《生物化學：酶》課件

生物化學：酶

Enzyme第一節(jié)酶的分子結構與功能第二節(jié)酶促反應的特點與機制第三節(jié)酶促反應動力學第四節(jié)酶的調節(jié)第五節(jié)固定化酶的制備第六節(jié)酶在醫(yī)藥學上的應用

酶學史1878年巴斯德發(fā)酵是酵母細胞生命活動的結果,出現(xiàn)酶的名稱1897年Buchner兄弟發(fā)酵過程不需要完整的酵母細胞1926年Sumner分離得到脲酶結晶，并提出酶的化學本質是蛋白質1930年Northrop分離得到胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶結晶并證實其均為蛋白質，酶的蛋白質本質確立。1982年Cech發(fā)現(xiàn)核酶(ribozyme)

酶（enzyme）是由活細胞產生的生物催化劑，這種催化劑具有極高的催化效率和高度的底物特異性，其化學本質是蛋白質。

單體酶

寡聚酶

多酶復合體

多酶體系多功能酶

酶的分類第一節(jié)酶的分子結構與功能一、酶的分子組成

酶分子可根據其化學組成的不同，分為兩類：

由酶蛋白與輔助因子組成的酶稱為全酶。

與酶蛋白疏松結合并與酶的催化活性有關的耐熱低分子有機化合物稱為輔酶。

與酶蛋白牢固結合并與酶的催化活性有關的耐熱低分子有機化合物稱為輔基。二、輔酶與輔基的來源及其生理功用

大部分的輔酶與輔基衍生于維生素。維生素的重要性就在于它們是體內一些重要的代謝酶的輔酶或輔基的組成成分。

維生素是指一類維持細胞正常功能所必需的，但在生物體內不能自身合成而必須由食物供給的小分子有機化合物。

維生素可按其溶解性的不同分為脂溶性維生素和水溶性維生素兩大類。

脂溶性維生素有VitA、VitD、VitE和VitK四種。水溶性維生素有VitB1，VitB2，VitPP，VitB6，VitB12，VitC，泛酸，生物素，葉酸等。

由維生素衍生的輔酶或輔基：1.TPP：焦磷酸硫胺素，由硫胺素（VitB1）焦磷酸化而生成，是脫羧酶的輔酶，在體內參與糖代謝過程中α-酮酸的氧化脫羧反應。

2.FMN和FAD：

黃素單核苷酸（FMN）和黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD），是核黃素（VitB2）的衍生物。VitB2具有氧化還原性，酶蛋白與FMN或FAD結合后統(tǒng)稱為黃素酶，催化脫氫氧化反應，其輔基FMN或FAD在酶促反應中作為遞氫體（雙遞氫體）。

FMN和FAD的分子結構

3.NAD+和NADP+：

尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+，輔酶Ⅰ）和尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP+，輔酶Ⅱ）是Vit

PP的衍生物。在體內，由尼克酰胺參與構成的兩種輔酶均有氧化型（NAD+，NADP+）和還原型（NADH+H+，NADPH+H+）兩種形式。它們作為脫氫酶的輔酶，在酶促反應中起遞氫體的作用，為單遞氫體。

NAD+和NADP+的分子結構

4.磷酸吡哆醛和磷酸吡哆胺：

磷酸吡哆醛和磷酸吡哆胺是VitB6的衍生物，VitB6包括吡哆醇，吡哆醛和吡哆胺等三種形式。磷酸吡哆醛和磷酸吡哆胺可作為氨基轉移酶，氨基酸脫羧酶，半胱氨酸脫硫酶等的輔酶。

5.CoA：泛酸（遍多酸）在體內參與構成輔酶A（CoA），后者的結構成分為3‘-磷酸腺苷-5’-焦磷酸-泛酸-β-巰基乙胺。CoA中的巰基可與?；愿吣芰蝓ユI結合，在糖、脂、蛋白質代謝中起傳遞?；淖饔?，因此CoA是酰化酶的輔酶。

CH3C~SCoA

‖

OCoA的分子結構6.生物素：是噻吩與尿素相結合的駢環(huán)化合物，帶有一戊酸側鏈，有α,β兩種異構體。生物素是羧化酶的輔基，在體內參與CO2的固定和羧化反應。

7.四氫葉酸：

四氫葉酸（FH4）由葉酸衍生而來。四氫葉酸是體內一碳單位基團轉移酶系統(tǒng)中的輔酶，其N5和N10原子與一碳單位基團結合，與嘌呤和嘧啶的合成有關。

8.VitB12的衍生物：VitB12分子中含金屬元素鈷，故又稱為鈷胺素。VitB12在體內有多種活性形式。其中，5'-脫氧腺苷鈷胺素是體內的主要形式，它可參與構成多種變位酶的輔酶，甲基鈷胺素則是甲基轉移酶的輔酶，與膽堿等的合成有關。

輔酶與輔基的生理功用主要是：⑴運載氫原子或電子，參與氧化還原反應。⑵運載反應基團，如?；被?、烷基、羧基及一碳單位等，參與基團轉移。

三、金屬離子的作用1.穩(wěn)定構象：穩(wěn)定酶蛋白催化活性所必需的分子構象；2.構成酶的活性中心：作為酶的活性中心的組成成分，參與構成酶的活性中心；3.連接作用：作為橋梁，將底物分子與酶蛋白螯合起來。酶的活性中心四、酶的活性中心

酶分子上具有一定空間構象的部位，該部位化學基團集中，直接參與將底物轉變?yōu)楫a物的反應過程，這一部位就稱為酶的活性中心。

結合基團

活性中心內必需基團

催化基團

活性中心外必需基團

S-S活性中心外必需基團結合基團催化基團活性中心必需基團底物肽鏈活性中心酶活性中心示意圖活性中心:能結合并催化一定底物使之發(fā)生化學變化，位于酶分子表面的一部分區(qū)域?；钚灾行挠梢粭l或幾條多肽鏈上空間位置比較靠近的氨基酸殘基或其上的基團組成,這些基團包括:—COOH、—NH2、—OH、—SH和咪唑基等,按照功能可將這些基團分為結合基團和催化基團(影響底物化學鍵的穩(wěn)定性),統(tǒng)稱必需基團。此外還有一些活性中心外必需基團對穩(wěn)定酶分子的構象是必需的。第二節(jié)酶促反應的特點與機制

酶與一般催化劑的共同點包括：①能催化熱力學上允許進行的化學反應，而不能實現(xiàn)那些熱力學上不能進行的反應；②能縮短反應達到平衡所需的時間，而不能改變平衡點；③一般情況下，對可逆反應的正反兩個方向的催化作用相同。

一、酶促反應的特點（一）具有極高的催化效率：酶的催化效率可比一般催化劑高106～1020倍。如：H2O2→H2O+O2

H2O2酶為5×106mol；Fe2+

為6×10-4mol

催化反應歷程一般化學反應歷程：

SP

酶促反應歷程：

S+EESE+P

酶促反應的活化能（二）具有高度的底物特異性:

一種酶只作用于一種或一類化合物，以促進一定的化學變化，生成一定的產物，這種現(xiàn)象稱為酶作用的特異性。1．絕對特異性：一種酶只能作用于一種化合物，以催化一種化學反應，稱為絕對特異性。2．相對特異性：一種酶只能作用于一類化合物或一種化學鍵，催化一類化學反應，稱為相對特異性。3．立體異構特異性：一種酶只能作用于一種立體異構體，或只能生成一種立體異構體，稱為立體異構特異性。

（三）酶的催化活性是可以調節(jié)的：

許多因素可以影響或調節(jié)酶的催化活性，如代謝物、對酶分子的共價修飾，酶蛋白的合成改變等。二、酶促反應的機制（一）中間復合物學說：

酶催化時，酶活性中心首先與底物結合生成一種酶-底物復合物（ES），此復合物再分解釋放出酶，并生成產物。S+ESES+P

（二）誘導契合學說：當?shù)孜锱c酶接近時，底物分子可以誘導酶活性中心的構象發(fā)生改變，使之成為能與底物分子密切結合的構象。（三）與酶的高效率催化有關的因素：

1．趨近效應與定向作用；2．張力作用；3．酸堿催化作用；4．共價催化作用；5．酶活性中心的低介電區(qū)（表面效應）。第三節(jié)酶促反應動力學

酶反應動力學主要研究酶催化的反應速度以及影響反應速度的各種因素。在探討各種因素對酶促反應速度的影響時，通常測定其初始速度來代表酶促反應速度，即底物轉化量<5%時的反應速度。

一、底物濃度對反應速度的影響

（一）底物對酶促反應的飽和現(xiàn)象：

反應級數(shù)：（二）米氏方程式的推導：

Michaelis&Menten于1913年推導出了上述矩形雙曲線的數(shù)學表達式，即著名的米氏方程。

Vmax

?［Ｓ］ｖ＝

Ｋｍ＋［Ｓ］

（三）Km和Vmax的意義：1.當ν=Vmax/2時，Km=[S]。因此，Km等于酶促反應速度達最大值一半時的底物濃度。

2.Km可以反映酶與底物親和力的大小。Km越小，酶與底物的親和力越大。

3.可用于判斷反應級數(shù)：當[S]<0.01Km時，反應為一級反應；當[S]>100Km時，ν=Vmax，反應為零級反應；當0.01Km<[S]<100Km時，為混合級反應。

Km是酶的特征性常數(shù)：在一定條件下，某種酶的Km值是恒定的，因而可以通過測定不同酶（特別是一組同工酶）的Km值，來判斷是否為不同的酶。

5.Km可用來判斷酶的最適底物：當酶有幾種不同的底物存在時，通過測定酶在不同底物存在時的Km值，Km值最小者，即為該酶的最適底物。6.可用來確定酶活性測定時所需的底物濃度：當[S]=10Km時，ν=91%Vmax，此時即為最合適的測定酶活性所需的底物濃度。7.Vmax可用于計算酶的轉換數(shù)：當酶的總濃度和最大速度已知時，可計算出酶的轉換數(shù)，即單位時間內每個酶分子催化底物轉變?yōu)楫a物的分子數(shù)。（四）Km和Vmax的測定：

1.Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法：

2.Hanes作圖法：

二、酶濃度對反應速度的影響

當反應系統(tǒng)中底物的濃度足夠大時，酶促反應速度與酶濃度成正比，即ν=k[E]。三、溫度對反應速度的影響

一般來說，酶促反應速度隨溫度的增高而加快。但當溫度增加達到某一點后，由于酶蛋白的熱變性作用，反應速度迅速下降，直到完全失活。酶促反應速度隨溫度升高而達到一最大值時的溫度就稱為酶的最適溫度。

溫度對酶促反應速度的影響酶的最適溫度與實驗條件有關，因而它不是酶的特征性常數(shù)。低溫時由于活化分子數(shù)目減少，反應速度降低，但溫度升高后，酶活性又可恢復。

四、pH對反應速度的影響

觀察pH對酶促反應速度的影響，通常為一“鐘形”曲線，即pH過高或過低均可導致酶催化活性的下降。酶催化活性最高時溶液的pH值就稱為酶的最適pH。pH對酶促反應速度的影響

人體內大多數(shù)酶的最適pH在6.5～8.0之間。酶的最適pH不是酶的特征性常數(shù)。

pH對酶促反應速度的影響，其原因主要是由于pH的改變導致了酶的催化基團以及底物分子的解離狀態(tài)改變或者導致了酶蛋白的變性。

五、抑制劑對反應速度的影響

凡是能降低酶促反應速度，但不引起酶分子變性失活的物質統(tǒng)稱為酶的抑制劑(inhibitor)。按照抑制劑的抑制作用，可將其分為不可逆抑制作用(irreversibleinhibition)和可逆抑制作用(reversibleinhibition)兩大類。

（一）不可逆抑制作用：抑制劑與酶分子的必需基團共價結合引起酶活性的抑制，且不能采用透析等簡單方法使酶活性恢復的抑制作用就是不可逆抑制作用。

（二）可逆抑制作用：

抑制劑以非共價鍵與酶分子可逆性結合造成酶活性的抑制，且可采用透析等簡單方法去除抑制劑而使酶活性完全恢復的抑制作用就是可逆抑制作用?？赡嬉种谱饔冒ǜ偁幮浴⒎锤偁幮?、和非競爭性抑制幾種類型。

1.競爭性抑制（competitiveinhibi-tion)：抑制劑與底物競爭與酶的同一活性中心結合，從而干擾了酶與底物的結合，使酶的催化活性降低，稱為競爭性抑制作用。競爭性抑制的速度方程與圖形特征競爭性抑制的雙倒數(shù)圖形特征

競爭性抑制的特點：⑴競爭性抑制劑往往是酶的底物類似物或反應產物；⑵抑制劑與酶的結合部位與底物與酶的結合部位相同；⑶抑制劑濃度越大，則抑制作用越大；但增加底物濃度可使抑制程度減??；⑷動力學參數(shù)：Km值增大，Vm值不變。丙二酸對琥珀酸脫氫酶的競爭性抑制

磺胺類藥物對二氫葉酸合成酶的競爭性抑制

對氨基苯甲酸對氨基苯磺酰胺2．反競爭性抑制：

抑制劑不能與游離酶結合，但可與ES復合物結合并阻止產物生成，使酶的催化活性降低，稱酶的反競爭性抑制。反競爭性抑制的速度方程與圖形特征反競爭性抑制的雙倒數(shù)圖形特征

反競爭性抑制的特點：⑴反競爭性抑制劑的化學結構不一定與底物的分子結構類似；⑵抑制劑與底物可同時與酶的不同部位結合；⑶必須有底物存在，抑制劑才能對酶產生抑制作用；抑制程度隨底物濃度的增加而增加；⑷動力學參數(shù)：Km減小，Vm降低。3．非競爭性抑制：抑制劑既可以與游離酶結合，也可以與ES復合物結合，使酶的催化活性降低，稱為非競爭性抑制。

非競爭性抑制的速度方程與圖形特征非競爭性抑制的雙倒數(shù)圖形特征非競爭性抑制的特點：⑴非競爭性抑制劑的化學結構不一定與底物的分子結構類似；⑵底物和抑制劑分別獨立地與酶的不同部位相結合；⑶抑制劑對酶與底物的結合無影響，故底物濃度的改變對抑制程度無影響；⑷動力學參數(shù)：Km值不變，Vm值降低。

六、激活劑對反應速度的影響

能夠促使酶促反應速度加快的物質稱為酶的激活劑。酶的激活劑大多數(shù)是無機離子，如K+、Mg2+、Mn2+、Cl-等。

第四節(jié)酶的調節(jié)

生物體內的各種生理活動均以一定的物質代謝為基礎。為了適應某種生理活動的變化，需要對一定的代謝活動進行調節(jié)。通過對酶的催化活性的調節(jié)，就可以達到調節(jié)代謝活動的目的。可以通過改變其催化活性而使整個代謝反應的速度或方向發(fā)生改變的酶就稱為限速酶或關鍵酶。一、酶結構的調節(jié)

酶結構的調節(jié)是通過對現(xiàn)有酶分子結構的影響來改變酶的催化活性的調節(jié)方式。酶結構的調節(jié)是一種快速調節(jié)方式。

（一）變構調節(jié)（別構調節(jié)）：

某些代謝物能與變構酶分子上的變構部位特異性結合，使酶的分子構象發(fā)生改變，從而改變酶的催化活性以及代謝反應的速度，這種調節(jié)作用就稱為變構調節(jié)(allostericregulation)。具有變構調節(jié)作用的酶就稱為變構酶。凡能使酶分子變構并使酶的催化活性發(fā)生改變的代謝物就稱為變構劑。1．變構調節(jié)的機制：

變構酶一般是多亞基構成的聚合體，一些亞基為催化亞基，另一些亞基為調節(jié)亞基。當調節(jié)亞基或調節(jié)部位與變構劑結合后，就可導致酶的空間構象發(fā)生改變，從而導致酶的催化活性中心的構象發(fā)生改變而致酶活性的改變。

2．協(xié)同效應：

當變構酶的一個亞基與其配體（底物或變構劑）結合后，能夠通過改變相鄰亞基的構象而使其對配體的親和力發(fā)生改變，這種效應就稱為變構酶的協(xié)同效應。如果對相鄰亞基的影響是導致其對配體的親和力增加，則稱為正協(xié)同效應；反之，則稱為負協(xié)同效應。

觀察變構酶的底物濃度對酶促反應速度影響時，可發(fā)現(xiàn)ν～[S]為一“S”形曲線。這是由于底物對變構酶存在同促正協(xié)同效應。

當存在異促正協(xié)同效應時，“S”形曲線左移，酶促反應速度加快；當存在異促負協(xié)同效應時，“S”形曲線右移，酶促反應速度減慢。

3.變構調節(jié)的方式：變構酶通常為代謝途徑的起始關鍵酶，而變構劑則為代謝途徑的終產物。因此，變構劑一般以反饋方式對代謝途徑的起始關鍵酶進行調節(jié)，最常見的為負反饋調節(jié)。

4．變構調節(jié)的特點：⑴酶活性的改變通過酶分子構象的改變而實現(xiàn)；⑵酶的變構僅涉及非共價鍵的變化；⑶調節(jié)酶活性的因素為代謝物；⑷為一非耗能過程；⑸無放大效應。

（二）共價修飾調節(jié)：

酶蛋白分子中的某些基團可以在其他酶的催化下發(fā)生共價修飾，從而導致酶活性的改變，稱為共價修飾調節(jié)。共價修飾調節(jié)也是體內快速調節(jié)代謝活動的一種重要的方式。最常見的共價修飾方式有：磷酸化-脫磷酸化，-SH--S-S-，乙?；?脫乙酰化，腺苷化-脫腺苷化等。

1．共價修飾的機制：

共價修飾酶通常在兩種不同的酶的催化下發(fā)生修飾或去修飾，從而引起酶分子在有活性形式與無活性形式之間進行相互轉變。

2．共價修飾調節(jié)的方式：共價修飾調節(jié)一般與激素的調節(jié)相聯(lián)系，其調節(jié)方式為級聯(lián)反應。

3．共價修飾調節(jié)的特點：⑴酶以兩種不同修飾和不同活性的形式存在；⑵有共價鍵的變化；⑶受其他調節(jié)因素（如激素）的影響；⑷一般為耗能過程；⑸存在放大效應。

（三）酶原的激活：

處于無活性狀態(tài)的酶的前身物質就稱為酶原。酶原在一定條件下轉化為有活性的酶的過程稱為酶原的激活。酶原的激活過程通常伴有酶蛋白一級結構的改變。

胰蛋白酶/腸激酶

胰蛋白酶原————————→

胰蛋白酶

+N端6肽片段

酶原激活的機制為：酶原分子一級結構的改變導致了酶原分子空間結構的改變，使催化活性中心得以形成，故使其從無活性的酶原形式轉變?yōu)橛谢钚缘拿?。酶原激活的生理意義在于：保護自身組織細胞不被酶水解消化。

二、酶含量的調節(jié)

酶含量的調節(jié)是指通過改變細胞中酶蛋白合成或降解的速度來調節(jié)酶分子的絕對含量，影響其催化活性，從而調節(jié)代謝反應的速度。酶含量的調節(jié)是機體內遲緩調節(jié)的重要方式。

（一）酶蛋白合成的調節(jié)：

酶蛋白的合成速度通常通過一些誘導劑或阻遏劑來進行調節(jié)。凡能促使基因轉錄增強，從而使酶蛋白合成增加的物質就稱為誘導劑；反之，則稱為阻遏劑。

（二）酶蛋白降解的調節(jié)：通過調節(jié)酶的降解速度以控制酶的活性。三、同工酶的調節(jié)

在同一種屬中，催化活性相同而酶蛋白的分子結構，理化性質及免疫學性質不同的一組酶稱為同工酶(isoenzyme)。同工酶在體內的生理意義主要在于適應不同組織或不同細胞器在代謝上的不同需要。

乳酸脫氫酶同工酶（LDHs）為四聚體，在體內共有五種分子形式，即LDH1（H4），LDH2（H3M），LDH3（H2M2），LDH4（HM3）和LDH5（M4）。

心肌中以LDH1含量最多，LDH1對乳酸的親和力較高，因此它的主要作用是催化乳酸轉變?yōu)楸嵩龠M一步氧化分解，以供應心肌的能量。在骨骼肌中含量最多的是LDH5，LDH5對丙酮酸的親和力較高，因此它的主要作用是催化丙酮酸轉變?yōu)槿樗?，以促進糖酵解的進行。

第五節(jié)固定化酶的制備1、固定化酶的概念和優(yōu)點

固定化酶是指借助于物理和化學的方法把酶束縛在一定空間內并仍具有催化活性的酶制劑。廣義的固定化酶又包括固定化酶和固定化細胞兩類。

固定化酶在催化反應中具有如下優(yōu)點：①酶經固定化后，穩(wěn)定性有了提高；②可反復使用，提高使用效率、降低成本；③有一定機械強度，可進行柱式反應或分批反應，使反應連續(xù)化、自動化，適合于現(xiàn)代化規(guī)模的工業(yè)生產；④極易和產物分離，酶不混入產物中，簡化了產品的純化工藝。2、固定化酶的制備方法（1）吸附法使酶分子吸附于水不溶性的載體上，有物理吸附法及離子交換劑吸附法。用于物理吸附法的載體有高嶺土、磷酸鈣凝膠、多孔玻璃、等。用于離子吸附法的載體有CM-纖維素、DEAE-纖維素和DEAE－Sephadex、合成的大孔陽離子和陰離子交換樹脂等。

吸附法的優(yōu)點：

a操作簡單，可選用帶不同電荷和不同形狀的載體。

b固定化過程可能與純化過程同時實現(xiàn)，酶失活后載體仍可再生。

吸附法缺點：

a最適吸附酶量無規(guī)律遵循，對不同載體和不同酶的吸附條件不同，吸附量與酶活力不一定呈平行關系。

b酶與載體之間結合力不強，酶易于脫落，導致酶活力下降而污染產物。（2）共價結合法是將酶分子的活性基團與載體表面活潑基團之間經化學反應形成共價鍵的連接法。

共價結合法有數(shù)十種，如重氮化、迭氮化、酸酐活化法、異硫氰酸酯法、雙功能試劑反應等。優(yōu)點：酶與載體結合牢固，操作穩(wěn)定性良好。缺點：載體需活化，固定化操作復雜，反應條件較劇烈，酶易失活并產生空間位阻效應。（3）交聯(lián)法是用雙功能或多功能試劑使酶分子內或分子間彼此連接成網絡結構而使酶固定化的技術。有4種方法：交聯(lián)酶法酶與輔助蛋白交聯(lián)法吸附交聯(lián)法載體交聯(lián)法。

常用交聯(lián)劑有戊二醛、雙重氮聯(lián)苯胺-2，2’