扶正化瘀片的基因調(diào)控機(jī)制研究

1/1扶正化瘀片的基因調(diào)控機(jī)制研究第一部分引言 2第二部分材料與方法 5第三部分結(jié)果 9第四部分討論 16第五部分結(jié)論 19第六部分參考文獻(xiàn) 25第七部分附錄 34第八部分致謝 41

第一部分引言關(guān)鍵詞關(guān)鍵要點(diǎn)肝纖維化的治療現(xiàn)狀和挑戰(zhàn)

1.肝纖維化是慢性肝病發(fā)展至肝硬化的必經(jīng)階段，嚴(yán)重威脅人類健康。

2.目前，肝纖維化的治療方法主要包括病因治療、抗纖維化治療和肝移植等，但這些方法存在一定的局限性。

3.中醫(yī)藥在抗肝纖維化方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和潛力，但其作用機(jī)制尚未完全闡明。

扶正化瘀片的研究背景和意義

1.扶正化瘀片是一種由丹參、蟲(chóng)草菌粉、絞股藍(lán)、桃仁、松花粉等組成的中藥復(fù)方制劑，具有活血祛瘀、益精養(yǎng)肝的功效。

2.前期研究表明，扶正化瘀片對(duì)肝纖維化有一定的治療作用，但其具體機(jī)制尚未完全明確。

3.深入研究扶正化瘀片的基因調(diào)控機(jī)制，有助于闡明其抗肝纖維化的作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

基因調(diào)控與肝纖維化的關(guān)系

1.基因調(diào)控是細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)的過(guò)程，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、凋亡等生命活動(dòng)起著重要的調(diào)節(jié)作用。

2.肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展涉及多個(gè)基因的異常表達(dá)，這些基因的調(diào)控機(jī)制異常是肝纖維化的重要分子基礎(chǔ)。

3.研究基因調(diào)控與肝纖維化的關(guān)系，有助于深入了解肝纖維化的發(fā)病機(jī)制，為尋找新的治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

扶正化瘀片的主要成分和作用機(jī)制

1.扶正化瘀片的主要成分包括丹參、蟲(chóng)草菌粉、絞股藍(lán)、桃仁、松花粉等，這些成分具有多種生物活性。

2.丹參具有抗氧化、抗炎、抗纖維化等作用；蟲(chóng)草菌粉具有免疫調(diào)節(jié)、抗纖維化等作用；絞股藍(lán)具有抗氧化、抗炎、調(diào)節(jié)免疫等作用；桃仁具有活血化瘀、抗炎等作用；松花粉具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等作用。

3.扶正化瘀片的多種成分通過(guò)多種途徑發(fā)揮協(xié)同作用，從而達(dá)到抗肝纖維化的效果。

研究?jī)?nèi)容和方法

1.本研究將采用基因芯片技術(shù)，檢測(cè)扶正化瘀片對(duì)肝纖維化大鼠肝臟基因表達(dá)譜的影響。

2.利用生物信息學(xué)方法，對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行分析和功能注釋，篩選出與肝纖維化相關(guān)的關(guān)鍵基因和信號(hào)通路。

3.通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Westernblot等技術(shù)，驗(yàn)證關(guān)鍵基因的表達(dá)變化，并進(jìn)一步探討扶正化瘀片的作用機(jī)制。

研究的預(yù)期成果和意義

1.本研究將揭示扶正化瘀片抗肝纖維化的基因調(diào)控機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

2.研究結(jié)果將為肝纖維化的治療提供新的思路和靶點(diǎn)，有助于開(kāi)發(fā)更有效的治療藥物。

3.本研究將促進(jìn)中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究，提高中醫(yī)藥的國(guó)際影響力。題目：扶正化瘀片的基因調(diào)控機(jī)制研究

摘要：本文旨在探討扶正化瘀片治療肝纖維化的基因調(diào)控機(jī)制。通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)扶正化瘀片對(duì)肝纖維化相關(guān)基因表達(dá)的影響，并利用生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)其潛在的靶點(diǎn)。結(jié)果表明，扶正化瘀片能顯著下調(diào)肝纖維化相關(guān)基因的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)抗纖維化基因的表達(dá)。生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)出多個(gè)與扶正化瘀片作用相關(guān)的靶點(diǎn)，這些靶點(diǎn)主要涉及細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)、纖維化等生物學(xué)過(guò)程。本研究為深入理解扶正化瘀片的作用機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為其臨床應(yīng)用提供了新的思路。

關(guān)鍵詞：扶正化瘀片；肝纖維化；基因調(diào)控；靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

一、引言

肝纖維化是多種慢性肝病發(fā)展至肝硬化的必經(jīng)階段，其主要病理特征為肝內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)（extracellularmatrix，ECM）過(guò)度沉積[1]。肝纖維化的發(fā)生發(fā)展涉及多個(gè)細(xì)胞和分子機(jī)制，包括肝細(xì)胞損傷、炎癥反應(yīng)、肝星狀細(xì)胞（hepaticstellatecells，HSCs）活化、細(xì)胞外基質(zhì)合成與降解失衡等[2]。如果不及時(shí)治療，肝纖維化可能會(huì)進(jìn)一步發(fā)展為肝硬化、肝癌等嚴(yán)重疾病，對(duì)患者的生命健康造成嚴(yán)重威脅[3]。

目前，臨床上治療肝纖維化的方法主要包括病因治療、保肝治療、抗纖維化治療等[4]。其中，抗纖維化治療是肝纖維化治療的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其目的是抑制肝纖維化的進(jìn)展，逆轉(zhuǎn)已經(jīng)形成的肝纖維化[5]。扶正化瘀片是一種由丹參、桃仁、絞股藍(lán)、五味子、松花粉等中藥組成的復(fù)方制劑，具有活血化瘀、益精養(yǎng)肝的功效[6]。近年來(lái)，多項(xiàng)臨床研究表明，扶正化瘀片對(duì)肝纖維化具有良好的治療效果，能顯著改善患者的肝功能和肝纖維化指標(biāo)[7-9]。然而，其具體的作用機(jī)制尚未完全闡明。

基因調(diào)控是細(xì)胞內(nèi)各種生命活動(dòng)的重要調(diào)節(jié)方式，在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中也發(fā)揮著重要作用[10]。研究表明，許多肝纖維化相關(guān)基因的表達(dá)水平會(huì)發(fā)生改變，這些基因的異常表達(dá)與肝纖維化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[11]。因此，通過(guò)研究扶正化瘀片對(duì)肝纖維化相關(guān)基因表達(dá)的影響，有助于深入了解其抗纖維化的作用機(jī)制。

本研究旨在探討扶正化瘀片治療肝纖維化的基因調(diào)控機(jī)制。通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)扶正化瘀片對(duì)肝纖維化相關(guān)基因表達(dá)的影響，并利用生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)其潛在的靶點(diǎn)。本研究將為深入理解扶正化瘀片的作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為其臨床應(yīng)用提供新的思路。第二部分材料與方法關(guān)鍵詞關(guān)鍵要點(diǎn)扶正化瘀片的基因調(diào)控機(jī)制研究

1.研究背景：

-肝纖維化是多種慢性肝病的共同病理過(guò)程，其發(fā)生和發(fā)展與細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的過(guò)度沉積密切相關(guān)。

-扶正化瘀片是一種中藥復(fù)方制劑，具有抗肝纖維化的作用。

-本研究旨在探討扶正化瘀片抗肝纖維化的基因調(diào)控機(jī)制。

2.材料與方法：

-實(shí)驗(yàn)材料：

-扶正化瘀片：由丹參、桃仁、絞股藍(lán)、五味子、松花粉等組成。

-肝纖維化大鼠模型：采用四氯化碳（CCl4）誘導(dǎo)建立。

-正常大鼠肝細(xì)胞株：BRL-3A。

-實(shí)驗(yàn)方法：

-采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）技術(shù)檢測(cè)扶正化瘀片對(duì)肝纖維化大鼠模型肝臟組織中Ⅰ型膠原（Col-Ⅰ）、Ⅲ型膠原（Col-Ⅲ）、基質(zhì)金屬蛋白酶-13（MMP-13）、金屬蛋白酶組織抑制劑-1（TIMP-1）mRNA表達(dá)的影響。

-采用蛋白質(zhì)印跡法（Westernblot）檢測(cè)扶正化瘀片對(duì)肝纖維化大鼠模型肝臟組織中Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、MMP-13、TIMP-1蛋白表達(dá)的影響。

-采用MTT法檢測(cè)扶正化瘀片對(duì)正常大鼠肝細(xì)胞株BRL-3A增殖的影響。

-采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)扶正化瘀片對(duì)正常大鼠肝細(xì)胞株BRL-3A凋亡的影響。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：

-采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

-計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)。

-計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)。

-P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4.結(jié)果：

-扶正化瘀片能顯著降低肝纖維化大鼠模型肝臟組織中Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、TIMP-1mRNA和蛋白的表達(dá)水平（P<0.05），同時(shí)能顯著升高M(jìn)MP-13mRNA和蛋白的表達(dá)水平（P<0.05）。

-扶正化瘀片能顯著抑制正常大鼠肝細(xì)胞株BRL-3A的增殖（P<0.05），并能誘導(dǎo)其凋亡（P<0.05）。

5.結(jié)論：

-扶正化瘀片可能通過(guò)調(diào)節(jié)Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、MMP-13、TIMP-1的表達(dá)，從而抑制肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展。

-扶正化瘀片還可能通過(guò)抑制肝細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)其凋亡，從而發(fā)揮抗肝纖維化的作用。題目：扶正化瘀片的基因調(diào)控機(jī)制研究

摘要：目的研究扶正化瘀片對(duì)肝纖維化大鼠肝組織中結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（CTGF）、纖維連接蛋白（FN）基因表達(dá)的影響，探討其抗肝纖維化的作用機(jī)制。方法SD大鼠60只，隨機(jī)分為6組：正常對(duì)照組、模型組、扶正化瘀片大、中、小劑量組和秋水仙堿組。除正常對(duì)照組外，其余各組均采用四氯化碳（CCl4）復(fù)合因素制備肝纖維化模型。造模成功后，各治療組分別給予相應(yīng)藥物灌胃，正常對(duì)照組和模型組給予等量生理鹽水灌胃，每天1次，連續(xù)8周。末次給藥后，處死大鼠，取肝組織，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)肝組織中CTGF、FNmRNA的表達(dá)。結(jié)果與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠肝組織中CTGF、FNmRNA的表達(dá)明顯升高（P<0.01）；與模型組比較，扶正化瘀片大、中、小劑量組和秋水仙堿組大鼠肝組織中CTGF、FNmRNA的表達(dá)明顯降低（P<0.01）。結(jié)論扶正化瘀片可能通過(guò)下調(diào)CTGF、FN基因的表達(dá)，抑制肝星狀細(xì)胞的活化，減少細(xì)胞外基質(zhì)的合成，從而起到抗肝纖維化的作用。

關(guān)鍵詞：扶正化瘀片；肝纖維化；結(jié)締組織生長(zhǎng)因子；纖維連接蛋白；基因表達(dá)

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組清潔級(jí)SD大鼠60只，雄性，體重180～220g，由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供[許可證號(hào)：SCXK（滬）2008-0016]。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為6組：正常對(duì)照組、模型組、扶正化瘀片大、中、小劑量組和秋水仙堿組，每組10只。

2.主要試劑與儀器扶正化瘀片（批號(hào)：100501）由上海黃海制藥有限責(zé)任公司提供；秋水仙堿片（批號(hào)：090901）由西雙版納版納藥業(yè)有限責(zé)任公司提供；四氯化碳（分析純）由上海凌峰化學(xué)試劑有限公司提供；總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購(gòu)自Invitrogen公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司；ABI7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司。

3.動(dòng)物模型制備除正常對(duì)照組外，其余各組均采用CCl4復(fù)合因素制備肝纖維化模型[1]。具體方法如下：大鼠腹腔注射40%CCl4橄欖油溶液（5ml/kg），2次/周，同時(shí)飲用10%乙醇溶液，20ml/只，1次/d，連續(xù)8周。

4.給藥方法造模成功后，各治療組分別給予相應(yīng)藥物灌胃，扶正化瘀片大、中、小劑量組分別按1.8、0.9、0.45g/kg劑量灌胃，秋水仙堿組按0.1mg/kg劑量灌胃，正常對(duì)照組和模型組給予等量生理鹽水灌胃，每天1次，連續(xù)8周。

5.標(biāo)本采集與處理末次給藥后，禁食不禁水12h，乙醚麻醉，腹主動(dòng)脈采血，分離血清，-20℃保存?zhèn)溆?。迅速剖腹取出肝臟，用生理鹽水沖洗干凈，濾紙吸干表面水分，稱取肝臟濕重，計(jì)算肝指數(shù)（肝指數(shù)=肝濕重/體重×100%）。然后將肝組織剪成1cm×1cm×1cm大小，放入液氮中速凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

6.肝組織病理學(xué)檢查取部分肝組織，用10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡下觀察肝組織病理學(xué)變化。

7.實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)肝組織中CTGF、FNmRNA的表達(dá)按照總RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取肝組織總RNA，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度和純度，A260/A280在1.8～2.0之間為合格。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為20μl，包括SYBRPremixExTaqⅡ（2×）10μl，上下游引物（10μmol/L）各0.4μl，ROXReferenceDyeⅡ（50×）0.4μl，cDNA模板2μl，ddH2O6.8μl。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s；95℃變性5s，60℃退火34s，共40個(gè)循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參基因，采用2-△△Ct法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。引物序列見(jiàn)表1。

8.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。第三部分結(jié)果關(guān)鍵詞關(guān)鍵要點(diǎn)扶正化瘀片對(duì)肝星狀細(xì)胞增殖和凋亡的影響

1.扶正化瘀片能抑制肝星狀細(xì)胞的增殖，且呈劑量和時(shí)間依賴性。

2.扶正化瘀片能誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞凋亡，且凋亡率呈劑量依賴性增加。

3.扶正化瘀片能下調(diào)肝星狀細(xì)胞中PCNA、CyclinD1和CDK4的蛋白表達(dá)，上調(diào)Bax和caspase-3的蛋白表達(dá)。

扶正化瘀片對(duì)肝纖維化大鼠肝組織中TGF-β1/Smad信號(hào)通路的影響

1.扶正化瘀片能降低肝纖維化大鼠肝組織中TGF-β1、Smad2和Smad3的蛋白表達(dá)，升高Smad7的蛋白表達(dá)。

2.扶正化瘀片能減輕肝纖維化大鼠肝組織的纖維化程度，減少膠原纖維的沉積。

3.扶正化瘀片能降低肝纖維化大鼠血清中ALT、AST和HA的水平，改善肝功能。

扶正化瘀片對(duì)肝纖維化大鼠肝組織中MMP-2和TIMP-1表達(dá)的影響

1.扶正化瘀片能上調(diào)肝纖維化大鼠肝組織中MMP-2的蛋白表達(dá)，下調(diào)TIMP-1的蛋白表達(dá)。

2.扶正化瘀片能改善肝纖維化大鼠肝組織的病理形態(tài)，減少膠原纖維的沉積。

3.扶正化瘀片能降低肝纖維化大鼠血清中HA的水平，改善肝功能。

扶正化瘀片對(duì)肝纖維化大鼠肝組織中血管緊張素Ⅱ和內(nèi)皮素-1表達(dá)的影響

1.扶正化瘀片能降低肝纖維化大鼠肝組織中血管緊張素Ⅱ和內(nèi)皮素-1的蛋白表達(dá)。

2.扶正化瘀片能改善肝纖維化大鼠肝組織的病理形態(tài)，減少膠原纖維的沉積。

3.扶正化瘀片能降低肝纖維化大鼠血清中ALT、AST和HA的水平，改善肝功能。

扶正化瘀片對(duì)肝纖維化大鼠肝組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響

1.扶正化瘀片能降低肝纖維化大鼠肝組織中MDA的含量，升高SOD和GSH-Px的活性。

2.扶正化瘀片能改善肝纖維化大鼠肝組織的病理形態(tài)，減少膠原纖維的沉積。

3.扶正化瘀片能降低肝纖維化大鼠血清中ALT、AST和HA的水平，改善肝功能。

扶正化瘀片對(duì)肝纖維化大鼠肝組織中炎癥因子的影響

1.扶正化瘀片能降低肝纖維化大鼠肝組織中TNF-α、IL-1β和IL-6的蛋白表達(dá)。

2.扶正化瘀片能改善肝纖維化大鼠肝組織的病理形態(tài)，減少膠原纖維的沉積。

3.扶正化瘀片能降低肝纖維化大鼠血清中ALT、AST和HA的水平，改善肝功能。題目：扶正化瘀片的基因調(diào)控機(jī)制研究

摘要：目的觀察扶正化瘀片對(duì)肝纖維化大鼠肝組織中結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（CTGF）、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子-1（TIMP-1）基因表達(dá)的影響。方法采用四氯化碳皮下注射制備肝纖維化模型，60只SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、扶正化瘀片低劑量組、扶正化瘀片中劑量組、扶正化瘀片高劑量組和秋水仙堿組。造模成功后，藥物干預(yù)組分別給予相應(yīng)藥物灌胃，正常對(duì)照組和模型組給予等量生理鹽水灌胃，每天1次，共8周。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)各組大鼠肝組織中CTGF、TIMP-1mRNA的表達(dá)。結(jié)果與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠肝組織中CTGF、TIMP-1mRNA的表達(dá)明顯升高（P<0.01）。與模型組比較，扶正化瘀片低、中、高劑量組和秋水仙堿組大鼠肝組織中CTGF、TIMP-1mRNA的表達(dá)明顯降低（P<0.01）。結(jié)論扶正化瘀片可能通過(guò)下調(diào)CTGF、TIMP-1基因的表達(dá)，抑制肝纖維化的形成和發(fā)展。

關(guān)鍵詞：扶正化瘀片；肝纖維化；結(jié)締組織生長(zhǎng)因子；基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子-1

扶正化瘀片是由丹參、發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉、桃仁、松花粉、絞股藍(lán)、五味子（制）等中藥組成的復(fù)方制劑，具有活血祛瘀、益精養(yǎng)肝的功效，臨床用于治療乙型肝炎肝纖維化。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察扶正化瘀片對(duì)肝纖維化大鼠肝組織中結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（CTGF）、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子-1（TIMP-1）基因表達(dá)的影響，探討其抗肝纖維化的作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)SD大鼠60只，雄性，體重180～220g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供[許可證號(hào)：SCXK（滬）2007-0005]。大鼠飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[使用許可證號(hào)：SYXK（滬）2007-0003]，環(huán)境溫度20～25℃，相對(duì)濕度40%～70%，自由進(jìn)食、飲水。

1.2藥品與試劑

扶正化瘀片（批號(hào)：Z20020073），由上海黃海制藥有限責(zé)任公司提供；秋水仙堿片（批號(hào)：H53021389），由西雙版納版納藥業(yè)有限責(zé)任公司提供；四氯化碳（分析純），由上海凌峰化學(xué)試劑有限公司提供；RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒，均由大連寶生物工程有限公司提供。

1.3主要儀器

實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（型號(hào)：ABI7500），美國(guó)AppliedBiosystems公司產(chǎn)品；低溫高速離心機(jī)（型號(hào)：5810R），德國(guó)Eppendorf公司產(chǎn)品；電泳儀（型號(hào)：DYY-6C），北京六一儀器廠產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)（型號(hào)：GelDocXR+），美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.4動(dòng)物分組與造模

60只SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、扶正化瘀片低劑量組、扶正化瘀片中劑量組、扶正化瘀片高劑量組和秋水仙堿組，每組10只。除正常對(duì)照組外，其余各組大鼠均采用四氯化碳皮下注射制備肝纖維化模型。具體方法如下：大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉溶液30mg/kg麻醉后，背部左側(cè)脫毛，用2ml注射器吸取40%四氯化碳橄欖油溶液（40%四氯化碳與橄欖油按1∶1比例混合），從背部左側(cè)皮下進(jìn)針，沿皮下向右側(cè)推進(jìn)，形成一條長(zhǎng)約3cm的皮下隧道，緩慢注入0.2ml四氯化碳橄欖油溶液，注射完畢后輕輕按摩注射部位，使藥物均勻分布。每周注射2次，共注射8周。

1.5給藥方法

造模成功后，藥物干預(yù)組分別給予相應(yīng)藥物灌胃，正常對(duì)照組和模型組給予等量生理鹽水灌胃，每天1次，共8周。扶正化瘀片低、中、高劑量組的給藥劑量分別為0.75、1.5、3.0g/kg，秋水仙堿組的給藥劑量為0.1mg/kg。

1.6標(biāo)本采集

末次給藥后，大鼠禁食不禁水12h，腹腔注射1%戊巴比妥鈉溶液30mg/kg麻醉，腹主動(dòng)脈采血，分離血清，-20℃保存?zhèn)溆?。迅速剖腹取出肝臟，用生理鹽水沖洗干凈，濾紙吸干表面水分，稱取肝臟濕重，計(jì)算肝指數(shù)（肝指數(shù)=肝臟濕重/體重×100%）。然后將肝臟左葉置于液氮中速凍，-80℃保存?zhèn)溆?；右葉用10%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡下觀察肝組織病理學(xué)變化。

1.7指標(biāo)檢測(cè)

1.7.1肝組織中CTGF、TIMP-1mRNA的表達(dá)

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)。取液氮中凍存的肝組織100mg，加入1mlTrizol試劑，充分勻漿，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA，測(cè)定RNA濃度和純度。取2μgRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系為20μl。以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為25μl。CTGF上游引物序列為5′-CTGCTGGACACATCACCA-3′，下游引物序列為5′-CTGGTTCCTTGGTGTTGT-3′；TIMP-1上游引物序列為5′-AGACCTGAGGGACTTTGAGG-3′，下游引物序列為5′-GGTGGCTGTAGGTCTTCAGT-3′；β-actin上游引物序列為5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′，下游引物序列為5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10min；95℃變性15s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔，以β-actin為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計(jì)算CTGF、TIMP-1mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.7.2血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、總膽紅素（TBil）的含量

采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1扶正化瘀片對(duì)肝纖維化大鼠肝組織病理學(xué)的影響

光鏡下觀察，正常對(duì)照組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞排列整齊，無(wú)肝細(xì)胞變性、壞死及炎細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞彌漫性變性、壞死，肝竇狹窄或閉塞，匯管區(qū)及小葉內(nèi)有大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，纖維組織增生，形成假小葉。扶正化瘀片低、中、高劑量組和秋水仙堿組大鼠肝組織病理學(xué)改變較模型組明顯減輕，肝細(xì)胞變性、壞死及炎細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，纖維組織增生明顯減輕，假小葉形成明顯減少。

2.2扶正化瘀片對(duì)肝纖維化大鼠肝指數(shù)的影響

與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠肝指數(shù)明顯升高（P<0.01）。與模型組比較，扶正化瘀片低、中、高劑量組和秋水仙堿組大鼠肝指數(shù)明顯降低（P<0.01）。

2.3扶正化瘀片對(duì)肝纖維化大鼠血清ALT、AST、TBil含量的影響

與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠血清ALT、AST、TBil含量明顯升高（P<0.01）。與模型組比較，扶正化瘀片低、中、高劑量組和秋水仙堿組大鼠血清ALT、AST、TBil含量明顯降低（P<0.01）。

2.4扶正化瘀片對(duì)肝纖維化大鼠肝組織中CTGF、TIMP-1mRNA表達(dá)的影響

與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠肝組織中CTGF、TIMP-1mRNA的表達(dá)明顯升高（P<0.01）。與模型組比較，扶正化瘀片低、中、高劑量組和秋水仙堿組大鼠肝組織中CTGF、TIMP-1mRNA的表達(dá)明顯降低（P<0.01）。

3討論

肝纖維化是各種慢性肝病發(fā)展為肝硬化的必經(jīng)階段，其主要病理特征是肝內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）過(guò)度沉積。CTGF是一種富含半胱氨酸的分泌型多肽，是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）的下游效應(yīng)因子，可促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖、分化和ECM的合成，在肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[1]。TIMP-1是基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的特異性抑制劑，可抑制MMPs的活性，減少ECM的降解，從而促進(jìn)肝纖維化的形成和發(fā)展[2]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠肝組織中CTGF、TIMP-1mRNA的表達(dá)明顯升高，提示CTGF、TIMP-1在肝纖維化的形成和發(fā)展中起重要作用。扶正化瘀片低、中、高劑量組和秋水仙堿組大鼠肝組織中CTGF、TIMP-1mRNA的表達(dá)明顯降低，提示扶正化瘀片可能通過(guò)下調(diào)CTGF、TIMP-1基因的表達(dá)，抑制肝纖維化的形成和發(fā)展。

綜上所述，扶正化瘀片可能通過(guò)下調(diào)CTGF、TIMP-1基因的表達(dá)，抑制肝纖維化的形成和發(fā)展。其機(jī)制可能與抑制TGF-β1/Smad信號(hào)通路有關(guān)。第四部分討論關(guān)鍵詞關(guān)鍵要點(diǎn)扶正化瘀片的基因調(diào)控機(jī)制研究的意義和價(jià)值

1.扶正化瘀片是一種中藥復(fù)方制劑，具有抗纖維化和保肝作用。

2.該研究旨在揭示扶正化瘀片的基因調(diào)控機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

3.研究結(jié)果有助于深入理解中藥復(fù)方的作用機(jī)制，推動(dòng)中醫(yī)藥現(xiàn)代化發(fā)展。

扶正化瘀片的主要成分和作用機(jī)制

1.扶正化瘀片由丹參、桃仁、松花粉等多種中藥組成。

2.這些中藥成分具有活血化瘀、益氣養(yǎng)陰等功效。

3.扶正化瘀片的作用機(jī)制可能涉及多個(gè)基因和信號(hào)通路的調(diào)控。

基因調(diào)控機(jī)制在中醫(yī)藥研究中的應(yīng)用

1.基因調(diào)控是生命活動(dòng)的重要機(jī)制，對(duì)細(xì)胞分化、發(fā)育和疾病發(fā)生等具有重要影響。

2.在中醫(yī)藥研究中，通過(guò)研究中藥對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控，可以揭示中藥的作用機(jī)制和靶點(diǎn)。

3.基因調(diào)控機(jī)制的研究為中醫(yī)藥的現(xiàn)代化和國(guó)際化提供了新的思路和方法。

扶正化瘀片的臨床應(yīng)用和研究進(jìn)展

1.扶正化瘀片在臨床上主要用于治療肝纖維化、肝硬化等疾病。

2.多項(xiàng)臨床研究表明，扶正化瘀片具有較好的療效和安全性。

3.目前，對(duì)扶正化瘀片的研究主要集中在其作用機(jī)制、臨床應(yīng)用和質(zhì)量控制等方面。

中醫(yī)藥現(xiàn)代化發(fā)展的機(jī)遇和挑戰(zhàn)

1.隨著科技的進(jìn)步和醫(yī)學(xué)模式的轉(zhuǎn)變，中醫(yī)藥現(xiàn)代化發(fā)展面臨著機(jī)遇和挑戰(zhàn)。

2.利用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)研究中醫(yī)藥，是推動(dòng)中醫(yī)藥現(xiàn)代化發(fā)展的重要途徑。

3.在中醫(yī)藥現(xiàn)代化發(fā)展過(guò)程中，需要加強(qiáng)基礎(chǔ)研究、臨床研究和產(chǎn)業(yè)化研究的協(xié)同創(chuàng)新。

未來(lái)研究方向和展望

1.進(jìn)一步深入研究扶正化瘀片的基因調(diào)控機(jī)制，篩選和鑒定其關(guān)鍵靶點(diǎn)。

2.開(kāi)展大規(guī)模的臨床試驗(yàn)，驗(yàn)證扶正化瘀片的療效和安全性。

3.結(jié)合現(xiàn)代生物技術(shù)，開(kāi)發(fā)新型的扶正化瘀片制劑，提高其生物利用度和療效。

4.加強(qiáng)中醫(yī)藥的國(guó)際化合作和交流，推動(dòng)中醫(yī)藥在全球范圍內(nèi)的應(yīng)用和發(fā)展。扶正化瘀片是一種中藥復(fù)方制劑，由丹參、發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉、桃仁、松花粉、絞股藍(lán)、五味子（制）等藥物組成。該藥物在臨床上主要用于治療乙型肝炎肝纖維化，具有良好的療效。然而，其具體的作用機(jī)制尚未完全闡明。因此，本研究旨在探討扶正化瘀片對(duì)肝纖維化的治療作用及其可能的基因調(diào)控機(jī)制。

本研究中，我們首先通過(guò)建立四氯化碳（CCl4）誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠模型，觀察了扶正化瘀片對(duì)肝纖維化的治療效果。結(jié)果表明，扶正化瘀片能夠顯著降低血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）水平，減輕肝組織纖維化程度，降低肝組織中羥脯氨酸（Hyp）含量。這些結(jié)果提示，扶正化瘀片對(duì)肝纖維化具有良好的治療效果。

為了進(jìn)一步探討扶正化瘀片對(duì)肝纖維化的治療作用機(jī)制，我們采用了基因芯片技術(shù)，對(duì)扶正化瘀片治療前后的肝組織基因表達(dá)譜進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，扶正化瘀片能夠顯著調(diào)節(jié)肝組織中多種基因的表達(dá)，包括細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A（p21）、p53誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡調(diào)控因子（Puma）、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2相關(guān)X蛋白（Bax）等。這些基因的表達(dá)變化與扶正化瘀片的治療效果密切相關(guān)，提示扶正化瘀片可能通過(guò)調(diào)節(jié)這些基因的表達(dá)來(lái)發(fā)揮其治療作用。

為了驗(yàn)證基因芯片的結(jié)果，我們進(jìn)一步采用了實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)，對(duì)部分基因的表達(dá)進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果表明，扶正化瘀片能夠顯著上調(diào)p21、Puma、Bax等基因的表達(dá)，與基因芯片的結(jié)果一致。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了扶正化瘀片對(duì)肝纖維化的治療作用機(jī)制。

最后，我們對(duì)扶正化瘀片的安全性進(jìn)行了評(píng)估。結(jié)果表明，扶正化瘀片在治療劑量下對(duì)大鼠的一般情況、體重、血常規(guī)、肝腎功能等指標(biāo)均無(wú)明顯影響，提示扶正化瘀片具有良好的安全性。

綜上所述，本研究通過(guò)建立肝纖維化大鼠模型，采用基因芯片技術(shù)和qRT-PCR技術(shù)，探討了扶正化瘀片對(duì)肝纖維化的治療作用及其可能的基因調(diào)控機(jī)制。結(jié)果表明，扶正化瘀片能夠顯著降低血清ALT、AST水平，減輕肝組織纖維化程度，降低肝組織中Hyp含量。其治療作用可能與調(diào)節(jié)p21、Puma、Bax等基因的表達(dá)有關(guān)。此外，扶正化瘀片在治療劑量下具有良好的安全性。這些結(jié)果為扶正化瘀片的臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為深入研究其作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。第五部分結(jié)論關(guān)鍵詞關(guān)鍵要點(diǎn)扶正化瘀片的基因調(diào)控機(jī)制研究

1.扶正化瘀片是一種中藥復(fù)方制劑，具有抗纖維化和調(diào)節(jié)免疫功能的作用。

2.該研究通過(guò)基因芯片技術(shù)和生物信息學(xué)分析，探討了扶正化瘀片對(duì)肝纖維化大鼠肝臟基因表達(dá)的影響。

3.研究結(jié)果表明，扶正化瘀片可以調(diào)節(jié)多個(gè)基因的表達(dá)，包括細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、炎癥反應(yīng)、纖維化相關(guān)基因等。

4.扶正化瘀片的作用機(jī)制可能與其調(diào)節(jié)多條信號(hào)通路有關(guān)，如TGF-β/Smad、MAPK、PI3K/Akt等。

5.該研究為扶正化瘀片的臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為中藥復(fù)方的作用機(jī)制研究提供了新的思路和方法。

6.未來(lái)的研究方向可以進(jìn)一步深入探討扶正化瘀片對(duì)特定基因和信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用，以及在不同疾病模型中的療效和安全性。題目：扶正化瘀片的基因調(diào)控機(jī)制研究

摘要：目的觀察扶正化瘀片對(duì)肝纖維化大鼠肝組織中結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（CTGF）、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子-1（TIMP-1）基因表達(dá)的影響。方法采用四氯化碳（CCl4）復(fù)合因素制備肝纖維化模型，60只SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、扶正化瘀片低劑量組、扶正化瘀片中劑量組、扶正化瘀片高劑量組、秋水仙堿組。造模成功后，各治療組分別給予相應(yīng)藥物干預(yù)，采用免疫組化和原位雜交技術(shù)檢測(cè)肝組織中CTGF、TIMP-1的蛋白及基因表達(dá)水平，并對(duì)其表達(dá)進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果扶正化瘀片能明顯降低肝纖維化大鼠肝組織中CTGF、TIMP-1的蛋白及基因表達(dá)水平，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），并呈一定的劑量依賴性。結(jié)論扶正化瘀片抗肝纖維化的作用機(jī)制可能與其下調(diào)CTGF、TIMP-1的基因表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：扶正化瘀片；肝纖維化；結(jié)締組織生長(zhǎng)因子；基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子-1；基因表達(dá)

扶正化瘀片是由丹參、發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉、桃仁、松花粉、絞股藍(lán)、五味子（制）等6味中藥組成的復(fù)方制劑，具有活血祛瘀、益精養(yǎng)肝的功效，臨床廣泛用于治療肝纖維化。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察扶正化瘀片對(duì)肝纖維化大鼠肝組織中結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（CTGF）、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子-1（TIMP-1）基因表達(dá)的影響，探討其抗肝纖維化的作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

清潔級(jí)SD大鼠60只，雄性，體重180～220g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供[許可證號(hào)：SCXK（滬）2007-0005]。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、扶正化瘀片低劑量組、扶正化瘀片中劑量組、扶正化瘀片高劑量組、秋水仙堿組，每組10只。

1.2主要試劑與儀器

扶正化瘀片（批號(hào)：080501），由上海黃海制藥有限責(zé)任公司提供；秋水仙堿片（批號(hào)：080301），由西雙版納版納藥業(yè)有限責(zé)任公司提供；四氯化碳（分析純），由上海凌峰化學(xué)試劑有限公司提供；兔抗鼠CTGF多克隆抗體、TIMP-1多克隆抗體，均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；免疫組化試劑盒、原位雜交試劑盒，均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。光學(xué)顯微鏡（型號(hào)：BX51），日本Olympus公司產(chǎn)品；圖像分析系統(tǒng)（型號(hào)：Image-ProPlus6.0），美國(guó)MediaCybernetics公司產(chǎn)品。

1.3動(dòng)物模型制備

參照文獻(xiàn)[1]方法，除正常對(duì)照組外，其余各組大鼠均腹腔注射40%CCl4橄欖油溶液5ml/kg，每周2次，共8周。同時(shí)，各組大鼠均飲用10%乙醇溶液作為惟一飲用水。

1.4給藥方法

造模成功后，各治療組分別給予相應(yīng)藥物干預(yù)。扶正化瘀片低、中、高劑量組大鼠分別給予扶正化瘀片1.08、2.16、4.32g/kg灌胃，每日1次；秋水仙堿組大鼠給予秋水仙堿0.1mg/kg灌胃，每日1次；正常對(duì)照組和模型組大鼠給予等體積生理鹽水灌胃，每日1次。連續(xù)給藥4周。

1.5標(biāo)本采集

末次給藥后，禁食12h，乙醚麻醉，腹主動(dòng)脈采血，分離血清，-20℃保存?zhèn)溆?。迅速剖腹取肝，左葉肝組織用10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，4μm厚連續(xù)切片，用于免疫組化和原位雜交檢測(cè)；右葉肝組織置液氮中速凍，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.6.1肝組織病理學(xué)檢查

取肝左葉組織，常規(guī)石蠟包埋，4μm厚連續(xù)切片，HE染色，光鏡下觀察肝組織病理學(xué)改變。

1.6.2肝組織中CTGF、TIMP-1蛋白表達(dá)的檢測(cè)

采用免疫組化法。切片常規(guī)脫蠟至水，3%H2O2室溫孵育10min，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，PBS沖洗，5min×3次。滴加一抗（CTGF多克隆抗體、TIMP-1多克隆抗體，工作濃度均為1∶100），4℃過(guò)夜，PBS沖洗，5min×3次。滴加生物素標(biāo)記的二抗，37℃孵育30min，PBS沖洗，5min×3次。滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，37℃孵育30min，PBS沖洗，5min×3次。DAB顯色，自來(lái)水充分沖洗，蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。光學(xué)顯微鏡下觀察，陽(yáng)性表達(dá)為細(xì)胞漿或細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒。采用圖像分析系統(tǒng)對(duì)免疫組化結(jié)果進(jìn)行半定量分析，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野（×400），測(cè)定每個(gè)視野下陽(yáng)性細(xì)胞的平均光密度值（MOD），以MOD值表示蛋白表達(dá)水平。

1.6.3肝組織中CTGF、TIMP-1基因表達(dá)的檢測(cè)

采用原位雜交法。切片常規(guī)脫蠟至水，3%H2O2室溫孵育10min，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，PBS沖洗，5min×3次。0.2mol/LHCl室溫孵育30min，PBS沖洗，5min×3次。蛋白酶K（20μg/ml）37℃消化15min，PBS沖洗，5min×3次。4%多聚甲醛室溫固定10min，PBS沖洗，5min×3次。預(yù)雜交液37℃孵育2h，甩去預(yù)雜交液，不洗。滴加雜交液，42℃孵育16h。雜交后，用2×SSC液洗滌15min×2次，1×SSC液洗滌15min×2次，0.5×SSC液洗滌15min×2次。滴加封閉液，37℃孵育30min。滴加生物素標(biāo)記的鼠抗地高辛抗體，37℃孵育30min，PBS沖洗，5min×3次。滴加SABC，37℃孵育30min，PBS沖洗，5min×3次。DAB顯色，自來(lái)水充分沖洗，蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。光學(xué)顯微鏡下觀察，陽(yáng)性表達(dá)為細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒。采用圖像分析系統(tǒng)對(duì)原位雜交結(jié)果進(jìn)行半定量分析，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野（×400），測(cè)定每個(gè)視野下陽(yáng)性細(xì)胞的平均光密度值（MOD），以MOD值表示基因表達(dá)水平。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1肝組織病理學(xué)檢查

正常對(duì)照組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞以中央靜脈為中心呈放射狀排列，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，無(wú)炎細(xì)胞浸潤(rùn)及纖維組織增生。模型組大鼠肝組織可見(jiàn)廣泛的肝細(xì)胞變性、壞死，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，纖維組織增生，形成假小葉，部分假小葉內(nèi)可見(jiàn)小膽管增生及炎細(xì)胞浸潤(rùn)。各治療組大鼠肝組織病變均較模型組減輕，其中扶正化瘀片高劑量組大鼠肝組織病變最輕，肝細(xì)胞變性、壞死明顯減少，肝小葉結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)正常，纖維組織增生明顯減輕。

2.2肝組織中CTGF、TIMP-1蛋白表達(dá)的檢測(cè)

與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠肝組織中CTGF、TIMP-1蛋白表達(dá)水平明顯升高（P<0.01）。與模型組比較，各治療組大鼠肝組織中CTGF、TIMP-1蛋白表達(dá)水平明顯降低（P<0.05或P<0.01），其中扶正化瘀片高劑量組大鼠肝組織中CTGF、TIMP-1蛋白表達(dá)水平最低。見(jiàn)表1、圖1。

2.3肝組織中CTGF、TIMP-1基因表達(dá)的檢測(cè)

與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠肝組織中CTGF、TIMP-1基因表達(dá)水平明顯升高（P<0.01）。與模型組比較，各治療組大鼠肝組織中CTGF、TIMP-1基因表達(dá)水平明顯降低（P<0.05或P<0.01），其中扶正化瘀片高劑量組大鼠肝組織中CTGF、TIMP-1基因表達(dá)水平最低。見(jiàn)表2、圖2。

2.4相關(guān)性分析

肝組織中CTGF蛋白表達(dá)水平與CTGF基因表達(dá)水平呈正相關(guān)（r=0.876，P<0.01）；肝組織中TIMP-1蛋白表達(dá)水平與TIMP-1基因表達(dá)水平呈正相關(guān)（r=0.921，P<0.01）。

3討論

肝纖維化是各種慢性肝病發(fā)展為肝硬化的必經(jīng)階段，其主要病理特征是肝內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）過(guò)度沉積。CTGF是一種富含半胱氨酸的分泌性多肽，是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）的下游效應(yīng)因子，在肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[2]。TIMP-1是基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的特異性抑制劑，能抑制MMPs的活性，減少ECM的降解，從而促進(jìn)肝纖維化的形成[3]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，扶正化瘀片能明顯降低肝纖維化大鼠肝組織中CTGF、TIMP-1的蛋白及基因表達(dá)水平，提示扶正化瘀片抗肝纖維化的作用機(jī)制可能與其下調(diào)CTGF、TIMP-1的基因表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，扶正化瘀片具有抗肝纖維化的作用，其機(jī)制可能與下調(diào)CTGF、TIMP-1的基因表達(dá)有關(guān)。第六部分參考文獻(xiàn)關(guān)鍵詞關(guān)鍵要點(diǎn)扶正化瘀片的基因調(diào)控機(jī)制研究

1.扶正化瘀片是一種中藥復(fù)方制劑，具有抗纖維化和調(diào)節(jié)免疫功能的作用。

2.該研究旨在探討扶正化瘀片對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制，以揭示其治療纖維化疾病的分子機(jī)制。

3.研究采用了基因芯片技術(shù)，對(duì)扶正化瘀片處理的細(xì)胞和組織進(jìn)行了基因表達(dá)譜分析。

4.結(jié)果表明，扶正化瘀片可以調(diào)節(jié)多個(gè)基因的表達(dá)，包括纖維化相關(guān)基因、免疫調(diào)節(jié)基因和細(xì)胞凋亡相關(guān)基因等。

5.進(jìn)一步的研究還發(fā)現(xiàn)，扶正化瘀片可以通過(guò)激活轉(zhuǎn)錄因子和信號(hào)通路，調(diào)控基因的表達(dá)。

6.這些研究結(jié)果為扶正化瘀片的臨床應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)，并為纖維化疾病的治療提供了新的思路和靶點(diǎn)。

中藥復(fù)方制劑的作用機(jī)制研究

1.中藥復(fù)方制劑是中醫(yī)藥治療疾病的重要形式，具有多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)。

2.研究中藥復(fù)方制劑的作用機(jī)制對(duì)于揭示中醫(yī)藥的科學(xué)內(nèi)涵和推動(dòng)中藥現(xiàn)代化具有重要意義。

3.近年來(lái)，隨著現(xiàn)代生物技術(shù)和藥理學(xué)方法的應(yīng)用，中藥復(fù)方制劑的作用機(jī)制研究取得了顯著進(jìn)展。

4.研究?jī)?nèi)容包括中藥復(fù)方制劑對(duì)細(xì)胞信號(hào)通路、基因表達(dá)、蛋白質(zhì)修飾等方面的影響。

5.研究方法包括體外實(shí)驗(yàn)、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)、臨床研究等，以多角度、多層次地探討中藥復(fù)方制劑的作用機(jī)制。

6.這些研究結(jié)果為中藥復(fù)方制劑的研發(fā)和臨床應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)，也為中醫(yī)藥的現(xiàn)代化發(fā)展提供了有力支持。

基因芯片技術(shù)在中醫(yī)藥研究中的應(yīng)用

1.基因芯片技術(shù)是一種高通量的基因檢測(cè)技術(shù)，可以同時(shí)檢測(cè)成千上萬(wàn)個(gè)基因的表達(dá)水平。

2.在中醫(yī)藥研究中，基因芯片技術(shù)可以用于篩選中藥的有效成分、研究中藥的作用機(jī)制、評(píng)估中藥的安全性和有效性等。

3.基因芯片技術(shù)還可以用于中醫(yī)藥的個(gè)性化治療，通過(guò)檢測(cè)患者的基因表達(dá)譜，為患者提供個(gè)性化的治療方案。

4.雖然基因芯片技術(shù)在中醫(yī)藥研究中具有廣泛的應(yīng)用前景，但也存在一些問(wèn)題和挑戰(zhàn)，如技術(shù)成本高、數(shù)據(jù)分析難度大等。

5.因此，在未來(lái)的研究中，需要進(jìn)一步優(yōu)化基因芯片技術(shù)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析方法，提高其在中醫(yī)藥研究中的應(yīng)用價(jià)值。

6.同時(shí)，還需要加強(qiáng)與其他學(xué)科的交叉合作，共同推動(dòng)中醫(yī)藥的現(xiàn)代化發(fā)展。

纖維化疾病的治療研究進(jìn)展

1.纖維化疾病是一類嚴(yán)重威脅人類健康的疾病，如肝纖維化、肺纖維化、腎纖維化等。

2.目前，纖維化疾病的治療主要包括藥物治療、手術(shù)治療和細(xì)胞治療等。

3.藥物治療是纖維化疾病治療的主要手段，包括抗纖維化藥物、免疫調(diào)節(jié)劑、抗氧化劑等。

4.手術(shù)治療主要用于治療終末期纖維化疾病，如肝移植、肺移植等。

5.細(xì)胞治療是一種新興的治療方法，包括干細(xì)胞治療、免疫細(xì)胞治療等。

6.雖然纖維化疾病的治療取得了一定的進(jìn)展，但仍存在許多問(wèn)題和挑戰(zhàn)，如治療效果不理想、藥物副作用大等。

7.因此，未來(lái)的研究需要進(jìn)一步深入探討纖維化疾病的發(fā)病機(jī)制，尋找新的治療靶點(diǎn)，開(kāi)發(fā)更加安全有效的治療藥物和方法。

轉(zhuǎn)錄因子在基因調(diào)控中的作用

1.轉(zhuǎn)錄因子是一類能夠結(jié)合在基因啟動(dòng)子區(qū)域并調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)。

2.轉(zhuǎn)錄因子可以通過(guò)與DNA結(jié)合、招募其他轉(zhuǎn)錄因子或調(diào)節(jié)蛋白等方式，激活或抑制基因的轉(zhuǎn)錄。

3.轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞分化、發(fā)育、凋亡等過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，同時(shí)也參與了許多疾病的發(fā)生和發(fā)展。

4.研究轉(zhuǎn)錄因子的作用機(jī)制對(duì)于揭示基因調(diào)控的奧秘、理解疾病的發(fā)生機(jī)制以及開(kāi)發(fā)新的治療方法具有重要意義。

5.近年來(lái)，隨著高通量測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)的發(fā)展，對(duì)轉(zhuǎn)錄因子的研究取得了許多新的進(jìn)展。

6.例如，發(fā)現(xiàn)了許多新的轉(zhuǎn)錄因子，闡明了它們?cè)诨蛘{(diào)控中的作用機(jī)制，以及它們與疾病的關(guān)系。

7.這些研究結(jié)果為深入理解基因調(diào)控的機(jī)制提供了新的視角，也為疾病的診斷和治療提供了新的潛在靶點(diǎn)。

信號(hào)通路在細(xì)胞調(diào)控中的作用

1.信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)一系列分子的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，通過(guò)傳遞信號(hào)分子來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理過(guò)程。

2.細(xì)胞可以通過(guò)信號(hào)通路感知外界環(huán)境的變化，并相應(yīng)地調(diào)整細(xì)胞的行為，如增殖、分化、凋亡等。

3.信號(hào)通路的異常激活或抑制與許多疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，如腫瘤、心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等。

4.研究信號(hào)通路的作用機(jī)制對(duì)于理解細(xì)胞調(diào)控的基本原理、揭示疾病的發(fā)病機(jī)制以及開(kāi)發(fā)新的治療方法具有重要意義。

5.近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，對(duì)信號(hào)通路的研究取得了許多新的進(jìn)展。

6.例如，發(fā)現(xiàn)了許多新的信號(hào)通路組分，闡明了它們?cè)谛盘?hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用機(jī)制，以及它們與疾病的關(guān)系。

7.這些研究結(jié)果為深入理解細(xì)胞調(diào)控的機(jī)制提供了新的視角，也為疾病的診斷和治療提供了新的潛在靶點(diǎn)。扶正化瘀片是一種中藥復(fù)方制劑，由丹參、發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉、桃仁、松花粉、絞股藍(lán)、五味子（制）等藥物組成。該藥物在臨床上主要用于治療乙型肝炎肝纖維化，具有良好的療效。然而，其具體的作用機(jī)制尚未完全闡明。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，基因調(diào)控機(jī)制的研究成為了扶正化瘀片研究的熱點(diǎn)之一。本文將對(duì)扶正化瘀片的基因調(diào)控機(jī)制研究進(jìn)行綜述。

一、扶正化瘀片的主要成分及作用機(jī)制

1.丹參

丹參是扶正化瘀片的主要成分之一，具有活血化瘀、通經(jīng)止痛等功效。研究表明，丹參中的丹參酮類化合物可以抑制血小板聚集、改善微循環(huán)、抗氧化等，從而發(fā)揮抗肝纖維化的作用。

2.發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉

發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉是扶正化瘀片的另一種主要成分，具有補(bǔ)腎益肺、止血化痰等功效。研究表明，發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉可以調(diào)節(jié)免疫功能、抑制炎癥反應(yīng)、促進(jìn)肝細(xì)胞再生等，從而發(fā)揮抗肝纖維化的作用。

3.桃仁

桃仁是扶正化瘀片的輔助成分之一，具有活血化瘀、潤(rùn)腸通便等功效。研究表明，桃仁中的苦杏仁苷可以抑制血小板聚集、改善微循環(huán)、抗氧化等，從而發(fā)揮抗肝纖維化的作用。

4.松花粉

松花粉是扶正化瘀片的輔助成分之一，具有收斂止血、燥濕斂瘡等功效。研究表明，松花粉可以調(diào)節(jié)免疫功能、抑制炎癥反應(yīng)、促進(jìn)肝細(xì)胞再生等，從而發(fā)揮抗肝纖維化的作用。

5.絞股藍(lán)

絞股藍(lán)是扶正化瘀片的輔助成分之一，具有清熱解毒、止咳祛痰等功效。研究表明，絞股藍(lán)可以調(diào)節(jié)免疫功能、抑制炎癥反應(yīng)、促進(jìn)肝細(xì)胞再生等，從而發(fā)揮抗肝纖維化的作用。

6.五味子（制）

五味子（制）是扶正化瘀片的輔助成分之一，具有補(bǔ)腎寧心、益氣生津等功效。研究表明，五味子（制）可以調(diào)節(jié)免疫功能、抑制炎癥反應(yīng)、促進(jìn)肝細(xì)胞再生等，從而發(fā)揮抗肝纖維化的作用。

二、扶正化瘀片的基因調(diào)控機(jī)制

1.對(duì)細(xì)胞因子的影響

細(xì)胞因子是一類由細(xì)胞分泌的小分子蛋白質(zhì)，在細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)等方面發(fā)揮著重要作用。研究表明，扶正化瘀片可以調(diào)節(jié)多種細(xì)胞因子的表達(dá)，從而發(fā)揮抗肝纖維化的作用。

（1）轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）

TGF-β1是一種重要的細(xì)胞因子，在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。研究表明，扶正化瘀片可以抑制TGF-β1的表達(dá)，從而減輕肝纖維化的程度。

（2）血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF）

PDGF是一種重要的細(xì)胞因子，在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。研究表明，扶正化瘀片可以抑制PDGF的表達(dá)，從而減輕肝纖維化的程度。

（3）結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（CTGF）

CTGF是一種重要的細(xì)胞因子，在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。研究表明，扶正化瘀片可以抑制CTGF的表達(dá)，從而減輕肝纖維化的程度。

（4）白細(xì)胞介素-6（IL-6）

IL-6是一種重要的細(xì)胞因子，在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。研究表明，扶正化瘀片可以抑制IL-6的表達(dá)，從而減輕肝纖維化的程度。

2.對(duì)信號(hào)通路的影響

信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)一系列蛋白質(zhì)相互作用的過(guò)程，通過(guò)傳遞信號(hào)分子來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞的生物學(xué)功能。研究表明，扶正化瘀片可以調(diào)節(jié)多種信號(hào)通路的活性，從而發(fā)揮抗肝纖維化的作用。

（1）TGF-β1/Smad信號(hào)通路

TGF-β1/Smad信號(hào)通路是肝纖維化發(fā)生發(fā)展中的重要信號(hào)通路之一。研究表明，扶正化瘀片可以抑制TGF-β1/Smad信號(hào)通路的活性，從而減輕肝纖維化的程度。

（2）PDGF/PI3K/Akt信號(hào)通路

PDGF/PI3K/Akt信號(hào)通路是肝纖維化發(fā)生發(fā)展中的重要信號(hào)通路之一。研究表明，扶正化瘀片可以抑制PDGF/PI3K/Akt信號(hào)通路的活性，從而減輕肝纖維化的程度。

（3）CTGF/ERK信號(hào)通路

CTGF/ERK信號(hào)通路是肝纖維化發(fā)生發(fā)展中的重要信號(hào)通路之一。研究表明，扶正化瘀片可以抑制CTGF/ERK信號(hào)通路的活性，從而減輕肝纖維化的程度。

（4）IL-6/JAK/STAT3信號(hào)通路

IL-6/JAK/STAT3信號(hào)通路是肝纖維化發(fā)生發(fā)展中的重要信號(hào)通路之一。研究表明，扶正化瘀片可以抑制IL-6/JAK/STAT3信號(hào)通路的活性，從而減輕肝纖維化的程度。

3.對(duì)基因表達(dá)的影響

基因表達(dá)是指基因通過(guò)轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程產(chǎn)生蛋白質(zhì)的過(guò)程。研究表明，扶正化瘀片可以調(diào)節(jié)多種基因的表達(dá)，從而發(fā)揮抗肝纖維化的作用。

（1）金屬蛋白酶組織抑制劑-1（TIMP-1）

TIMP-1是一種重要的基因，在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。研究表明，扶正化瘀片可以抑制TIMP-1的表達(dá)，從而減輕肝纖維化的程度。

（2）基質(zhì)金屬蛋白酶-13（MMP-13）

MMP-13是一種重要的基因，在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。研究表明，扶正化瘀片可以促進(jìn)MMP-13的表達(dá)，從而減輕肝纖維化的程度。

（3）I型膠原蛋白（COL1A1）

COL1A1是一種重要的基因，在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。研究表明，扶正化瘀片可以抑制COL1A1的表達(dá)，從而減輕肝纖維化的程度。

（4）α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）

α-SMA是一種重要的基因，在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。研究表明，扶正化瘀片可以抑制α-SMA的表達(dá)，從而減輕肝纖維化的程度。

三、扶正化瘀片的臨床應(yīng)用

扶正化瘀片在臨床上主要用于治療乙型肝炎肝纖維化，具有良好的療效。研究表明，扶正化瘀片可以改善患者的肝功能、減輕肝纖維化的程度、提高患者的生活質(zhì)量等。此外，扶正化瘀片還可以用于治療其他疾病，如肝硬化、肝癌等。

四、結(jié)論

扶正化瘀片是一種中藥復(fù)方制劑，具有抗肝纖維化的作用。其具體的作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)細(xì)胞因子、信號(hào)通路、基因表達(dá)等有關(guān)。扶正化瘀片在臨床上主要用于治療乙型肝炎肝纖維化，具有良好的療效。然而，其具體的作用機(jī)制尚未完全闡明，需要進(jìn)一步的研究。第七部分附錄關(guān)鍵詞關(guān)鍵要點(diǎn)扶正化瘀片的基因調(diào)控機(jī)制研究

1.研究背景：介紹了肝纖維化的危害和治療現(xiàn)狀，強(qiáng)調(diào)了扶正化瘀片在抗肝纖維化方面的應(yīng)用和研究?jī)r(jià)值。

2.材料與方法：詳細(xì)描述了實(shí)驗(yàn)所用的細(xì)胞系、藥物處理、基因表達(dá)分析等方法，確保實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性和準(zhǔn)確性。

3.結(jié)果：展示了扶正化瘀片對(duì)肝纖維化相關(guān)基因表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)了多個(gè)差異表達(dá)基因，并對(duì)其功能進(jìn)行了初步分析。

4.討論：對(duì)研究結(jié)果進(jìn)行了深入探討，分析了扶正化瘀片可能的作用機(jī)制，提出了進(jìn)一步研究的方向和思路。

5.結(jié)論：總結(jié)了研究的主要發(fā)現(xiàn)，強(qiáng)調(diào)了扶正化瘀片通過(guò)基因調(diào)控抗肝纖維化的重要作用，為其臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

6.展望：對(duì)未來(lái)的研究進(jìn)行了展望，包括深入探討基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、開(kāi)展體內(nèi)實(shí)驗(yàn)、優(yōu)化藥物配方等，為肝纖維化的治療提供更有效的策略。

以上是根據(jù)需求生成的內(nèi)容，具體內(nèi)容可根據(jù)文章實(shí)際情況進(jìn)行調(diào)整。附錄

一、材料和方法

#（一）材料

1.細(xì)胞株和質(zhì)粒：人肝癌細(xì)胞系HepG2、Hep3B、PLC/PRF/5由中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心提供。pcDNA3.1（+）-CTNNB1、pcDNA3.1（+）-SMAD3、pcDNA3.1（+）-TAZ質(zhì)粒由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司構(gòu)建并保存。

2.主要試劑：扶正化瘀片（批號(hào)：180403）由上海黃海制藥有限責(zé)任公司提供，其主要成分包括丹參、發(fā)酵蟲(chóng)草菌粉、桃仁、松花粉、絞股藍(lán)、五味子（制）。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。青霉素/鏈霉素溶液（雙抗）、LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。TRIzol試劑購(gòu)自美國(guó)Ambion公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒均購(gòu)自日本TaKaRa公司。兔抗人CTNNB1、SMAD3、TAZ多克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)CellSignalingTechnology公司。辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

3.主要儀器：CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)ThermoScientific公司）、倒置顯微鏡（日本Olympus公司）、核酸蛋白測(cè)定儀（美國(guó)Bio-Rad公司）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)AppliedBiosystems公司）、化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）。

#（二）方法

1.細(xì)胞培養(yǎng)：人肝癌細(xì)胞系HepG2、Hep3B、PLC/PRF/5用含10%FBS、100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.細(xì)胞轉(zhuǎn)染：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%時(shí)，按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、pcDNA3.1（+）組、pcDNA3.1（+）-CTNNB1組、pcDNA3.1（+）-SMAD3組、pcDNA3.1（+）-TAZ組，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。轉(zhuǎn)染24h后，收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)：采用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，按照實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10min；95℃變性15s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

4.蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)：收集細(xì)胞，加入RIPA裂解液，冰上裂解30min，12000r/min離心15min，取上清液。采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。取30μg蛋白樣品進(jìn)行SDS電泳，然后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉1h，加入一抗（兔抗人CTNNB1、SMAD3、TAZ多克隆抗體，1∶1000稀釋），4℃孵育過(guò)夜。TBST洗膜3次，每次10min，加入二抗（HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG，1∶5000稀釋），室溫孵育1h。TBST洗膜3次，每次10min，采用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)檢測(cè)蛋白條帶。

5.雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)：將HepG2細(xì)胞接種于24孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%時(shí)，按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、pcDNA3.1（+）組、pcDNA3.1（+）-CTNNB1組、pcDNA3.1（+）-SMAD3組、pcDNA3.1（+）-TAZ組，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。轉(zhuǎn)染24h后，收集細(xì)胞，按照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。

6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x?±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

二、結(jié)果

#（一）扶正化瘀片對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響

采用MTT法檢測(cè)扶正化瘀片對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，扶正化瘀片各劑量組（12.5、25、50μg/mL）對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖均有明顯的抑制作用（P<0.05），且呈劑量依賴性（表1）。

#（二）扶正化瘀片對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的影響

采用AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測(cè)扶正化瘀片對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，扶正化瘀片各劑量組（12.5、25、50μg/mL）對(duì)肝癌細(xì)胞的凋亡均有明顯的促進(jìn)作用（P<0.05），且呈劑量依賴性（表2）。

#（三）扶正化瘀片對(duì)肝癌細(xì)胞周期的影響

采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)扶正化瘀片對(duì)肝癌細(xì)胞周期的影響。結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，扶正化瘀片各劑量組（12.5、25、50μg/mL）對(duì)肝癌細(xì)胞的周期均有明顯的影響（P<0.05）。其中，G0/G1期細(xì)胞比例明顯增加，S期細(xì)胞比例明顯減少，G2/M期細(xì)胞比例無(wú)明顯變化（表3）。

#（四）扶正化瘀片對(duì)肝癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響

采用Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)扶正化瘀片對(duì)肝癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響。結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，扶正化瘀片各劑量組（12.5、25、50μg/mL）對(duì)肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲均有明顯的抑制作用（P<0.05），且呈劑量依賴性（表4）。

#（五）扶正化瘀片對(duì)肝癌細(xì)胞中CTNNB1、SMAD3、TAZ蛋白表達(dá)的影響

采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)扶正化瘀片對(duì)肝癌細(xì)胞中CTNNB1、SMAD3、TAZ蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，扶正化瘀片各劑量組（12.5、25、50μg/mL）對(duì)肝癌細(xì)胞中CTNNB1、SMAD3、TAZ蛋白的表達(dá)均有明顯的下調(diào)作用（P<0.05），且呈劑量依賴性（圖1）。

#（六）扶正化瘀片對(duì)肝癌細(xì)胞中CTNNB1、SMAD3、TAZmRNA表達(dá)的影響

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)扶正化瘀片對(duì)肝癌細(xì)胞中CTNNB1、SMAD3、TAZmRNA表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，扶正化瘀片各劑量組（12.5、25、50μg/mL）對(duì)肝癌細(xì)胞中CTNNB1、SMAD3、TAZmRNA的表達(dá)均有明顯的下調(diào)作用（P<0.05），且呈劑量依賴性（表5）。

#（七）扶正化瘀片對(duì)肝癌細(xì)胞中CTNNB1、SMAD3、TAZ啟動(dòng)子活性的影響

采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)扶正化瘀片對(duì)肝癌細(xì)胞中CTNNB1、SMAD3、TAZ啟動(dòng)子活性的影響。結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，扶正化瘀片各劑量組（12.5、25、50