驢用乳酸菌制劑生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程

1驢用乳酸菌制劑生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程本文件規(guī)定了乳酸菌相關(guān)的定義和術(shù)語(yǔ)、生產(chǎn)技術(shù)流程、發(fā)酵環(huán)境和設(shè)備要求、產(chǎn)品質(zhì)量檢測(cè)和保藏運(yùn)輸。本文件適用于驢用乳酸菌制劑的制備生產(chǎn)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB20287農(nóng)用微生物菌劑GB3095環(huán)境空氣質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)GB/T19525.2畜禽場(chǎng)環(huán)境質(zhì)量評(píng)價(jià)準(zhǔn)則GB5749生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GB13078飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)NY/T5027無(wú)公害食品畜禽飲用水水質(zhì)3定義和術(shù)語(yǔ)下列定義和術(shù)語(yǔ)適用于本標(biāo)準(zhǔn)。3.1乳酸菌（lacticacidbacteria，LAB）能夠利用且可發(fā)酵碳水化合物并產(chǎn)生大量乳酸的一類能被革蘭氏染色成紫色（陽(yáng)性）的細(xì)菌的統(tǒng)稱，在毛驢養(yǎng)殖中可作為飼料添加劑和養(yǎng)殖場(chǎng)除臭劑。注：本標(biāo)準(zhǔn)中涉及的乳酸菌主要包括馬屬動(dòng)物源的戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)、植物乳桿菌(L屎腸球菌(Enterococcusfaecium)和糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)。3.2甘油菌theGlycerinstrain由馬屬動(dòng)物（馬和驢）腸道內(nèi)容物分離純化并鑒定的單菌落，添加15%~20%的甘油，在-80℃保存的菌種。23.3一代菌種first-generationofstrain甘油菌接種至液體培養(yǎng)基玻璃三角瓶中活化，37℃12h培養(yǎng)的菌種。3.4二代菌種Second-generationofstrain玻璃三角瓶中的一代菌種接種至發(fā)酵罐中，在發(fā)酵罐中37℃富集培養(yǎng)12h的菌種。4發(fā)酵設(shè)備和環(huán)境4.1發(fā)酵設(shè)備發(fā)酵設(shè)備為不銹鋼全自動(dòng)液體或固態(tài)發(fā)酵罐，根據(jù)生產(chǎn)規(guī)模選擇發(fā)酵罐體積。4.2環(huán)境4.2.1發(fā)酵生產(chǎn)車間空氣質(zhì)量要符合GB3095中Ⅱ類標(biāo)準(zhǔn)要求。4.2.2發(fā)酵用水應(yīng)符合GB3838-2002標(biāo)準(zhǔn)中Ⅲ類地表水質(zhì)要求，其他用水應(yīng)符合該標(biāo)準(zhǔn)中Ⅳ類水質(zhì)要4.2.3發(fā)酵車間要完善消毒滅菌設(shè)備，各個(gè)操作間或發(fā)酵車間應(yīng)獨(dú)立且聯(lián)通部都設(shè)有除菌設(shè)施。4.3消毒實(shí)現(xiàn)每日或定時(shí)消毒。工作人員下班后，進(jìn)行徹底消毒。5發(fā)酵工藝流程5.1發(fā)酵工藝流程見附錄A。5.2培養(yǎng)基5.2.1復(fù)蘇培養(yǎng)基應(yīng)保證甘油菌和一代菌種能夠快速?gòu)?fù)蘇、促進(jìn)生長(zhǎng)、營(yíng)養(yǎng)豐富。5.2.2生長(zhǎng)培養(yǎng)基應(yīng)保證二代菌種大量富集生長(zhǎng)的條件下，應(yīng)與發(fā)酵培養(yǎng)基相近。5.2.3發(fā)酵培養(yǎng)基應(yīng)保證促進(jìn)生長(zhǎng)、來源廣泛、價(jià)格低廉、制備簡(jiǎn)便等特征。5.3菌種物種及純度鑒定5.3.1用于發(fā)酵生產(chǎn)的菌株應(yīng)通過了生理生化及分子鑒定，具有完善的菌株來源及安全性報(bào)告等相關(guān)信5.3.2在發(fā)酵前應(yīng)采用稀釋平板法檢測(cè)一代和二代菌株的純度及生長(zhǎng)性能，如不合格，及時(shí)純化復(fù)壯。35.3.3發(fā)酵生產(chǎn)前,需檢測(cè)種子罐中菌體的濃度，濃度達(dá)到大于或等于108CFU/mL以上，pH值小于4.0。5.4滅菌5.4.1復(fù)蘇培養(yǎng)基和生長(zhǎng)培養(yǎng)基采用全自動(dòng)高壓鍋滅菌，條件為121℃,30min，0.1MPa～0.15MPa，自然冷卻后進(jìn)行培養(yǎng)。5.4.2發(fā)酵罐的裝液量小于總體積的2/3，干粉培養(yǎng)基溶解后導(dǎo)入發(fā)酵罐中。液體發(fā)酵前，將發(fā)酵罐設(shè)備采用高壓蒸汽進(jìn)行徹底滅菌，條件為120℃~125℃,0.1MPa～0.15MPa，30min～40min,自然冷卻后進(jìn)行發(fā)酵。5.4.3固態(tài)發(fā)酵前，物料起始含水量控制在45%～55%，采用高壓蒸汽進(jìn)行徹底滅菌，條件為120℃~125℃,0.1MPa～0.15MPa，1.0h～3.0h。5.5接種甘油菌到一代菌種接種量為0.1%～0.5%，二代種子到發(fā)酵罐接種量為10%～20%。所有步驟均在無(wú)菌環(huán)境下操作，厭氧或微好氧培養(yǎng)。5.6發(fā)酵5.6.1乳酸菌的培養(yǎng)溫度應(yīng)控制在32℃~37℃。5.6.2應(yīng)在厭氧條件或微好氧條件發(fā)酵，液體可處于靜置發(fā)酵，固態(tài)發(fā)酵攪拌轉(zhuǎn)數(shù)100r/min～150r/min。5.6.3當(dāng)有效活菌數(shù)大于或等于108CFU/mL以上，且pH小于4.0，結(jié)束發(fā)酵。5.6.4發(fā)酵生長(zhǎng)周期為36h～48h。5.7保藏5.7.1液體培養(yǎng)物進(jìn)行差速離心，濃縮菌液（105m3/h），按照1:1比例加入保護(hù)劑混合，采用大型凍干機(jī)凍干后，4℃保藏?；罹鷶?shù)檢測(cè)見附錄B。保護(hù)劑配方見附錄C。凍干條件見附錄D。5.7.2固態(tài)菌劑經(jīng)干燥后無(wú)菌密封包裝，4℃保藏。6產(chǎn)品質(zhì)量檢測(cè)相關(guān)產(chǎn)品質(zhì)量檢測(cè)包括水分、pH、有效活菌數(shù)和污染率等指標(biāo)，檢驗(yàn)合格才能出廠。所有指標(biāo)均按照按GB20287執(zhí)行。7儲(chǔ)存及運(yùn)輸7.1貯存在通風(fēng)、干燥、潔凈的倉(cāng)庫(kù)。7.2運(yùn)輸時(shí)，防止極端環(huán)境影響，避免受壓或損傷，運(yùn)輸工具保持清潔。（資料性）乳酸菌生產(chǎn)技術(shù)流程圖5菌數(shù)檢測(cè)B.1濃縮前活吸取1ml菌液，準(zhǔn)確加入38℃~40℃無(wú)菌生理鹽水9ml，振蕩使其充分分散，倍比稀釋，取10-5、10-6、10-7、10-8，4個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度設(shè)3個(gè)重復(fù)。取10-7，100ul涂板，培養(yǎng)，菌落計(jì)數(shù)。B.2凍干后菌數(shù)檢測(cè)完全凍干后收集干粉稱重，稱取5g樣品，準(zhǔn)確加入38℃~40℃無(wú)菌生理鹽水10mL，振蕩使其充分分散，倍比稀釋，取10-5、10-6、10-7、10-8，4個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度設(shè)3個(gè)重復(fù)。10-8取100ul涂板，培養(yǎng)，菌落計(jì)數(shù)。凍干劑配方表C.1凍干劑配方物料名稱百分比脫脂乳5%（1mL純化水放0.05g）蔗糖9%（1mL純化水放0.09g）凍干條件表D.1凍干條件產(chǎn)品類別參數(shù)預(yù)凍時(shí)間（分）溫度(℃)-36冷阱