蜂蜜中氯霉素和甲硝唑殘留量的測(cè)定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

ICS67.050

CCSX04

BPMA

北京預(yù)防醫(yī)學(xué)會(huì)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)

T/BPMAXXXX—XXXX

蜂蜜中氯霉素和甲硝唑殘留量的測(cè)定

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

Methodofdeterminationofchloramphenicolandmetronidazoleresiduesinhoneyby

LC-MS-MSmethod

征求意見(jiàn)稿

XXXX-XX-XX發(fā)布XXXX-XX-XX實(shí)施

北京預(yù)防醫(yī)學(xué)會(huì)發(fā)布

T/BPMAXXXX—XXXX

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定

起草。

本文件由北京市通州區(qū)疾病預(yù)防控制中心提出。

本文件由北京預(yù)防醫(yī)學(xué)會(huì)歸口。

本文件起草單位：北京市通州區(qū)疾病預(yù)防控制中心、北京市順義區(qū)疾病預(yù)防控制中心、北京市海淀

區(qū)疾病預(yù)防控制中心。

本文件主要起草人：魏玉霞、王建國(guó)、劉盛田、王芳、崔悅、王靜、左郡、楊文英、王艷春、李曉

輝、曹冬、籍術(shù)良、李秦、馬愛(ài)英、李亞、張子彤。

II

T/BPMAXXXX—XXXX

蜂蜜中氯霉素和甲硝唑殘留量的測(cè)定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

1范圍

本文件給出了蜂蜜中氯霉素和甲硝唑殘留量的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定方法。

本文件適用于蜂蜜中氯霉素和甲硝唑殘留量的測(cè)定。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

3.術(shù)語(yǔ)和定義

本文件沒(méi)有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義。

3原理

試樣用乙腈提取，提取后經(jīng)固相萃取柱凈化，氮吹濃縮，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定，內(nèi)標(biāo)法定量。

4試劑和材料

除另有說(shuō)明，本方法所用試劑均為優(yōu)級(jí)純，水為GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水。

乙腈：色譜純。

乙酸銨：色譜純。

PTFE微孔過(guò)濾膜：0.22μm。

C18和NH2復(fù)合小柱。

乙腈-水溶液：10mL乙腈和90mL水，混合均勻。

5mmol/L乙酸銨溶液：準(zhǔn)確稱取0.385g乙酸銨，用水溶解，定容至1L。

氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液：100μg/mL。

甲硝唑標(biāo)準(zhǔn)溶液：100μg/mL。

氯霉素-D5標(biāo)準(zhǔn)溶液：100μg/mL。

甲硝唑-D4標(biāo)準(zhǔn)溶液：100μg/mL。

混合標(biāo)準(zhǔn)中間液：分別準(zhǔn)確吸取甲硝唑標(biāo)準(zhǔn)溶液和氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液0.50mL于50mL容量瓶中，

用乙腈配制為1.00μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液。

混合標(biāo)準(zhǔn)使用液：準(zhǔn)確吸取1.00μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液5.00mL于50mL容量瓶中，用乙腈

配制為100μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)使用液。

混合內(nèi)標(biāo)中間液：分別準(zhǔn)確吸取甲硝唑-D4標(biāo)準(zhǔn)溶液和氯霉素-D5標(biāo)準(zhǔn)溶液0.50mL于50mL容

量瓶中，用乙腈配制為1.00μg/mL的混合內(nèi)標(biāo)中間液。

混合內(nèi)標(biāo)使用液：準(zhǔn)確吸取1.00μg/mL的混合內(nèi)標(biāo)中間液5.00mL于50mL容量瓶中，用乙腈

配制為100μg/L的混合內(nèi)標(biāo)使用液。

混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液：分別準(zhǔn)確吸取一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)使用液和混合內(nèi)標(biāo)使用液，用乙腈-水溶液

配制氯霉素和甲硝唑濃度為：0.1μg/L、0.2μg/L、0.5μg/L、1.0μg/L、2.0μg/L、5.0μg/L、10.0μg/L、

20.0μg/L、50.0μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)系列，內(nèi)標(biāo)濃度為2.0μg/L。

5儀器

1

T/BPMAXXXX—XXXX

液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀：配有電噴霧離子源。

分析天平：感量0.1mg和0.01g。

色譜柱（BEHC18，100mm×2.1mm，1.7μm）或相當(dāng)者。

渦旋混合器。

冷凍離心機(jī)：轉(zhuǎn)速10000r/min。

超聲儀。

氮吹儀或相當(dāng)者。

6試樣的制備和保存

試樣的制備

對(duì)無(wú)結(jié)晶的實(shí)驗(yàn)室樣品，將其攪拌均勻。對(duì)有結(jié)晶的樣品，在密閉情況下，置于不超過(guò)60℃的水浴

中溫?zé)?，振蕩，將樣品全部融化后攪勻，冷卻至室溫。分出0.5kg作為試樣，制備好的試樣置于樣品瓶

中，密封，并做上標(biāo)記。

試樣保存

將試樣于常溫下保存。

7測(cè)定步驟

提取

稱取蜂蜜5.00g（精確至0.01g）于50mL離心管中，分別加入40μL100μg/L混合內(nèi)標(biāo)使用液，加水

5mL，混勻溶解，再加入10mL乙腈，渦旋提取2min，超聲提取30min，10000rpm離心8min，吸取上

清液于另一潔凈試管。

凈化

準(zhǔn)確移取5mL上清液直接上樣C18和NH2復(fù)合小柱，接收全部流出液，將接出的流出液在40℃水浴

條件下氮吹至近干，用水定容至1mL，過(guò)膜，上機(jī)測(cè)定。

測(cè)定

7.3.1液相色譜參考條件

a)色譜柱：BEHC18色譜柱，100mm×2.1mm，粒徑1.7μm，或性能相當(dāng)者。

b)流動(dòng)相A=5mmol/L乙酸銨溶液，B=乙腈，梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

c)柱溫：40℃。

d)流速:0.3mL/min。

e)進(jìn)樣量：5μL。

表1流動(dòng)相梯度洗脫條件

時(shí)間（min)5mmol/L乙酸銨溶液%乙腈%

初始955.0

0.5955.0

3.00100

4.00100

5.0955.0

7.3.2甲硝唑質(zhì)譜參考條件

a)電離方式：電噴霧電離，正離子模式（ESI+）。

b)毛細(xì)管電壓：3KV。

c)離子源溫度：500℃。

2

T/BPMAXXXX—XXXX

d)脫溶劑氣流量：1000L/Hr。

e)錐孔反吹氣流量：150L/Hr。

f)霧化器壓力：7bar。

g)檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM），離子對(duì)、錐孔電壓、碰撞電壓見(jiàn)表2。

7.3.3氯霉素質(zhì)譜參考條件

a)電離方式：電噴霧電離，負(fù)離子模式（ESI-）。

b)毛細(xì)管電壓：2.8KV。

c)離子源溫度：500℃。

d)脫溶劑氣流量：1000L/Hr。

e)錐孔反吹氣流量：150L/Hr。

f)霧化器壓力：7bar。

g)檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM），離子對(duì)、錐孔電壓、碰撞電壓見(jiàn)表2。

表2MRM參數(shù)

化合物模式母離子（m/z）子離子（m/z）錐孔電壓（v）碰撞電壓（v）

321.0152.0*4020

氯霉素ES-

321.0257.04015

326.1157.0*4020

氯霉素-D5ES-

326.1262.14015

172.1128.1*2020

甲硝唑ES+

172.182.12015

176.182.12020

甲硝唑-D4ES+

176.1128.1*2015

注：*為定量離子

7.3.4定性測(cè)定

在相同實(shí)驗(yàn)條件下，樣品中待測(cè)化合物的保留時(shí)間與相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品色譜峰的保留時(shí)間一致，變化范圍

應(yīng)在±2.5%之內(nèi)；在相同的保留時(shí)間下提取到與已知標(biāo)準(zhǔn)相同的特征離子；與已知標(biāo)準(zhǔn)的特征離子相對(duì)

豐度的允許偏差不超出表3規(guī)定的范圍；滿足以上條件即可進(jìn)行確證。

表3定性確證時(shí)相對(duì)離子豐度的最大允許偏差

相對(duì)離子豐度（%）≤10＞10～20＞20～50＞50

允許相對(duì)偏差（%）±50±30±25±20

7.3.5定量測(cè)定

在液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜設(shè)定條件下分別進(jìn)樣混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，用標(biāo)準(zhǔn)工作曲

線對(duì)樣品進(jìn)行定量，樣品溶液中氯霉素、甲硝唑的響應(yīng)值均應(yīng)在儀器測(cè)定的線性范圍內(nèi)，在上述色譜條

件下，氯霉素和甲硝唑的參考保留時(shí)間、提取離子流色譜圖參見(jiàn)附錄A。

平行試樣

按7.1~7.2進(jìn)行平行樣品制備，在7.3條件下對(duì)同一試樣進(jìn)行平行試樣測(cè)定。

空白試驗(yàn)

除不稱取試樣外，按7.1~7.2進(jìn)行樣品制備，在7.3條件下進(jìn)行空白試驗(yàn)測(cè)定。

8結(jié)果計(jì)算

結(jié)果按式（1）計(jì)算：

?×?1×?3×1000

?=···················································(1)

?×?2×1000

3

T/BPMAXXXX—XXXX

式中：

X——樣品中目標(biāo)物含量，單位為μg/kg；

C——進(jìn)樣溶液中目標(biāo)物在標(biāo)準(zhǔn)曲線中對(duì)應(yīng)的濃度，單位為μg/L；

V1——提取液體積，單位為mL；

V2——用于凈化的樣品體積，單位為mL；

V3——定容體積，單位為mL；

1000——換算系數(shù)；

m——試樣的稱樣量，單位為g。

9方法檢測(cè)的靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度

靈敏度

取樣量按5.00g計(jì)算，方法檢測(cè)的檢出限為：氯霉素0.10μg/kg，甲硝唑0.10μg/kg。定量限：氯霉

素0.30μg/kg，甲硝唑0.30μg/kg。

準(zhǔn)確度

本方法在0.30μg/kg~5.0μg/kg范圍內(nèi)，進(jìn)行低、中、高三個(gè)不同濃度水平的加標(biāo)回收測(cè)定，回收率

范圍為：71.0%~118.8%。

精密度

本方法的批內(nèi)變異系數(shù)≤20%，批間變異系數(shù)≤20%。

4

T/BPMAXXXX—XXXX

附錄A

（資料性）

標(biāo)準(zhǔn)溶液中甲硝唑和氯霉素的色譜圖

圖A.1標(biāo)準(zhǔn)溶液中氯霉素和氯霉素-D5的提取離子流色譜圖(EIC)

圖A.2標(biāo)準(zhǔn)溶液中甲硝唑和甲硝唑-D4的提取離子流色譜圖(EIC)

5

T/BPMAXXXX—XXXX

目次

前言.................................................................................II

1范圍...............................................................................1

2規(guī)范性引用文件.....................................................................1

3術(shù)語(yǔ)和定義.........................................................................1

4原理...............................................................................1

5試劑和材料.........................................................................1

6儀器...............................................................................1

7試樣的制備和保存...................................................................2

8測(cè)定步驟...........................................................................2

9結(jié)果計(jì)算...........................................................................3

10方法檢測(cè)的靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度..................................................4

附錄A（資料性）標(biāo)準(zhǔn)溶液中甲硝唑和氯霉素的色譜圖.....................................5

I

T/BPMAXXXX—XXXX

蜂蜜中氯霉素和甲硝唑殘留量的測(cè)定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

1范圍

本文件給出了蜂蜜中氯霉素和甲硝唑殘留量的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定方法。

本文件適用于蜂蜜中氯霉素和甲硝唑殘留量的測(cè)定。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

3.術(shù)語(yǔ)和定義

本文件沒(méi)有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義。

3原理

試樣用乙腈提取，提取后經(jīng)固相萃取柱凈化，氮吹濃縮，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定，內(nèi)標(biāo)法定量。

4試劑和材料

除另有說(shuō)明，本方法所用試劑均為優(yōu)級(jí)純，水為GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水。

乙腈：色譜純。

乙酸銨：色譜純。

PTFE微孔過(guò)濾膜：0.22μm。

C18和NH2復(fù)合小柱。

乙腈-水溶液：10mL乙腈和90mL水，混合均勻。

5mmol/L乙酸銨溶液：準(zhǔn)確稱取0.385g乙酸銨，用水溶解，定容至1L。

氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液：100μg/mL。

甲硝唑標(biāo)準(zhǔn)溶液：100μg/mL。

氯霉素-D5標(biāo)準(zhǔn)溶液：100μg/mL。

甲硝唑-D4標(biāo)準(zhǔn)溶液：100μg/mL。

混合標(biāo)準(zhǔn)中間液：分別準(zhǔn)確吸取甲硝唑標(biāo)準(zhǔn)溶液和氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液0.50mL于50mL容量瓶中，

用乙腈配制為1.00μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液。

混合標(biāo)準(zhǔn)使用液：準(zhǔn)確吸取1.00μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液5.00mL于50mL容量瓶中，用乙腈

配制為100μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)使用液。

混合內(nèi)標(biāo)中間液：分別準(zhǔn)確吸取甲硝唑-D4標(biāo)準(zhǔn)溶液和氯霉素-D5標(biāo)準(zhǔn)溶液0.50mL于50mL容

量瓶中，用乙腈配制為1.00μg/mL的混合內(nèi)標(biāo)中間液。

混合內(nèi)標(biāo)使用液：準(zhǔn)確吸取1.00μg/mL的混合內(nèi)標(biāo)中間液5.00mL于50mL容量瓶中，用乙腈

配制為100μg/L的混合內(nèi)標(biāo)使用液。

混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液：分別準(zhǔn)確吸取一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)使用液和混合內(nèi)標(biāo)使用液，用乙腈-水溶液

配制氯霉素和甲硝唑濃度為：0.1μg/L、0.2μg/L、0.5μg/L、1.0μg/L、2.0μg/L、5.0μg/L、10.0μg/L、

20.0μg/L、50.0μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)系列，內(nèi)標(biāo)濃度為2.0μg/L。

5儀器

1

T/BPMAXXXX—XXXX

液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀：配有電噴霧離子源。

分析天平：感量0.1mg和0.01g。

色譜柱（BEHC18，100mm×2.1mm，1.7μm）或相當(dāng)者。

渦旋混合器。

冷凍離心機(jī)：轉(zhuǎn)速10000r/min。

超聲儀。

氮吹儀或相當(dāng)者。

6試樣的制備和保存

試樣的制備

對(duì)無(wú)結(jié)晶的實(shí)驗(yàn)室樣品，將其