一般毒性作用及其試驗與評價方法

一般毒性作用及其試驗與評價方法第一節(jié)急性毒性作用及其試驗與評價第二節(jié)亞慢性毒性作用及其試驗與評價方法第三節(jié)蓄積毒性作用及其試驗與評價第四節(jié)慢性毒性作用及其試驗與評價外來化學(xué)物在一定劑量、一定接觸時間和接觸方式下對實驗動物產(chǎn)生的綜合毒效應(yīng)稱為一般毒性作用。一般毒性作用根據(jù)接觸毒物的時間長短又可分為急性毒性、亞慢性毒性和慢性毒性。

一、急性毒性的概念二、急性毒性試驗的目的三、急性毒性試驗方法的要點四、急性毒性分級和評價第一節(jié)急性毒性作用及其試驗與評價方法急性毒性是指機(jī)體（實驗動物或人）一次或24h內(nèi)多次接觸外源化學(xué)物后在短期內(nèi)所產(chǎn)生的毒性效應(yīng)，包括一般行為和外觀改變、大體形態(tài)變化以及死亡效應(yīng)。

一、急性毒性的概念

1、急性接觸的次數(shù)（一次或多次）24h內(nèi)2、中毒效應(yīng)出現(xiàn)的時間（一般為7-28d）

急性毒性效應(yīng)一般是指機(jī)體接觸化學(xué)物后，在較短時間內(nèi)觀察到的毒性癥狀。

3、中毒效應(yīng)的強(qiáng)度急性毒性概念中的幾個問題1、測試和求出毒物的致死劑量以及其他急性毒性參數(shù)，通常以LD50為最主要的參數(shù)；2、初步評價毒物對機(jī)體的毒效應(yīng)特征、靶器官、劑量-反應(yīng)（效應(yīng)）關(guān)系和對人體產(chǎn)生損害的危險性；3、研究受試物在動物體內(nèi)的動力學(xué)變化規(guī)律；4、為亞慢性、慢性毒性試驗研究以及其他毒理試驗提供接觸劑量和觀察指標(biāo)選擇的依據(jù)。二、急性毒性試驗的目的急性毒性試驗可以得到的毒性參數(shù)：①絕對致死劑量或濃度(LD100或LCl00)②半數(shù)致死劑量或濃度(LD50或LC50)③最小致死劑量或濃度(MLD，LD01或MLC，LC01)④最大耐受劑量或濃度(MTD，LD0或MTC，LC0)

或稱為最大非致死劑量(MNLD)⑤急性毒性LOAEL(觀察到有害作用的最低劑量)⑥急性毒性NOAEL(未觀察到有害作用的劑量)急性毒性的下限參數(shù)，非致死性急性毒性作用為終點急性毒性的上限參數(shù)以死亡為終點通過病理組織學(xué)和中毒癥狀觀察等手段測定

包括實驗動物、染毒途徑、染毒劑量、觀察周期、觀察指標(biāo)的選擇、計算方法和評價等。一般來說，一個新化學(xué)物在研制初期就要進(jìn)行急性毒性試驗。如果急性毒性試驗通不過，則后面的所有試驗都不必進(jìn)行了。三、急性毒性試驗設(shè)計（一）實驗動物的選擇和要求盡量選擇急性毒性反應(yīng)與人近似的動物；易于飼養(yǎng)管理、試驗操作方便的動物；繁殖生育力較強(qiáng)，數(shù)量較大能夠保障供應(yīng)；價格較低，易于獲得的動物。實驗動物的選擇包括物種和品系、年齡、體重、數(shù)量等方面，必須按照其規(guī)范要求進(jìn)行。急性毒性試驗一般首先選擇哺乳動物，選擇兩種或兩種以上的動物。包括嚙齒類和非嚙齒類。嚙齒類以大鼠、小鼠為最常用。非嚙齒類以犬或猴最常用。急性毒性試驗所用大鼠的品系以Sprague-Dawley（SD）、Wistar為主，小鼠則以昆明種、NIH、ICR為多。1、實驗動物的物種和品系

昆明種小鼠

（KM小鼠）特點：體型小，產(chǎn)仔多，生長繁殖快，飼養(yǎng)管理方便，對環(huán)境的適應(yīng)性和對疾病的抵抗力強(qiáng)。廣泛應(yīng)用于藥理毒力病理和細(xì)菌學(xué)研究，以及生物制品和藥品的鑒定。NIH小鼠

特點：體型小，產(chǎn)仔多，生長繁殖快，飼養(yǎng)管理方便，對環(huán)境的適應(yīng)性和對疾病的抵抗力強(qiáng)。廣泛應(yīng)用于藥理毒力病理和細(xì)菌學(xué)研究，以及生物制品和藥品的鑒定。Wistar大鼠

特點：抗病力強(qiáng)，自發(fā)性腫瘤發(fā)病率低，多用于腫瘤、免疫、藥理、內(nèi)分泌。SD大鼠

特點：白色，產(chǎn)仔多，生長發(fā)育較Wistar大鼠快，對疾病的抵抗力較強(qiáng)，尤以對呼吸道疾病的抵抗力強(qiáng)。通常要求剛成年的動物，且為健康未受孕的動物。通常大鼠180～240g、小鼠18～25g、家兔2～2.5kg、豚鼠200～250g、Beagle犬4～6kg、雜種犬8～15kg。2、實驗動物的年齡和體重

通常要求為雌雄各半。但如有資料或預(yù)試驗發(fā)現(xiàn)試驗品對雌、雄動物毒效應(yīng)有明顯的性別差異，則應(yīng)單獨分別試驗并求出雌性和雄性動物各自的LD50值。3、實驗動物的性別

應(yīng)先進(jìn)行動物的給藥前檢疫觀察。大鼠、小鼠、豚鼠、兔的檢疫期為1周，犬、猴等適當(dāng)?shù)匮娱L至2～3周。設(shè)定檢疫期有兩個主要目的：一是讓外購來的實驗動物要適應(yīng)一段時間，減少環(huán)境和生理條件變化對試驗結(jié)果的影響；二是篩檢健康等不符合試驗要求的動物4、實驗動物的預(yù)檢

采用經(jīng)口途徑染毒，實驗動物胃腸道內(nèi)食物存留量對化學(xué)毒物的毒性可產(chǎn)生較明顯的干擾，因此在試驗給藥前應(yīng)作禁食處理。大鼠在前一天傍晚下班時或晚間將飼料撤掉。小鼠由于其消化吸收和代謝速度較快，可隔夜禁食也可禁食4h以上。5、實驗動物的給藥前禁食處理

恒定的溫度：22±3℃濕度：30~70%光照度：晝夜各半飼料合格、飲水合格、墊料合格

6、試驗動物的飼養(yǎng)環(huán)境不同的LD50計算方法對動物組數(shù)的要求有所不同，一般為5~7組。大、小鼠等小動物每組數(shù)量通常為不少于10只，家兔每組不少于8只，犬等大動物每組不少于6只。嚴(yán)格按照隨機(jī)分組進(jìn)行。（二）實驗動物分組與數(shù)量受試物的接受、分樣、保管、稱量、配制以及在此過程中嚴(yán)格的質(zhì)量保證是急性毒性試驗成功與否的重要環(huán)節(jié)。受試物的化學(xué)結(jié)構(gòu)、純度、雜質(zhì)成分、理化性質(zhì)特別是揮發(fā)性、溶解性等均需了解。計算試驗所需受試物的總量，一次備齊全部實驗的用量。應(yīng)以同一批號為宜。（三）受試物及處理（四）染毒劑量及分組一般推薦，染毒最大量為：①經(jīng)口20ml/kg（對空腹動物）；②經(jīng)皮2ml/kg（根據(jù)體表面積計算，限于染毒的準(zhǔn)確性）；③靜脈1ml/kg（5min以上）；④肌內(nèi)注射0.5ml/kg（一個部位）；⑤每眼0.01ml；⑥直腸0.5ml/kg；⑦吸入2mg/L；⑧鼻：猴或犬每鼻孔0.1ml。染毒途徑（exposureroutes）的選擇需考慮：1.

模擬人在生活和生產(chǎn)環(huán)境中實際接觸受試物的途徑和方式；2.有利于不同化學(xué)物之間急性毒性大小的比較；3.受試物的性質(zhì)和用途；4.

各種受試物毒性評價程序的要求等。（五）染毒方法

最常用的染毒途徑為經(jīng)口、經(jīng)呼吸道、經(jīng)皮及注射途徑。

吸收速率依次排列，一般是靜脈注射＞吸入＞肌內(nèi)注射＞腹腔注射＞皮下注射＞經(jīng)口＞皮內(nèi)注射＞經(jīng)皮。

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灌胃

是將液態(tài)受試化合物或固態(tài)、氣態(tài)化合物溶于某種溶劑中，配制成一定濃度，裝入注射器等定量容器，經(jīng)過導(dǎo)管注入胃內(nèi)。優(yōu)點：劑量準(zhǔn)確缺點：工作量大；可能損傷食道或誤入氣管；與人的接觸方式差異很大。1、經(jīng)口（胃腸道）染毒喂飼

將化合物拌入飼料和水中，需計算每日進(jìn)食量和飲水量，折算攝入劑量。優(yōu)點：符合人接觸化合物的方式缺點：可能拒食；揮發(fā)性化合物可使攝入量下降，且有經(jīng)過呼吸道吸入的可能；化合物易水解或與食物中的化學(xué)成分起反應(yīng)。

吞咽膠囊

將一定劑量受試化合物裝入藥用膠囊內(nèi)，強(qiáng)制放到動物的后咽部迫使動物咽下。家兔及貓、狗等大動物可用此法。優(yōu)點：劑量準(zhǔn)確，尤其適用于易揮發(fā)、易水解和有異味的化合物。研究生產(chǎn)條件下以氣體、蒸氣、粉塵、煙、霧等形式存在于車間空氣中的工業(yè)毒物，評價環(huán)境空氣污染物，以吸入為給藥途徑的藥物，常常采用經(jīng)呼吸道染毒的途徑。2、經(jīng)呼吸道染毒

靜式吸入

在固定體積的密閉容器中，加入定量的易揮發(fā)液態(tài)化合物或氣態(tài)化合物。將動物置于其中，一般2h。尤其是適用于小動物接觸易揮發(fā)液態(tài)化合物的急性毒性研究。優(yōu)點：設(shè)備簡單；操作方便；消耗化合物少缺點：柜內(nèi)空氣組成、環(huán)境條件不穩(wěn)定；化合物濃度難以恒定。動式吸入

染毒柜——空氣流動面罩吸入——避免化合物經(jīng)皮吸入

優(yōu)點：劑量準(zhǔn)確

缺點：裝置復(fù)雜；消耗大；可能造成污染經(jīng)皮膚染毒的方式：先使用化學(xué)法脫毛（常用脫毛劑為硫化鋇加滑石粉1：4或硫化鈉加淀粉1：4）或機(jī)械法脫毛（剪剃去毛），將動物脊柱兩側(cè)背毛脫去，去毛面積常為體表面積的10％。局部涂敷受試物并以玻璃紙覆蓋固定一定時間接觸染毒。3、經(jīng)皮膚染毒對注射藥品或需作比較毒性觀察的藥品進(jìn)行急性毒性試驗時，須作經(jīng)注射途徑染毒。注射途徑可分為靜脈注射或滴注、腹腔注射(ip)、肌內(nèi)注射(im)、皮下注射(sc)、皮內(nèi)注射(id)、椎管內(nèi)注射等。4、經(jīng)注射途徑染毒

1.查閱文獻(xiàn)：分析受試化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)和其理化性質(zhì)，依此查閱文獻(xiàn)，找出與受試化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)近似化合物的毒性資料，并以其LD50(LC50)值作為受試化合物的預(yù)期毒性中值。2.試驗：以文獻(xiàn)LD50為中值，取倍差，設(shè)3－4個梯度，找出大致的100%死亡和0%死亡的范圍。（LD10-90的范圍）。（六）染毒劑量設(shè)計3.正式試驗：

i＝（logLD100-logLD0）/（n-1）組距，即相鄰兩個劑量組對數(shù)差或相鄰組比值的對數(shù)值。一般設(shè)5－7個劑量組。123456LgLD0LgLD0+iLgLD0+2iLgLD0+3iLgLD0+4i???改良寇氏法（Karber）霍恩氏法（Horn）威爾氏法（Weil）概率單位法其他計算方法LD50計算方法對未知毒性的化學(xué)物，估計毒性較低時，預(yù)試驗也可以5g/kg劑量進(jìn)行摸索，來決定是否需正式求LD50。一般來說，化學(xué)物L(fēng)D50如大于5g/kg已表明毒性不大。我國藥品的毒理研究指導(dǎo)原則規(guī)定要以最大容積最高濃度給予動物后未見死亡，方可不進(jìn)一步試驗求出LD50值。急性毒性試驗除設(shè)立幾個劑量組外，是否設(shè)正常和溶劑對照組，根據(jù)需要確定。急性毒性試驗一般是以死亡為主要記錄內(nèi)容。除此之外還要注意：中毒體征及發(fā)生過程；死亡情況和時間分布；體重；病理形態(tài)學(xué)變化。（七）毒性作用觀察1、中毒體征及發(fā)生過程應(yīng)詳細(xì)觀察和記錄動物出現(xiàn)的中毒體征、發(fā)生時間和體征發(fā)展的經(jīng)過。機(jī)體對毒物作用的反應(yīng)可以表現(xiàn)出各個系統(tǒng)的特征。2、死亡情況和時間分布急性毒性試驗中實驗動物的死亡數(shù)是計算LD50值的依據(jù)，動物死亡數(shù)量每增加或減少一只都會對LD50值產(chǎn)生明顯影響，因此應(yīng)認(rèn)真觀察和記錄。分析中毒死亡時間的分布規(guī)律，也可以提供重要信息。

3、體重實驗動物體重變化指標(biāo)，可以反映動物中毒后綜合性整體變化，是一個比較客觀簡便的量化指標(biāo)。因此在觀察實驗動物中毒體征的同時，對存活動物應(yīng)定期多次稱量動物的體重變化，一般為每周1次或2次。體重可以反映動物中毒后的整體變化。對存活動物尤其是對低于LD50劑量組的存活動物。應(yīng)在觀察期28天內(nèi)稱量其體重的變化，以便了解受試物引起毒效應(yīng)的持續(xù)時間。4、病理檢查對死亡動物應(yīng)及時進(jìn)行大體解剖，肉眼觀察大體病理變化，如臟器外觀、大小、色澤的變化，有無充血、出血、水腫或其他改變，如有改變須取材作組織病理學(xué)檢查。對存活動物在觀察期結(jié)束時亦應(yīng)進(jìn)行解剖檢查，必要時做組織病理學(xué)檢查。高劑量組動物染毒后常在數(shù)分鐘或數(shù)十分鐘內(nèi)出現(xiàn)死亡，染毒以后應(yīng)即刻開始觀察動物的中毒表現(xiàn)和死亡情況。給藥當(dāng)天應(yīng)連續(xù)或多次觀察，以后可根據(jù)情況，每天2次或多次觀察直到試驗周期結(jié)束。急性毒性試驗觀察周期一般為7-28天。（八）觀察時間和周期

四、急性毒性分級和評價

LD50標(biāo)志著一個化合物毒性的大小，所以常用作急性毒性分級。毒性大小于LD50值成反比，LD50越小，毒性越大，反之，毒性越小。除了LD50以外，還應(yīng)當(dāng)報告LD5095%可信限范圍、急性毒作用帶等指標(biāo)，并盡可能詳盡描述中毒特征、癥狀表現(xiàn)、出現(xiàn)時間、死亡前兆、毒性作用的發(fā)生、發(fā)展、恢復(fù)經(jīng)過，以及體重、剖檢和病理學(xué)變化等。從而全面的對急性毒性做出評價。五、經(jīng)典急性毒性試驗的局限性1.消耗的動物量大2.獲得的信息有限3.測得的LD50僅僅是一個近似值4.在安全性評價中僅評價動物死亡和簡單的癥狀觀察是不夠的，更需要的是生理學(xué)、血液學(xué)及其它化驗檢查所提供的深入細(xì)致的毒性信息。一、基本概念二、試驗?zāi)康娜喡远拘栽囼炘O(shè)計及其評價第二節(jié)亞慢性毒性作用及其試驗與評價方法一、基本概念

亞慢性毒性作用是指實驗動物連續(xù)多日接觸較大劑量的外來化學(xué)物所出現(xiàn)的中毒效應(yīng)。試驗染毒期限應(yīng)為3～6個月，或一般為實驗動物生命期的1/10~1/30。如用小鼠，試驗期通常為3個月，大鼠3~6個月，狗4~12個月。動物研究期限相當(dāng)于壽命期(％)和人染毒的時間物種研究期限(月)相當(dāng)于壽命期(％)

研究期限(月)相當(dāng)于人(月)13612241361224大鼠4.112.025.0499934101202404808兔1.44.59.018.36123672145289狗0.822.54.99.8206.5204081162豬0.822.54.99.8206.5204081162猴0.551.63.36.6134.5132761107二、試驗?zāi)康模?）進(jìn)一步探索受試物的毒作用特點和靶器官；（2）了解受試物有無蓄積作用，是否產(chǎn)生耐受性；（3）分析受試物的劑量-效應(yīng)關(guān)系；（4）初步估計不出現(xiàn)毒性作用的最大耐受劑量（NOEL或NOAEL）和出現(xiàn)毒性的最小有作用劑量（MED）；（5）為慢性毒性試驗的劑量設(shè)計和觀察指標(biāo)提供依據(jù)；（6）為受試物的毒理機(jī)制提供基礎(chǔ)資料。三、亞慢性毒性試驗設(shè)計在遺傳毒理學(xué)及一些前期的試驗難以做出明確評價時需要進(jìn)行亞慢性毒性試驗。根據(jù)前期的試驗結(jié)果來設(shè)計亞慢性毒性試驗，其試驗的周期從幾個月到一年不等。在整個亞慢性試驗期間，動物均應(yīng)攝食試驗飼料。受試物可摻入飼料中，也可摻入飲水中。不得巳時可采用灌胃法進(jìn)行。（l）物種和品系一般要求兩種實驗動物，一種是嚙齒類，一種是非嚙齒類，以便全面地了解受試物的毒性?；旧暇褂么笫蠛腿袝r用猴，這取決于受試物的重要性和試驗條件。亞慢性經(jīng)皮毒性試驗，可用兔或豚鼠。大鼠常用Wistar和Sprague-Dawley。犬的亞慢性毒性試驗多使用Beagle犬。1、實驗動物的選擇（2）性別、年齡和動物數(shù)

性別：一般每組雌雄各半；年齡：剛斷乳不久的動物大鼠6～8周齡（體重80～100g）動物數(shù)：大鼠、小鼠每組不少于20只；犬、猴每組不少于6只。（3）微生物學(xué)寄生蟲學(xué)等級和飼養(yǎng)環(huán)境亞慢性毒性試驗周期較長，觀察指標(biāo)較多，實驗動物的質(zhì)量、喂飼條件和試驗環(huán)境明顯影響受試物的毒性反應(yīng)。實驗動物分四級：普通級、清潔級、無特定病原體級（SPF級）、無菌級。犬和猴分為普通級和SPF兩級。亞慢性毒性試驗，應(yīng)使用清潔級及以上等級大小鼠，并飼養(yǎng)在屏障環(huán)境內(nèi)進(jìn)行試驗。2、染毒方式

一是應(yīng)當(dāng)盡量選擇和人類接觸途徑相似的方式；二是應(yīng)當(dāng)與預(yù)期進(jìn)行的慢性毒作用研究的接觸途徑相一致。一般以經(jīng)口、經(jīng)呼吸道和經(jīng)皮染毒為多。染毒頻率通常每日一次，連續(xù)給予，如試驗期為3個月或超過3個月時，也可每周6次。3、染毒途徑

（l）經(jīng)口染毒：灌胃法、喂飼法、膠囊法。（2）經(jīng)呼吸道染毒：（3）注射：（4）特殊途徑：（5）在進(jìn)行亞慢性毒性試驗時，最好結(jié)合進(jìn)行毒代動力學(xué)血藥濃度的監(jiān)測。4、劑量選擇和分組一般至少應(yīng)設(shè)3個劑量組和1個陰性（溶劑）對照組。低劑量組中劑量組高劑量組陰性對照組組距：3~10倍，最低不小于2倍高劑量組應(yīng)能引起明顯的毒性或少量動物的死亡（少于10%）。低劑量組應(yīng)無中毒反應(yīng)，相當(dāng)于未觀察到損害作用劑量（NOAEL）。高低劑量組間設(shè)置1個中劑量組，比較理想的中劑量組約相當(dāng)于觀察到有害作用的最低劑量（LOAEL）。原則是，盡量控制在受試動物在整個試驗期既不發(fā)生死亡，又有明顯毒性反應(yīng)。各組劑量設(shè)計的依據(jù)：①高劑量組：以急性毒性的閾劑量作為亞慢性毒性試驗的最高劑量?；蛞栽撌茉囄風(fēng)D50的1/20～1/5作為最高劑量②一般在LD50的1/10～1/50之間按等比級數(shù)設(shè)計其它各組。5.觀察指標(biāo)1234（1）一般性指標(biāo)包括每日采食量、體重變化（定期稱量）、外觀特征（被毛光澤、精神狀態(tài)、呼吸動作、分泌物、排泄物、飲食、活動、行為等）、異常表現(xiàn)和中毒癥狀等。食物利用率：記錄每日飼料消耗量，計算食物利用率（每攝入100g飼料所增長的體重克數(shù)）。體重減少是影響了食欲還是消化和吸收。（2）生理生化指標(biāo)l）血液學(xué)檢查2）血液生化檢查通常為血清天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、堿性磷酸酶（ALP）、尿素氮（BUN）、總蛋白（TP）、清蛋白（ALB）、血糖（GLU）、總膽紅素（T-BIL）、肌酐（Crea）、總膽固醇（T-CHO）等。尿液檢查包括外觀、pH值、蛋白、糖、潛血和沉淀物鏡檢等，可提供與毒物有關(guān)的靶器官毒性和中間代謝產(chǎn)物的信息。（3）系統(tǒng)剖檢和組織病理學(xué)檢查

動物固定在解剖板上，解剖頸部(頜下腺、腮腺、局部淋巴結(jié)等)↓

取一側(cè)乳腺及腹部皮膚；開腹并擴(kuò)展切口(胰、脾、生殖器官、腎、腎上腺、直腸、胃、十二指腸、空腸、回腸、腸系膜淋巴結(jié)、肝臟等)↓

開胸(舌、喉、氣管、甲狀腺、甲狀旁腺、食管、心、肺、胸腺)↓

剝離左后肢(肌肉、坐骨神經(jīng)、股骨)；頭皮、耳；↓開顱(顱神經(jīng)、腦組織、垂體)；暴露脊髓(取出脊髓)1）系統(tǒng)解剖：包括肉眼觀察2）臟器重量和臟器系數(shù)一般稱取心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、卵巢或睪丸、腦等臟器濕重，并計算其臟器系數(shù)。也稱臟體比值，是指某個臟器的濕重與單位體重的比值，通常以100g或1g體重計。此指標(biāo)的意義是實驗動物在不同年齡期，其各臟器與體重之間重量比值有一定規(guī)律；若受試化合物使某個臟器受到損害，則此比值就會發(fā)生改變。臟體比值是一個靈敏、有效和經(jīng)濟(jì)的指標(biāo)。

3）病理學(xué)檢查目的是確定化學(xué)毒物對機(jī)體毒作用的靶部位、損害的性質(zhì)和程度。病理學(xué)檢查包括：大體檢查、常規(guī)組織病理學(xué)檢查、酶組織化學(xué)檢查、免疫組織化學(xué)檢查、細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)檢查等。四、亞慢性毒性作用評價數(shù)據(jù)分析對試驗組和對照組數(shù)據(jù)根據(jù)統(tǒng)計學(xué)方法處理，看是否有顯著差異、劑量－效應(yīng)關(guān)系和時間－效應(yīng)關(guān)系。以及各項指標(biāo)之間的相關(guān)性。如某物質(zhì)的亞慢性毒性無作用劑量（NOAEL）小于或等于人的可能攝入量的100倍，則表示毒性很強(qiáng)，應(yīng)放棄該化學(xué)物的使用：在100～300倍之間者，可進(jìn)行慢性毒性試驗；若大于或等于300倍者則不必進(jìn)行慢性試驗，可直接進(jìn)行毒性評價。一、蓄積毒性作用的基本概念

二、蓄積作用的研究方法第三節(jié)蓄積毒性作用一、基本概念

多次間隔給予小劑量受試物，當(dāng)給予受試物的時間間隔和劑量超過機(jī)體的解毒和排泄能力時，導(dǎo)致受試物在體內(nèi)蓄積，由此引起的毒性作用稱為蓄積毒性作用。1.了解受試物是否具有蓄積作用及蓄積性大小如何;2.評定該化合物是否可引起潛在的慢性毒性危害;3.為制訂該物質(zhì)在食品中的衛(wèi)生限量標(biāo)準(zhǔn)時，安全系數(shù)的選擇提供依據(jù)。4.確定該受試物是否可以用于食品供人類長期食用。（二）目的：物質(zhì)蓄積：是指機(jī)體少量反復(fù)多次接觸毒物后，該毒物在機(jī)體內(nèi)逐漸積累?？梢杂靡欢ǖ姆治龇椒z測出體內(nèi)該物質(zhì)或其代謝產(chǎn)物在體內(nèi)的增加過程，這種累計隨著時間延長而含量增加，當(dāng)達(dá)到中毒閾值時而產(chǎn)生毒性作用。功能蓄積：是指機(jī)體少量反復(fù)多次接觸化學(xué)毒物或其他形式的危害物，每次引起的輕微功能損害逐漸積累，當(dāng)積累到一定程度時出現(xiàn)毒性效應(yīng)，而這時用檢測手段卻查不出體內(nèi)毒物的的存在或增加。蓄積毒性作用產(chǎn)生的因素（1）與接觸劑量大小和時間間隔有關(guān)（2）與毒物本身的性質(zhì)有關(guān)脂溶性物質(zhì)水溶性物質(zhì)貯存庫：如血漿蛋白、脂肪組織、肝臟、腎臟、骨骼等是某些毒物的常見貯存庫。（3）與動物種屬的代謝特點有關(guān)二、蓄積作用的研究方法

蓄積毒性作用的研究方法有多種，常用方法有蓄積系數(shù)法和生物半減期法。（一）蓄積系數(shù)法蓄積系數(shù)是多次染毒使半數(shù)動物出現(xiàn)效應(yīng)（或死亡）的蓄積劑量［ED50(n)］與一次染毒使半數(shù)動物出現(xiàn)相同效應(yīng)（或死亡）的劑量[ED50(1)]的比值，即：在毒理學(xué)中研究化學(xué)毒物蓄積作用多選擇動物來進(jìn)行，以動物死亡一半為效應(yīng)指標(biāo)，那么上式可改寫為：

∑LD50(n)K=LD50(1)K值越小，表示化學(xué)毒物的蓄積性越大。實驗動物對化學(xué)毒物發(fā)生過敏現(xiàn)象，則可能出現(xiàn)K<1。隨著化學(xué)毒物蓄積作用減弱，K值增加，通常認(rèn)為K≥5，其蓄積毒性極弱。1、固定劑量法測定蓄積系數(shù)法常選用大、小鼠等小型實驗動物，染毒途徑多用經(jīng)口灌胃或腹腔注射。先求出某毒物的LD50，然后選取相同條件的40只（或更多）實驗動物，隨機(jī)分為兩組：染毒試驗組和對照組，每組至少20只，雌雄各半。在1/20～1/5LD50的范圍內(nèi)選定一個劑量，每日以固定劑量，定時和相同途徑對試驗組進(jìn)行染毒，觀察記錄動物死亡數(shù)。當(dāng)試驗組累積發(fā)生一半動物死亡即可終止試驗。此時，計算累積總接觸劑量，根據(jù)公式計算K值，然后依上表進(jìn)行評價。若接觸劑量已累積達(dá)到5個LD50劑量，也可終止試驗，此時計算出K＞5。固定劑量法試驗期為25～100天。2、劑量遞增法

試驗方案同上，實驗開始時按0.1LD50劑量給予試驗組染毒，以4天為一期，每期增加1.5倍。第一個四天按0.1LD50×4天第二個四天按0.15LD50×4天第三個四天按0.22LD50×4天……依次類推。這一方案試驗期最長28天。在試驗期間，當(dāng)化學(xué)毒物引起動物累積死亡一半時即可終止試驗，計算K值進(jìn)行評價。一般來說，在試驗第21天也可結(jié)束試驗，因為這之前如果動物沒有死亡或死亡數(shù)不足一半，說明其累積量已達(dá)5.26LD50，即K＞5。3、劑量固定的20天蓄積法該法是基于蓄積系數(shù)的原理而設(shè)計的。它通常采用經(jīng)口灌胃染毒方式，將動物隨機(jī)分為5個組，包括陰性對照組和1/20LD50、l/10LD50、l/5LD50和1/2LD50四個劑量組，每組動物數(shù)10只，雌雄各半。每日染毒一次，連續(xù)染毒20天。觀察每組雌雄合計的死亡動物數(shù)量。試驗結(jié)束時根據(jù)下列標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評定：①1/20LD50組有死亡，且各組呈劑量-反應(yīng)關(guān)系，則為強(qiáng)蓄積性；②1/20LD50組無死亡，且各組呈劑量-反應(yīng)關(guān)系，則為中等蓄積性；③1/20LD50組無死亡，各組也不呈劑量-反應(yīng)關(guān)系，則為無明顯蓄積性；④如僅1/2LD50組有死亡，其他組均無死亡，則為弱蓄積性。（二）生物半減期法

生物半減期(BiologicalHalf-life,BL,T1/2)，指化學(xué)物質(zhì)進(jìn)入體內(nèi)以后，在體內(nèi)每減少一半所需的時間。對同一化合物在同一種動物體內(nèi)是一恒值。生物半減期法（t1/2）是用毒物動力學(xué)原理描述化學(xué)毒物在機(jī)體內(nèi)的蓄積作用。化學(xué)毒物在體內(nèi)蓄積的速度和量與機(jī)體單位時間內(nèi)吸收該物質(zhì)的速度以及清除速度有關(guān)。一般來說，tl/2較短的化學(xué)毒物達(dá)到蓄積極限所需的時間也短，t1/2長者達(dá)到蓄積極限的時間也長。一種化學(xué)毒物若以tl/2相等的時間間距染毒，其在體內(nèi)經(jīng)過6個t1/2的接觸期就可以基本上達(dá)到蓄積的極限，此時理論蓄積量達(dá)到極限的98.4％。此后即使繼續(xù)接觸該物質(zhì)，機(jī)體內(nèi)的蓄積量基本上也不會增加。蓄積過程:

第一個BL(T1/2)末蓄積量=L×50%

第二個BL(T1/2)末蓄積量=L×75%

第三個BL(T1/2)末蓄積量=L×87.5%

第四個BL(T1/2)末蓄積量=L×93.75%

第五個BL(T1/2)末蓄積量=L×96.88%

第六個BL(T1/2)末蓄積量=L×98.44%

一般經(jīng)過6個生物半減期即可達(dá)蓄積極限值根據(jù)tl/2=0.693Ke，通過動物血漿中化學(xué)毒物濃度求得tl/2。蓄積極限值A(chǔ)∞——蓄積極限值（mg）a——單位時間內(nèi)毒物的吸收量（mg/d）T1/2——生物半減期（d）應(yīng)用：可根據(jù)一個化合物的t1/2值，計算出它在人體內(nèi)達(dá)到的A∞值，并可計算出達(dá)到Ｌ值所需的時間一、慢性毒性的概念二、慢性毒性試驗的目的三、慢性毒性試驗方法要點四、慢性毒性試驗的注意事項第四節(jié)慢性毒性試驗設(shè)計

一、慢性毒性的概念

是指實驗動物或人長期（甚至終生）反復(fù)接觸外源化學(xué)物所產(chǎn)生的毒性效應(yīng)。所謂“長期”，一般是指2年。對大鼠相當(dāng)于終生染毒，對兔相當(dāng)于生命期的36