhèn)溆谩?.1.2表1IBVS1基因、NTable.1IBVS1geneandNgeneprimer4.1.2表1IBVS1基因、NTable.1IBVS1geneandNgeneprimer目的片上游引物下游引物4.1.3（1）RNARandomRNA最高5μg/反應(yīng)Nuclease-Free10RNA與引物的混合液70℃變性5min，隨后置于冰上5GoScript?5XReactionBufferMgCl2,25mMPCRNucleotideMix,GoScript?Reverse0.5（5）cDNA530（5）cDNA53015min4.1.4PCRPCR50μLS1PCR9595557272451121032NPCR959553727245111min301035為130V、50mA、30min4.1.5PCR取50μ為130V、50mA、30min4.1.5PCR取50μLPCR產(chǎn)物于1%30s每1克瓊脂糖凝膠加1mLBindingBuffer，55℃水浴，振蕩數(shù)次直至凝膠完全溶解。300μLBindingBuffer加入離心2min2min；然后13000r/min離心2min。取5μLPCR4.1.6pGEM-TEasypGEM-TEasy載體PCR產(chǎn)物T4DNA104（1） Gal平 2 / IP 5μL加入到冰浴中的2個(gè)1.5mLJM109（－70℃凍存，冰浴5min30min，冷卻2min。，37℃150（7）1,000rpm離心10min，留取沉淀，加入50μLLB（8）LB/氨芐/IPTG/X-Gal平板上，將平板置于（7）1,000rpm離心10min，留取沉淀，加入50μLLB（8）LB/氨芐/IPTG/X-Gal平板上，將平板置于37℃生化培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)（12～16h。將長(zhǎng)有菌落的平板置于4℃中3～4h，挑選白色、單個(gè)菌落接種到5mLLB培養(yǎng)基（含氨芐青霉素50μg/mL，37℃振蕩培養(yǎng)12～16h。提取的重組質(zhì)粒在1%PCR212.5118.5下游引物S1PCR959555727251121032NPCR95955372725111min301032PCR反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠中電泳，參數(shù)設(shè)置為130V、50mA、30min4.1.10HQP10P110N4.1.10HQP10P110N挑選陽(yáng)性質(zhì)粒送至上海博尚生物科技有限公司測(cè)序，將測(cè)得的N55.1HQP10P110N5.1.1NRT-PCRcDNAWF、WRHF、HRS1基因、N1圖 Fig.2RT-PCRresultsofNM：DNAMarkerDL2000;1：HQP10N2：HQP110N DNAMarkerDL2000;1:NgeneofHQP102:NgeneofHQ5.1.2OMEGA1%2圖3NFig.3TherecombinantplasmidextractionresultsNgeneM：DNA圖3NFig.3TherecombinantplasmidextractionresultsNgeneM：DNAMarkerDL2000；1：HQP10N基因；2：HQP110N基因M:DNAMarkerDL2000;1:NgeneofHQP10;2:NgeneofHQP1105.1.3PCR3，得到約圖NPCRFig.4TheidentificationofrecombinantplasmidPCRproductsofNgeneM：DNAMarkerDL2000；1：HQP10N基因；2：HQP110NM:DNAMarkerDL2000;1:NgeneofHQP10;2:NgeneofHQ5.1.4HQP10P110NN使用DNASTARHQ毒株P(guān)10N基因由12305.1.4HQP10P110NN使用DNASTARHQ毒株P(guān)10N基因由1230個(gè)堿基組成，5，分別在NHQN基因序列推導(dǎo)出的氨基酸個(gè)數(shù)都為40971個(gè)，占17%。HQP110P10N基因推導(dǎo)氨基酸序列相比，有4個(gè)氨基酸殘基發(fā)生突變（見(jiàn)6：在NNetphos2.0ServerHQP10P110N蛋白的潛在磷酸化位點(diǎn)，可知傳N蛋白潛在磷酸化位點(diǎn)的數(shù)量和位置都沒(méi)有變化。2HQP10P110NTable.2ThepotenialphosphorylationsitesofHQP10andP110N圖HQP10ThepotentialphosphorylationsitesofHQP10N圖6HQP110圖6HQP110N ThepotentialphosphorylationsitesofHQP110N（4）NDNAMANHQP10HQP110N蛋白的疏水性，圖6N圖7HQP10P110N ThecomparisonofhydrophobicitybetweenHQP10andP110N6NIBVIBV雞HuangYNIBVIBV雞HuangYP等對(duì)臺(tái)灣三株雞胚致弱毒株（TW1171/92、2296/95、2575/98）3’端進(jìn)行測(cè)序分析比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)3NNN71202位發(fā)生改變，并導(dǎo)致有4HQN基因的改HQ毒株的毒力發(fā)生改變可能有關(guān)。SaifYM.禽病學(xué)[M].112005:108-19（20631-Johnson,R.B.etal.:AvianDis.[J],1975,19:82-BayryJ,GoudarMS,NighotPK,KshirsagarSG,LadmanBS,GelbJJr,GhalsasiGR,GN,EmergenceofanephropathogenicavianinfectiousbronchitisviruswithanonelinIndia.ClinMicrobiol,2005,43:916- S,et[8]WangHN,WuQZ,HuangY,etal.IsolationandidentificationofinfectionsvirusfromchickensinSichuan,China[J].AvianDIS,1997,41:279-[9]王玉東，王永玲，張子春，等.雞腺胃型支氣管炎病毒的分離和鑒定[J].中國(guó)動(dòng)物檢疫，[10]SaifYM.禽病學(xué)[M].112005:108-[10]SaifYM.禽病學(xué)[M].112005:108-，2002,28618-宋顯章,韓青松，涂宜強(qiáng),等.雞傳染性支氣管炎病毒分子生物學(xué)研究進(jìn)展[J].畜牧與飼料科[17]N[J].2007,29：在本論文是在吳寶成老師的悉心指導(dǎo)下，進(jìn)行試驗(yàn)和撰寫(xiě)完成的。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，我學(xué)到了許多的新知識(shí)和科學(xué)的實(shí)驗(yàn)方法，更體會(huì)到了默默奮斗在一線廣大科研人員的努力和辛勞及偉大。在這里，我要把最誠(chéng)摯的謝意獻(xiàn)給吳寶成老師！衷心感謝在實(shí)驗(yàn)中吳異健老師、張紅星河吳曉萍老師的指導(dǎo)與幫助，以及研究生賽春春學(xué)長(zhǎng)，江錦繡、洪艷艷學(xué)姐等全體實(shí)驗(yàn)室成員的幫助關(guān)心與支持。同時(shí)感謝在這實(shí)驗(yàn)過(guò)程中給予我?guī)椭椭С值?/p>