桑黃菌絲液體培養(yǎng)及多糖提取工藝優(yōu)化研究報(bào)告

第一篇桑黃菌絲培養(yǎng)及多糖提取工藝優(yōu)化第1章緒論1.1前言桑黃是目前國(guó)際公認(rèn)的抗腫瘤效果最好的大型真菌之一，巴西蘑菇即姬松茸與其療效相近。由于用于一般化學(xué)療法的抗癌劑的毒性強(qiáng)，對(duì)癌癥患者正常體細(xì)胞也具有殺傷作用，而桑黃多糖則幾乎沒(méi)有毒性，其通過(guò)提高機(jī)體免疫能力，殺傷癌細(xì)胞，這是真菌多糖抗癌的一大優(yōu)點(diǎn)。桑黃多糖能明顯提高患者的免疫能力，當(dāng)與一般的抗癌化學(xué)療法并行使用時(shí)，可以進(jìn)一步提高治療效果。因此桑黃的研究以及開(kāi)發(fā)利用越來(lái)越熱[1]。桑黃最早在日本及韓國(guó)得到開(kāi)發(fā)利用，現(xiàn)已開(kāi)始小批量人工栽培。由于天然的桑黃數(shù)量非常稀少，難以成為穩(wěn)定的工業(yè)產(chǎn)品來(lái)源，韓國(guó)一制藥公司已率先開(kāi)發(fā)出桑黃菌絲體培養(yǎng)法新技術(shù)，人工生產(chǎn)桑黃活性物質(zhì)，并將其提取物用凍干法加工成粉末。由于抗癌效果顯著，桑黃提取物干粉在韓國(guó)市場(chǎng)的售價(jià)高達(dá)每克2000多美元。日本一家專(zhuān)門(mén)從事生藥加工的醫(yī)藥企業(yè)“津村株式會(huì)社”將人工培植的桑黃子實(shí)體加工成“破壁細(xì)胞超微粉末”，生產(chǎn)的“桑黃”(超微)粉末膠囊每瓶(288粒)售價(jià)高達(dá)3萬(wàn)日元。據(jù)統(tǒng)計(jì)，僅日、韓兩國(guó)市場(chǎng)2002年各種桑黃劑的銷(xiāo)售額合計(jì)已逾100億日元。美國(guó)在本世紀(jì)初開(kāi)始從日本進(jìn)口桑黃制劑作為膳食補(bǔ)充劑在本土銷(xiāo)售。我國(guó)吉林省延吉市憑借獨(dú)有的地域優(yōu)勢(shì)，現(xiàn)已開(kāi)發(fā)出復(fù)合桑黃口服液，主要銷(xiāo)往日本及韓國(guó)，在當(dāng)?shù)匾灿幸欢ǖ南M(fèi)市場(chǎng)。根據(jù)目前所掌握的資料，由于外商需求量大，價(jià)格高，致使國(guó)內(nèi)各產(chǎn)地進(jìn)行掠奪性開(kāi)采，子實(shí)體孢子無(wú)法大量形成。結(jié)果造成該資源在東北地區(qū)已經(jīng)難覓蹤影，西北也即將枯竭。再加上我國(guó)天然的桑黃數(shù)量本來(lái)就非常稀少，子實(shí)體的人工栽培尚處于起步階段，所以要想形成穩(wěn)定的醫(yī)藥工業(yè)產(chǎn)品來(lái)源，就必須充分挖掘桑黃的自然資源，深入開(kāi)展桑黃的人工栽培；另外還要進(jìn)行菌種的分離培養(yǎng)，利用現(xiàn)代生物技術(shù)進(jìn)行深層發(fā)酵。同時(shí)，應(yīng)進(jìn)一步測(cè)定桑黃提取物中的有效成分，探索其與菌種、菌齡以及培養(yǎng)條件的關(guān)系，確定桑黃有效成分在提高人體免疫機(jī)能、疾病的預(yù)防和治療等方面的作用機(jī)制，使桑黃能夠早日應(yīng)用于人類(lèi)的醫(yī)療保健事業(yè)[2]。1.2簡(jiǎn)介桑黃1.2.1桑黃的名稱(chēng)及分類(lèi)桑黃（Phellinusigniarius、Phellinuslinteus和Phellinusbaumi）別名：火木層孔菌、針裂蹄（裂蹄）和鮑氏層孔菌。桑黃菌是一種多年生珍稀藥用真菌，屬擔(dān)子菌綱(Basidiomycetes)、多孔菌目(Polyporales)、多孔菌科(Polyporaceae)，木層孔菌屬(Phellinus)[3]。桑黃子實(shí)體中等至較大，無(wú)柄。菌蓋半球形，剖面扁平至馬蹄形，深煙色至黑色，有同心紋和環(huán)棱，初期有微細(xì)絨毛，后變光滑、稍龜裂，硬而木質(zhì)化，2~12cm×3~21cm，厚1.5~10cm，邊緣銳或鈍，其下側(cè)無(wú)子實(shí)層。菌肉深咖啡色、銹褐色或淺咖啡色，厚2~7mm。桑黃生于楊、柳、樺、桃等闊葉樹(shù)的枯立木及立木上及樹(shù)干上[4]。固因其著生樹(shù)種不同，分為桑樹(shù)桑黃、楊樹(shù)桑黃和樺樹(shù)桑黃等品種。其中，桑樹(shù)桑黃子實(shí)體入藥最佳。1.2.2桑黃的分布桑黃主要分布于中國(guó)、日本、菲律賓、澳大利亞、北美、中南美等地。在國(guó)內(nèi)，桑黃分布于河北、山西、內(nèi)蒙古、黑龍江、吉林、臺(tái)灣、河南、廣東、陜西、寧夏、甘肅、青海、新疆、四川、云南等地，即集中分布區(qū)在黑龍江省東部烏蘇里江與興凱湖之間，西北地區(qū)陜西與甘肅交界的“子午嶺”自然保護(hù)區(qū)，國(guó)外主要在日本、韓國(guó)、俄羅斯等國(guó)家分布。1.3桑黃的研究進(jìn)展1.3.1桑黃藥用功能的研究進(jìn)展（1）抗腫瘤作用桑黃的抗癌功能最早被日本學(xué)者等發(fā)現(xiàn)，研究表明桑黃野生子實(shí)體的提取物對(duì)小鼠肉瘤180的抑制率為96.7%。研究還表明具有抗癌作用的物質(zhì)是桑黃子實(shí)體中的多糖。（2）提高免疫力Hwan-MookKIM等用P.linteus的菌絲體胞外多糖（EPS）進(jìn)行免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)EPS不僅能夠使T細(xì)胞增殖，而且對(duì)不同同類(lèi)抗原的T細(xì)胞也有增殖作用，并且毒性T淋巴細(xì)胞的毒性在加桑黃胞外多糖（EPS）后大大增強(qiáng)。Yun-HeeShon等發(fā)現(xiàn)桑黃提取物可以誘導(dǎo)相解毒酶包括苯醌氧化還原酶（QR）和谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶（GST）的活性，并且提高了谷胱甘肽的水平。張萬(wàn)國(guó)[5]等對(duì)桑黃子實(shí)體提取物對(duì)人外周血單個(gè)核細(xì)胞（PMNCs）產(chǎn)生C-干擾素（IFN-C）的研究表明桑黃具有誘生IFN-C的能力，能顯著增高小鼠的血清IFN-C水平，有利于其發(fā)揮調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力，抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用。（3）抗突變作用Shon[6]等用桑黃提取物的抗突變實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，提取物可有效的抑制誘變劑對(duì)沙門(mén)氏菌的誘變作用。（4）抗血管生成試驗(yàn)Yun-SeonSong等在小雞胚胎絨膜尿囊膜（CAM）試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)隨桑黃提取物加量的增加抑制效果增加，說(shuō)明提取物有較好的抗血管生成活性。（5）清除自由基的功能Yun-SeonSong等在清除自由基1-(2，6-二甲基苯氧基)-2-(3，4-二甲氧基苯乙氨基)丙烷鹽酸鹽(DDPH)的試驗(yàn)和體外抑制脂類(lèi)過(guò)氧化反應(yīng)的試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)提取物有較好的清除自由基DDPH活性。（6）抑制黃嘌呤氧化酶活性（治療痛風(fēng)）Yun-SeonSong等在黃嘌呤氧化酶抑制試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)提取物能夠完全抑制尿酸（尿酸鹽微結(jié)晶沉積于關(guān)節(jié)而引起局部粒細(xì)胞浸潤(rùn)及炎癥反應(yīng)的生成），有效的抑制黃嘌呤氧化酶的活性。（7）肝纖維化抑制作用張萬(wàn)國(guó)等發(fā)現(xiàn)桑黃子實(shí)體提取物能顯著降低血漿粘度和紅細(xì)胞聚集指數(shù)，并且能提高肝損傷大鼠的蛋白質(zhì)合成能力，顯著降低血清氨基酸轉(zhuǎn)移酶水平和膠原成分含量，使桑黃組肝細(xì)胞變性減輕，肝纖維增生減少。（8）抗脂質(zhì)過(guò)氧化作用用CCl4誘導(dǎo)大鼠肝纖維化過(guò)程中，脂質(zhì)過(guò)氧化是其主要的肝損傷機(jī)制。模型組大鼠血清活性氧顯著升高，肝組織脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA大量生成SOD活性受到明顯抑制。桑黃雖然不能明顯減少M(fèi)DA的生成，但可以一定程度提高SOD活性，并且使血清中活性氧明顯降低，表現(xiàn)出較好的清除氧自由基作用。（9）降血糖作用Kim[7]等用桑黃多糖喂用鏈脲霉素導(dǎo)致的糖尿病大鼠，結(jié)果顯示：桑黃多糖能夠降低血糖，同時(shí)減少總膽固醇、三酰甘油和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶。這個(gè)結(jié)果讓我們相信桑黃多糖在治療人類(lèi)糖尿病上將有所作為。（10）抗肺炎作用Beon-SuJang[8]等用桑黃提取物預(yù)處理大鼠的實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)桑黃提取物能夠抑制肺炎大鼠炎癥細(xì)胞包括嗜中性粒細(xì)胞的數(shù)量及白介素(IL)-1β的水平。這個(gè)結(jié)果表明：桑黃提取物在抑制人類(lèi)急性肺炎方面可能會(huì)有很大的作用。1.3.2桑黃化學(xué)成分的研究進(jìn)展研究發(fā)現(xiàn)桑黃的菌絲體多糖和胞外多糖的分子量及分子結(jié)構(gòu)是不同的。（1）子實(shí)體中的化學(xué)成分有資料報(bào)道P.1igniarius的菌體內(nèi)含落葉松蕈酸(菌絲體內(nèi)不含該成分)、藜蘆堿、蘑菇酸、間位二甲氧苯二甲酸等脂肪酸、麥角甾醇、過(guò)氧化物酶、氨基酸等成分，還有報(bào)道說(shuō)P.1igniarius中木質(zhì)纖維素的生物轉(zhuǎn)化。莫順燕等首次從P.1igniarius中分離得到5個(gè)黃酮和2個(gè)香豆素類(lèi)化合物，分別為柚皮素(4′，5，7-三羥基二氫黃酮)、櫻花亭(4′，5-二羥基-7-甲氧基二氫黃酮)、二氫莰非素(4′，5，7-三羥基二氫黃酮醇)、7-甲氧基二氫莰非素(4′，5-二羥基-7-甲氧基二氫黃酮醇)、北美圣草素(3′，4′，5，7-四羥基二氫黃酮醇)、香豆素(苯并吡喃-2-酮)及莨菪亭(7-羥基-6-甲氧基苯并吡喃-2-酮)；后來(lái)又分離得到兩個(gè)新的二氫黃酮衍生物，分別為5，7，4′-三羥基-6-鄰羥芐基二氫黃酮和5，7，4′-2三羥基-8-鄰羥芐基二氫黃酮。Gi-YoungKim等在桑黃子實(shí)體中通過(guò)DEAE纖維素陰離子交換和凝膠層析提取得到一種酸性蛋白多糖，在瓊脂糖凝膠CL-4B層析色譜分析中可以測(cè)得該多糖分子量在150kDa左右。其氨基酸種類(lèi)主要有天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、甘氨酸和丙氨酸。用高壓氣相色譜儀測(cè)得該蛋白雜多糖中的糖鏈主要由甘露糖、半乳糖、葡萄糖、樹(shù)膠醛醣和木糖組成，其中碳鏈主鏈為己糖，戊糖為小部分構(gòu)成側(cè)鏈。用紅外吸收光譜分析其官能團(tuán)，并進(jìn)行1H和13C核磁共振測(cè)定。得知該多糖同時(shí)存在α-糖苷鍵和β-糖苷鍵，多糖以B-(1→3)-D-葡萄糖為主鏈，以B-(1→6)-D-葡萄糖為側(cè)鏈，是一種蛋白雜多糖。（2）菌絲體及發(fā)酵液中的化學(xué)成分據(jù)資料報(bào)道，液體培養(yǎng)P.1igniarius菌絲體中含有甾醇類(lèi)物質(zhì)、蟲(chóng)草酸等，其液體發(fā)酵培養(yǎng)菌絲體中經(jīng)分析得到二丁基羥基甲苯、棕櫚酸、9，12-十八碳二烯酸甲酯、二十碳烷、二十六碳烷5種化學(xué)物質(zhì)。Lee等實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)桑黃胞外多糖有四種組分，分子量范圍為9400～15000，其單糖成分主要由甘露糖(3%～12%)、半乳糖(2%～10%)、葡萄糖(80%～95%)組成，該多糖還存在少量由天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸組成的蛋白質(zhì)。Hye-JinHwang等對(duì)桑黃胞外多糖的組分及分子結(jié)構(gòu)作了進(jìn)一步的研究，實(shí)驗(yàn)中用體積排除色譜(SEC)和多角度激光散射儀(MALLS)聯(lián)用測(cè)定桑黃菌絲體胞外多糖(EPS)。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)EPS中有三種組分(Fr-Ⅰ，F(xiàn)r-Ⅱ和Fr-Ⅲ)。用氣相色譜測(cè)定EPS組成得出EPS的三種組分為不含蛋白質(zhì)部分的多糖，主要由甘露糖、半乳糖和葡萄糖組成。根據(jù)洗脫體積對(duì)組分分布量的圖中得出Fr-Ⅰ，F(xiàn)r-Ⅱ和Fr-Ⅲ的分子量分別為433400(±7801)Da，31470(±283)Da和12950(±90)Da，并計(jì)算出各組分的分子量分布，得出Fr-Ⅰ為多分散組分，分子量分布跨度較大，F(xiàn)r-Ⅱ和Fr-Ⅲ為單分散組分，分子量分布跨度較狹窄。根據(jù)每時(shí)刻的組分分布量可得出各組分分子的均方根半徑(RMS，分子重心到分子邊緣的距離)。根據(jù)各組分的RMS對(duì)分子量的圖，可知Fr-Ⅰ分子結(jié)構(gòu)為球形，F(xiàn)r-Ⅱ分子結(jié)構(gòu)為無(wú)規(guī)則線團(tuán)形，F(xiàn)r-Ⅲ無(wú)定形。1.3.3桑黃的人工培養(yǎng)由于自然條件和自身生長(zhǎng)周期長(zhǎng)等因素的限制，野生的桑黃菌數(shù)量極其稀少，而且難以采集，為進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)好桑黃，很有必要進(jìn)行人工培養(yǎng)方面的研究工作。（1）桑黃子實(shí)體的人工栽培野生桑黃多生于楊、柳、樺、桃等闊葉樹(shù)的枯立木及立木樹(shù)干上，多年生。我國(guó)大部分地區(qū)均有分布，但產(chǎn)量很少。國(guó)內(nèi)外各大藥廠最近幾年紛紛投入巨資研制桑黃系列抗癌新藥，對(duì)桑黃的需求越來(lái)越大，價(jià)格越來(lái)越高，人工栽培桑黃菌，已成為當(dāng)務(wù)之急。目前桑黃人工栽培在國(guó)內(nèi)剛剛起步，國(guó)內(nèi)僅有一家研究所在吉林省延吉市已與外商合作，引進(jìn)桑黃菌種，于1995年6月至1996年6月進(jìn)行了菌種馴化及出菇試驗(yàn)。但只是進(jìn)行小面積試驗(yàn)栽培，生長(zhǎng)期在1.5~2年。國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)對(duì)桑黃的需求越來(lái)越大，野生桑黃資源逐漸枯竭，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿(mǎn)足市場(chǎng)需求[10]。（2）桑黃多糖的固體培養(yǎng)固體培養(yǎng)就是利用固體培養(yǎng)基進(jìn)行微生物的繁殖。微生物貼附在營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)表面生長(zhǎng)，所以又稱(chēng)為表面培養(yǎng)。固體培養(yǎng)在微生物鑒定、計(jì)數(shù)、純化和保藏等方面發(fā)揮著重要作用。桑黃是絲狀真菌，可進(jìn)行生產(chǎn)規(guī)模的固體發(fā)酵。但大規(guī)模的固體發(fā)酵桑黃還未見(jiàn)報(bào)道。（3）桑黃多糖的液體培養(yǎng)液體培養(yǎng)就是將微生物接種到液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。具體包括（1）淺層液體培養(yǎng)：在好氧微生物靜止培養(yǎng)中常常將培養(yǎng)液裝成淺層以增大培養(yǎng)液與空氣的接觸面積，使氧不至于成為限制因子；（2）利用搖床作三角瓶的液體振蕩培養(yǎng)；（4）深層培養(yǎng)大規(guī)模液體培養(yǎng)都是采用更先進(jìn)的深層培養(yǎng)。從深層液體培養(yǎng)器底部通入加壓空氣，并用氣體分布器使空氣以小氣泡形式均勻噴出。由于天然的桑黃子實(shí)體很少，目前子實(shí)體的工栽培僅小批量獲得成功，滿(mǎn)足不了市場(chǎng)需求，能借助于菌絲體發(fā)酵來(lái)大量獲得桑黃多糖，因此桑黃的深層發(fā)酵目前占主流地位。楊全采用液體發(fā)酵技術(shù)，人工培養(yǎng)獲得了具有一定生物活性的菌絲體。而日本及韓國(guó)開(kāi)發(fā)利用桑黃最早，并已開(kāi)始人工栽培，批量生產(chǎn)。韓國(guó)通過(guò)試驗(yàn)獲取了桑黃人工栽培的基本資料。韓國(guó)坡?tīng)柆斨扑幑疽崖氏乳_(kāi)發(fā)出桑黃菌絲體培養(yǎng)法新技術(shù)，人工生產(chǎn)桑黃活性物質(zhì)產(chǎn)品桑黃元。將桑黃的PL2、PL5等菌絲體放在特制培養(yǎng)罐中進(jìn)行發(fā)酵，最后將其提取物用凍干法加工成粉末[11]。

第2章實(shí)驗(yàn)部分2.1桑黃菌絲液體培養(yǎng)工藝優(yōu)化2.1.1桑黃培養(yǎng)條件的確定查閱相關(guān)文獻(xiàn)，除碳源、氮源和pH值外，其它影響液體培養(yǎng)桑黃的發(fā)酵條件有無(wú)機(jī)鹽、生長(zhǎng)因子、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)基的裝液量等，本實(shí)驗(yàn)具體設(shè)定的值如下。（1）無(wú)機(jī)鹽無(wú)機(jī)鹽是微生物生長(zhǎng)所不可缺少的物質(zhì)。其主要功能是：①構(gòu)成細(xì)胞的組成成分；②作為酶的組成成分；③維持酶的活性；④調(diào)節(jié)滲透壓，氫離子濃度和氧化還原電位；⑤作為某些自養(yǎng)菌的能源[12]。對(duì)于真菌來(lái)說(shuō)，液體培養(yǎng)基中缺乏磷、硫、鉀、鎂，菌絲體生長(zhǎng)發(fā)育不良，菌絲體產(chǎn)量低。其中磷是合成核酸、磷脂、一些重要的輔酶（NAD，NADP，輔酶A等）及高能磷酸化合物的重要原料。硫是蛋白質(zhì)中某些氨基酸（如半胱氨酸和蛋氨酸）的組成成分，也是谷胱甘肽的組成成分。鉀不參加細(xì)胞結(jié)構(gòu)物質(zhì)的組成，但它是細(xì)胞是重要的陽(yáng)離子之一。它是許多酶的激活劑，也與原生質(zhì)的膠體特性和細(xì)胞膜的透性有關(guān)。鎂是一些酶（如已糖激酶，異檸檬酸脫氫酶，羧化酶等）的激活劑；鎂還起到穩(wěn)定核糖體、細(xì)胞膜和核酸的作用。但這四種元素對(duì)菌絲體生長(zhǎng)作用大小不存在顯著差異，同等重要。本實(shí)驗(yàn)選取常用的磷酸二氫鉀和硫酸鎂作為礦物質(zhì)元素添加。少量微量元素往往也是與酶活性有關(guān)，或參與酶的組成，或是許多酶的調(diào)節(jié)因子。鐵是過(guò)氧化氫酶、乳酸脫氫酶、細(xì)胞色素氧化酶的組成元素；鈷參與維生素B12的組成；銅是多酚氧化鋅酶和抗壞血酸氧化酶的成分；鋅是肽酶和脫羧酶等的輔助因子等。在本實(shí)驗(yàn)中，用自來(lái)水配制成培養(yǎng)基，就可滿(mǎn)足桑黃生長(zhǎng)對(duì)鐵、鈷、銅、鋅等微量元素的需要。所以，本實(shí)驗(yàn)的無(wú)機(jī)鹽具體用量為：磷酸二氫鉀0.3%、硫酸鎂0.15%，用自來(lái)水配制。（2）生長(zhǎng)因子生長(zhǎng)因子為某些微生物不能從普通的碳源、氮源合成，而需要另外少量加入來(lái)滿(mǎn)足生長(zhǎng)有機(jī)物質(zhì)，包括氨基酸、維生素、嘌呤和嘧啶堿及其衍生物，有時(shí)也包括一些脂肪酸及其他膜成分。必須指出的是各種微生物所需的生長(zhǎng)因子互不相同。真菌是維生素B1、維生素B2的天然缺陷型，必須外界添加才能生長(zhǎng)良好。維生素B1、維生素B2對(duì)真菌的生長(zhǎng)相當(dāng)重要，他們以一種輔酶的形式存在，對(duì)菌絲的生長(zhǎng)起促進(jìn)的作用。而他們的需要量甚少。根據(jù)楊全等[13]人的試驗(yàn)結(jié)果，在液體培養(yǎng)基中，當(dāng)維生素B1的用量20μg/100mL，維生素B2用量30μg/100mL時(shí)，菌絲體的產(chǎn)量最高。因此在本實(shí)驗(yàn)中維生素B1的用量20μg/100mL、維生素B2用量30μg/100mL。（3）培養(yǎng)溫度溫度主要通過(guò)影響微生物細(xì)胞膜的流動(dòng)性和生物大分子的活性來(lái)影響微生物的生命活動(dòng)。一方面，隨著溫度的升高，細(xì)胞內(nèi)酶反應(yīng)速度加快，代謝和生長(zhǎng)也相應(yīng)的加快；另一方面，隨著溫度進(jìn)一步增高，生物活性物質(zhì)（如蛋白質(zhì)、核酸等）發(fā)生變性，細(xì)胞功能下降，甚至死亡。而且，溫度是保證酶活性的重要條件。微生物的生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成均需在其各自適合的溫度下進(jìn)行[13]。溫度對(duì)桑黃菌絲產(chǎn)量的影響較大，對(duì)液體培養(yǎng)而言，桑黃菌絲體生長(zhǎng)的最適溫度是30±1℃，所以本實(shí)驗(yàn)在30℃下培養(yǎng)桑黃。（4）轉(zhuǎn)速在搖瓶培養(yǎng)過(guò)程中，轉(zhuǎn)速對(duì)菌絲體的生長(zhǎng)也有很大的影響。轉(zhuǎn)速太低，菌球形成數(shù)量少，導(dǎo)致單個(gè)菌球長(zhǎng)勢(shì)過(guò)大，菌球中間出現(xiàn)中空狀態(tài)，而且出現(xiàn)菌絲體自溶現(xiàn)象，另一方面培養(yǎng)基內(nèi)的溶解氧減少，則桑黃菌菌絲球內(nèi)部生長(zhǎng)不足，結(jié)果菌絲體產(chǎn)量降低。轉(zhuǎn)速過(guò)高，桑黃的菌絲短，而且培養(yǎng)基容易飛濺到棉塞上引起污染，對(duì)設(shè)備和電能都有損耗，造成不必要的人力、物力等的浪費(fèi)。根據(jù)胡文彬等人報(bào)道，130r/min是培養(yǎng)桑黃的合適轉(zhuǎn)速。本實(shí)驗(yàn)采用的轉(zhuǎn)速是130r/min。（5）培養(yǎng)基裝量培養(yǎng)基的裝量不僅影響著搖瓶中溶解氧的含量，還會(huì)影響微生物生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)。裝液量過(guò)多會(huì)影響菌絲體的好氧需求，從而影響菌絲的產(chǎn)量，而裝液量過(guò)少，菌絲體所能吸收利用的營(yíng)養(yǎng)不足而影響菌絲的產(chǎn)量。陳瑞蕊等的實(shí)驗(yàn)表明250mL的錐形瓶裝70mL時(shí)的菌絲體產(chǎn)量最高。本次實(shí)驗(yàn)采用250mL的錐形瓶，其中培養(yǎng)基的裝量為70mL。2.1.2測(cè)定方法（1）菌絲體干重的測(cè)定發(fā)酵液用布氏漏斗過(guò)濾，蒸餾水沖洗菌絲體3次，沖洗干凈后，轉(zhuǎn)入已知重量的培養(yǎng)皿中，置60℃烘箱烘干至恒重，稱(chēng)量。（2）胞外粗多糖重量的測(cè)定過(guò)濾后濾液濃縮至原體積的1/5，然后加入3倍體積的95％的酒精，4℃沉淀24h，離心后取沉淀，置60℃真空干燥箱至恒重，稱(chēng)重。（3）胞內(nèi)粗多糖重量的測(cè)定取干燥的菌絲粉碎，置90℃熱水中浸提2h，離心后取上清液，將上清液濃縮至原體積的1/5，然后加入3倍體積的95％的酒精，4℃沉淀24h，離心后取沉淀，置60℃真空干燥箱至恒重，稱(chēng)重[14]。2.1.3實(shí)驗(yàn)材料（1）菌種本實(shí)驗(yàn)采用的是由長(zhǎng)白山桑黃子實(shí)體分離純化得到的桑黃菌種。（2）原料與藥品土豆、玉米粉、可溶性淀粉、蛋白胨、黃豆粉、酵母浸出汁、葡萄糖、蔗糖、乳糖、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、瓊脂、維生素B1、維生素B2、硫酸銨，具體規(guī)格見(jiàn)表2.1-1。表2.1-1主要藥品名稱(chēng)級(jí)別、規(guī)格生產(chǎn)廠家氫氧化鈉AR，500g/瓶山東省化工研究院磷酸二氫鉀AR，500g/瓶沈陽(yáng)市新西試劑廠七水硫酸鎂AR，500g/瓶天津市化學(xué)試劑一廠葡萄糖AR，500g/瓶天津市化學(xué)試劑三廠蔗糖AR，500g/瓶天津市化學(xué)試劑三廠乳糖AR，500g/瓶天津市化學(xué)試劑一廠可溶性淀粉AR，500g/瓶沈陽(yáng)市新西試劑廠黃豆餅粉AR，500g/瓶天津市北方化玻購(gòu)銷(xiāo)中心蛋白胨AR，500g/瓶天津市大茂化學(xué)儀器供應(yīng)站瓊脂粉AR，500g/瓶天津市珠江衛(wèi)生材料廠酵母浸出汁500g/瓶上海冠生園添加劑制品有限公司維生素B1市售東北制藥總廠維生素B2市售吉林省遼源亞?wèn)|藥業(yè)股份有限公司土豆市售吉林玉米粉市售吉林（3）實(shí)驗(yàn)儀器滅菌鍋、無(wú)菌操作臺(tái)、恒溫生化培養(yǎng)箱、電熱鼓風(fēng)干燥箱、旋轉(zhuǎn)式搖床、試管、錐形瓶、培養(yǎng)皿等，具體見(jiàn)表2.1-2。表2.1-2主要儀器名稱(chēng)型號(hào)、規(guī)格生產(chǎn)廠家立式壓力蒸汽滅菌鍋LS-B50L上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司垂直凈化工作臺(tái)SP-DJ系列上海浦東物理光學(xué)儀器廠雙人雙面凈化工作臺(tái)SW-CJ-2F型蘇州凈化設(shè)備有限公司恒溫生化培養(yǎng)箱LRH-250A廣東省醫(yī)療器械廠電熱鼓風(fēng)干燥箱CS101-2AB重慶試驗(yàn)設(shè)備廠三角瓶250mL長(zhǎng)春市玻璃儀器廠回轉(zhuǎn)恒溫調(diào)速搖瓶柜HYG-A余姚市金電儀表有限公司培養(yǎng)皿Φ9、15cm天津市玻璃儀器廠燒杯25mL-500mL天津市玻璃儀器廠量筒100、500mL天津市玻璃儀器廠2.1.4試驗(yàn)過(guò)程（1）活化菌種將原種在無(wú)菌條件下接到PDA固體培養(yǎng)基上進(jìn)行活化。①配制PDA培養(yǎng)基（按表2.1-3的配方配制）。以配制500MlPDA為例：將土豆去皮、去芽眼，切成絲后，稱(chēng)100g置于1000mL搪瓷缸中，加入200～300mL自來(lái)水后，于電爐上煮沸30min。在此過(guò)程上，注意用玻璃棒攪拌以防止糊底。待土豆汁稍冷卻后，用四層紗布過(guò)濾。取其濾液，并在濾液中加入1.5g磷酸二氫鉀、0.75g硫酸鎂、0.1g維生素B1、0.15g維生素B2，充分溶解后加自來(lái)水至500mL，加入5g瓊脂粉，煮沸。注：本實(shí)驗(yàn)中所有的培養(yǎng)基都加入維生素B1和維生素B2，其配比分別為20μg/100mL和30μg/100mL。表2.1-3PDA固體培養(yǎng)基配方品名葡萄糖土豆KH2PO4MgSO4瓊脂pH配比(g/100mL)2200.30.150.5自然②分裝：煮沸后趁熱分裝于試管內(nèi)，管口塞上棉塞并用牛皮紙包好。裝入試管中的培養(yǎng)基量應(yīng)為試管高度的1/5。注意，分裝的時(shí)候，不要將培養(yǎng)基灑在試管口，棉塞上尤其不能沾有培養(yǎng)基，否則容易染菌。③滅菌：本實(shí)驗(yàn)中采用高壓蒸氣滅菌法滅菌。④制作斜面：趁熱擺斜面，冷卻凝固后即為斜面培養(yǎng)基。⑤在無(wú)菌的環(huán)境下接種：⑥將接完種的試管再次用牛皮紙包好，放入生化培養(yǎng)箱中，于32℃下培養(yǎng)。（2）固體擴(kuò)大培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)①按照表2.1-3配制PDA固體培養(yǎng)基：步驟如（1）中步驟。②分裝：將培養(yǎng)基分裝到250mL錐形瓶中，為了使滅菌的效果好，裝入錐形瓶的培養(yǎng)基量最好不要超過(guò)培養(yǎng)基容積的一半。塞上棉塞，用牛皮紙包扎好。③滅菌：在壓力為0.1MPa、溫度為121℃的情況下滅菌20min，與此同時(shí)，將70個(gè)培養(yǎng)皿和接種針也滅菌。具體步驟見(jiàn)2.3.1中步驟3。④制作平板：在無(wú)菌操作臺(tái)上將倒平板，冷卻凝固。平板中倒入的培養(yǎng)基量要適當(dāng)，培養(yǎng)基太少會(huì)導(dǎo)致所培養(yǎng)菌種營(yíng)養(yǎng)不良，而太多則會(huì)造成營(yíng)養(yǎng)的浪費(fèi)。⑤接種：在火焰旁完成接種。⑥將接完種的培養(yǎng)皿用牛皮紙包好，放入生化培養(yǎng)箱中，于32℃下培養(yǎng)。（3）液體種子搖瓶培養(yǎng)①按照表2.1-4配制2L液體種子培養(yǎng)基，分裝于250mL的錐形瓶中，每個(gè)裝液量為70mL，在壓力為0.1MPa、溫度為121℃的情況下滅菌20min。表2.1-4液體種子培養(yǎng)基配方品名葡萄糖酵母膏蛋白胨KH2PO4MgSO4配比(g/100mL)20.20.20.20.1②將滅好菌的物品放入無(wú)菌操作臺(tái)中，并將酒精燈等用酒精棉擦拭后也放在無(wú)菌操作臺(tái)上。③點(diǎn)燃酒精燈，在無(wú)菌操作臺(tái)中的火焰旁接種。④接種完畢后，將錐形瓶放在搖床中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：溫度30℃、轉(zhuǎn)速為130rpm。培養(yǎng)5天即得液體種子。（4）桑黃菌絲體生長(zhǎng)曲線和多糖積累曲線實(shí)驗(yàn)①按照表2.1-5配制5LPDA液體培養(yǎng)基，分裝于250mL的錐形瓶中，每瓶裝液量為70mL。滅菌，接種，于溫度30℃、轉(zhuǎn)速為130rpm下培養(yǎng)，并開(kāi)始計(jì)時(shí)。表2.1-5PDA液體培養(yǎng)基配方品名葡萄糖土豆KH2PO4MgSO4pH配比(g/100mL)2200.30.15自然②桑黃培養(yǎng)3天（即72小時(shí)）時(shí)，取5瓶未染菌的桑黃培養(yǎng)液。a.菌絲體干重的測(cè)定：發(fā)酵液用布氏漏斗過(guò)濾，蒸餾水沖洗菌絲體3次，沖洗干凈后，轉(zhuǎn)入已知重量的培養(yǎng)皿中，置60℃烘箱烘干至恒重，稱(chēng)量。根據(jù)公式2-1可得出菌絲體干重。m菌絲體＝〔m菌絲體2－m菌絲體1〕×1000÷〔70×5〕公式2-1m菌絲體1：盛菌絲體的培養(yǎng)皿質(zhì)量，g；m菌絲體2：干燥后的菌絲體和培養(yǎng)皿質(zhì)量，g；m菌絲體：1L培養(yǎng)液中菌絲體的干重，g。b.胞外粗多糖重量的測(cè)定：過(guò)濾后濾液濃縮至原體積的1/5，然后加入3倍體積的95%的酒精，4℃沉淀24h，離心后將沉淀轉(zhuǎn)入已知重量的培養(yǎng)皿中，置60℃真空干燥箱至恒重，稱(chēng)重。根據(jù)公式2-2可得出胞外粗多糖重量。m胞外多糖＝〔m胞外多糖2－m胞外多糖1〕×1000÷〔70×5〕公式2-2m胞外多糖1：盛胞外多糖的培養(yǎng)皿質(zhì)量，g；m胞外多糖2：干燥后的胞外多糖和培養(yǎng)皿質(zhì)量，g；m胞外多糖：1L培養(yǎng)液中胞外多糖的質(zhì)量，g。c.胞內(nèi)粗多糖重量的測(cè)定：取干燥的菌絲粉碎，置90℃熱水中浸提2h，離心后取上清液，將上清液濃縮至原體積的1/5，然后加入3倍體積的95％的酒精，4℃沉淀24h，離心后將沉淀轉(zhuǎn)入已知重量的培養(yǎng)皿中，置60℃真空干燥箱至恒重，稱(chēng)重。根據(jù)公式2-3可得出胞外粗多糖重量。m胞內(nèi)多糖＝〔m胞內(nèi)多糖2－m胞內(nèi)多糖1〕×1000÷〔70×5〕公式2-3m胞內(nèi)多糖1：盛胞內(nèi)多糖的培養(yǎng)皿質(zhì)量，g；m胞內(nèi)多糖2：干燥后的胞內(nèi)多糖和培養(yǎng)皿質(zhì)量，g；m胞內(nèi)多糖：1L培養(yǎng)液中胞內(nèi)多糖的質(zhì)量，g。③用同樣的方法，每隔2天（48小時(shí)）測(cè)一次桑黃菌絲體的干重、胞外粗多糖及胞內(nèi)粗多糖的質(zhì)量。④連續(xù)測(cè)13天（312小時(shí)）。5.此實(shí)驗(yàn)要進(jìn)行三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，菌絲體干重、胞內(nèi)、外多糖質(zhì)量均為三次實(shí)驗(yàn)的平均值。（5）液體培養(yǎng)基初始pH的篩選影響實(shí)驗(yàn)對(duì)初始pH分別為4.5、5.5、6.5、7.5、8.5進(jìn)行篩選。①按照表2-6，配制2LPDA液體培養(yǎng)基，然后平均分成五份，每份400mL，用稀鹽酸或稀氫氧化鈉分別調(diào)pH為4.5、5.5、6.5、7.5、8.5。②將各培養(yǎng)基分裝于250mL的錐形瓶中，每瓶裝液量為70mL。在壓力為0.1MPa、溫度為121℃的情況下滅菌20min，冷卻后接種，并于溫度30℃、轉(zhuǎn)速為130rpm下在搖床中培養(yǎng)。③培養(yǎng)7天，按照2.3.4中步驟2的操作，計(jì)算出各種培養(yǎng)基中菌絲體的干重。④此實(shí)驗(yàn)要進(jìn)行三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。桑黃菌絲體的干重為三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值。（6）桑黃培養(yǎng)基碳源篩選實(shí)驗(yàn)對(duì)葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、小麥粉和玉米粉五種碳源進(jìn)行篩選。①配制五種培養(yǎng)基，其碳源分別為葡萄糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉和玉米粉，配比都為3%，其余物質(zhì)見(jiàn)表2.1-6。配制培養(yǎng)基時(shí)，首先要將碳源、蛋白胨以及各無(wú)機(jī)鹽和維生素都溶于水中，最后將水定容至所需體積即可。表2.1-6不同碳源的培養(yǎng)基配方品名蛋白胨KH2PO4MgSO4配比(g/100mL)10.30.15②將各培養(yǎng)基分裝于250mL的錐形瓶中，每瓶裝液量為70mL。在壓力為0.1MPa、溫度為121℃的情況下滅菌20min后冷卻接種，于溫度30℃、轉(zhuǎn)速為130rpm下在搖床中培養(yǎng)。③培養(yǎng)7d，按照2.1.2中步驟操作，稱(chēng)出各種培養(yǎng)基中菌絲體的干重。④此實(shí)驗(yàn)進(jìn)行三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。菌絲體干重為三次實(shí)驗(yàn)的平均值。（7）桑黃培養(yǎng)基氮源篩選實(shí)驗(yàn)對(duì)土豆、蛋白胨、黃豆餅粉、牛肉膏+酵母浸出汁和(NH4)2SO4進(jìn)行篩選。①配制四種培養(yǎng)基，其氮源及配比分別為土豆（20%）、蛋白胨（1%）、黃豆餅粉（1%）、牛肉膏（0.8%）+酵母浸出汁（0.2%）和(NH4)2SO4（1%），其余物質(zhì)見(jiàn)表2.1-7。配制培養(yǎng)基時(shí)，首先要將碳源、蛋白胨以及各無(wú)機(jī)鹽和維生素都溶于水中，最后將水定容至所需體積即可。表2.1-7不同碳源的培養(yǎng)基配方品名玉米粉KH2PO4MgSO4配比(g/100mL)30.30.15②將各培養(yǎng)基分裝于250mL的錐形瓶中，每瓶裝液量為70mL。滅菌后接種，于溫度30℃、轉(zhuǎn)速為130rpm下在搖床中培養(yǎng)。③培養(yǎng)7天，按照2.1.2中步驟操作，計(jì)算出各種培養(yǎng)基中菌絲體的干重。④此實(shí)驗(yàn)要進(jìn)行三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。菌絲體干重為三次實(shí)驗(yàn)的平均值。（8）優(yōu)化培養(yǎng)基驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)由以上實(shí)驗(yàn)可知：最優(yōu)碳源為玉米粉、最優(yōu)氮源為黃豆餅粉、最適pH在5.5～6.5之間。利用優(yōu)化得來(lái)的結(jié)果，按照表2.1-8配制培養(yǎng)基，分裝，在壓力為0.1MPa、溫度為121℃的情況下滅菌20min，待冷卻后接種，并在溫度為30℃、轉(zhuǎn)速為130r/min的條件下用搖床培養(yǎng)7天后，按照2.3.4中步驟操作測(cè)桑黃菌絲體的干重。重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)，桑黃菌絲體干重為三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值。與此同時(shí)，用PDA液體培養(yǎng)基作為對(duì)照組，并重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)。表2.1-8優(yōu)化培養(yǎng)基的配方品名玉米粉黃豆餅粉KH2PO4MgSO4維生素B1維生素B2pH配比(g/100mL)310.30.150.020.035.5～6.52.2多糖提取工藝優(yōu)化2.2.1乙醇濃度對(duì)多糖收率的影響（1）培養(yǎng)液濃縮將培養(yǎng)液定量，用反滲透膜濃縮為原體積的1/2，濃縮壓力0.5MPa。反滲透膜濃縮操作：接通電源，電源指示燈亮，打開(kāi)工作泵，調(diào)節(jié)濃縮液調(diào)壓閥將壓力調(diào)節(jié)到0.5Mpa，開(kāi)始工作。（2）向濃縮后的培養(yǎng)液加入原體積3倍的乙醇，產(chǎn)生灰白色沉淀，將上述提取液放入冷藏柜，在4℃下靜置一夜。以發(fā)酵液中多糖含量為依據(jù)，改變乙醇的濃度，以確定最佳提取工藝。見(jiàn)表2.2-1表2.2-1改變乙醇濃度組別123乙醇濃度（%）758595（3）將上述提取液用離心機(jī)分離，3000r/min，離心10min，得到桑黃多糖，離心得到上清液（乙醇）回收。（4）將離心所得沉淀（桑黃多糖）用冷凍干燥機(jī)中干燥，得到的產(chǎn)品用精密電子天平稱(chēng)量，記錄數(shù)據(jù)。2.2.2胞內(nèi)多糖提取實(shí)驗(yàn)優(yōu)化采用單因素實(shí)驗(yàn)法，選擇影響提取多糖含量的3個(gè)主要因素煎煮時(shí)間、固液比和水煮次數(shù)，其他因素不變，稱(chēng)取等量的干菌絲體粉末，每個(gè)因素3個(gè)水平，以提取多糖的質(zhì)量為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)比分析，從而優(yōu)化得到菌絲體提取多糖的最佳工藝。步驟： （1）將分離出來(lái)的菌絲體放入恒溫干燥機(jī)中，在60～65℃下干燥；恒溫干燥機(jī)的操作：首先插上電源，打開(kāi)開(kāi)關(guān)，設(shè)定干燥的溫度，干燥菌絲體需要60℃，同時(shí)設(shè)定溫度的上限65（2）干燥結(jié)束，將菌絲體研磨成粉狀，然后稱(chēng)取9份等量的菌絲體粉末4.0g，進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。分別按照表2.2-2、表2.2-3和表2.2-4的設(shè)計(jì)進(jìn)行蒸煮實(shí)驗(yàn)。表2.2-2改變水煮時(shí)間組別123水煮時(shí)間（h）11.52表2.2-3改變水煮次數(shù)組別456水煮次數(shù)（次）123表2.2-4改變固液比組別789固液比1:7.51:101:12.5③將水煮液3000r/min離心10min，分離得到上清液。④將上述上清液用反滲透膜濃縮為原體積的1/2，操作同上。⑤下面用胞外多糖提取的方法提取菌絲體多糖并記錄數(shù)據(jù)及結(jié)果。2.2.3超聲波處理時(shí)間對(duì)多糖收率的影響本實(shí)驗(yàn)將除時(shí)間外的其他提取條件設(shè)置為料液比1:10，超聲波提取溫度60℃，功率400W。（1）稱(chēng)取5份桑黃菌絲體粉末，每份10g，置于燒杯中，編號(hào)1～5，加入蒸餾水并加熱到60℃。（2）將上述5組混合物進(jìn)行超聲波處理，時(shí)間分別為10min、15min、20min、25min、30min。（3）水煮1h，冷卻后（4℃）分別加入95%乙醇。（4）離心去除上清液，所的沉淀冷凍干燥并稱(chēng)量。

第3章試驗(yàn)數(shù)據(jù)及分析3.1桑黃菌絲液體培養(yǎng)工藝數(shù)據(jù)及分析3.1.1桑黃生長(zhǎng)曲線與桑黃多糖積累曲線的繪制（1）實(shí)驗(yàn)記錄表測(cè)定桑黃生長(zhǎng)曲線時(shí)，桑黃菌絲體干重以及胞內(nèi)外多糖隨培養(yǎng)時(shí)間的記錄表見(jiàn)表3-1。表3.1-1桑黃菌絲體干重、胞內(nèi)、胞外多糖隨培養(yǎng)時(shí)間的變化培養(yǎng)時(shí)間(d)35791113菌絲體干重(g/L)0.7522.1012.9873.0282.9022.886胞外多糖(g/L)0.1480.2780.4790.6420.6710.659胞內(nèi)多糖(g/L)0.0310.0890.1320.1190.0810.072（2）桑黃生長(zhǎng)曲線和多糖積累曲線①根據(jù)表3.1-1，繪制桑黃的生長(zhǎng)曲線，如圖3.1-1。圖3.1-1桑黃菌和生長(zhǎng)曲線②根據(jù)表3.1-1，繪制桑黃多糖積累曲線，如圖3.1-2。胞內(nèi)多糖胞外胞內(nèi)多糖胞外多糖圖3.1-2桑黃胞內(nèi)、胞外多糖的積累曲線（3）結(jié)果分析從圖3.1-1可以看出：液體培養(yǎng)的桑黃初期生長(zhǎng)比較緩慢，從第3天開(kāi)始，隨著發(fā)酵進(jìn)程的不斷深入，菌絲體的生長(zhǎng)越來(lái)越旺盛，到第7、8天，菌絲體產(chǎn)量達(dá)到最高峰，之后生長(zhǎng)趨于穩(wěn)定，到第10天，桑黃生物量有所下降。也就是說(shuō)，液體培養(yǎng)的桑黃第1～2天為遲滯期，第3～7天為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，第8～10天為穩(wěn)定期，從第11天開(kāi)始進(jìn)入衰亡期。因此，在接種時(shí)，盡量接培養(yǎng)了5～7天的桑黃菌種。結(jié)合圖3-1和圖3-2，可以看出胞內(nèi)多糖的多少和菌絲體產(chǎn)量有著直接的關(guān)系，隨著菌絲體量而變化，到第7天時(shí)的胞內(nèi)多糖達(dá)到最大，以后則隨著菌絲體的減少也相應(yīng)的減少，但減少得更快一些，這主要是因?yàn)樯｜S菌絲的自溶。胞外多糖也與菌絲體的量有密切的關(guān)系：培養(yǎng)前期，胞外多糖隨菌絲體的增加而增加，第8天以后雖然菌絲體的重量已經(jīng)穩(wěn)定，并逐漸進(jìn)入衰亡期，但胞外多糖依然是增加的，這主要是因?yàn)榫z體內(nèi)多糖的溶出，但這以后的增幅有限，而且不久開(kāi)始下降。正是由于桑黃菌絲產(chǎn)量的大小可以反映多糖產(chǎn)量的高低，我們?cè)趦?yōu)化培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中，可以用菌絲體的產(chǎn)量來(lái)評(píng)估多糖的產(chǎn)量。此外，為獲取較高的菌絲及多糖產(chǎn)量，桑黃菌的發(fā)酵培養(yǎng)應(yīng)為7天為宜。3.1.2培養(yǎng)基初始pH值的篩選（1）試驗(yàn)數(shù)據(jù)表3.1-2列出了不同初始pH值的培養(yǎng)基中桑黃菌絲體干重的質(zhì)量。表3.1-2不同初始pH值對(duì)菌絲體產(chǎn)量的影響初始pH值4.55.56.57.58.5菌絲體干重(g/L)12.6642.9873.2201.8810.98622.5463.4253.2011.7900.99832.8503.6653.4161.9891.079平均值2.6873.3593.2791.8791.021不同初始pH值與菌絲體干重的曲線見(jiàn)圖3-3。圖3.1-3菌絲體隨培養(yǎng)基初始pH值的變化曲線圖（2）結(jié)果分析液體培養(yǎng)基作為菌絲體生活的外部環(huán)境，pH值的高低直接影響菌絲體的新陳代謝。圖3.1-3可以看出，可知桑黃菌在弱酸性培養(yǎng)液中生長(zhǎng)較好，而在堿性培養(yǎng)液中很難生長(zhǎng)；最適的pH在5.5～6.5之間。在PDA培養(yǎng)基中，自然pH為5.9～6.1，固在配制PDA培養(yǎng)基時(shí)，自然pH即可。3.1.3培養(yǎng)基碳源的篩選（1）實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表中3.1-3列出了不同碳源的培養(yǎng)基中桑黃菌絲體干重的質(zhì)量。表3.1-3不同碳源對(duì)菌絲體產(chǎn)量的影響碳源葡萄糖蔗糖乳糖可溶性淀粉玉米粉菌絲體產(chǎn)量(g/L)14.5434.1093.3494.3345.28324.6774.3973.3604.6005.09734.7434.4603.3914.5915.323平均值4.6544.3223.3674.5095.234不同碳源對(duì)菌絲體干重的影響圖見(jiàn)圖3.1-4。圖3.1-4不同碳源對(duì)菌絲體干重的影響圖上圖中1、2、3、4、5分別代表葡萄糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉和玉米粉。（2）結(jié)果分析碳元素是真菌最重要的營(yíng)養(yǎng)，它不僅是碳水化合物和蛋白質(zhì)的基本組成元素，同時(shí)又是重要的能量來(lái)源。凡是可以作為微生物細(xì)胞結(jié)構(gòu)或代謝產(chǎn)物中碳架來(lái)源的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，即稱(chēng)為碳源?？勺鳛槲⑸餇I(yíng)養(yǎng)的碳源物質(zhì)種類(lèi)極其廣泛，從簡(jiǎn)單的無(wú)機(jī)物到復(fù)雜的有機(jī)含碳化合物。但不同的微生物利用碳源的能力不同。由表3.1-3可知，桑黃對(duì)碳的利用相當(dāng)廣泛，對(duì)單糖、寡糖、多糖均可利用。就實(shí)驗(yàn)的5種碳源來(lái)講，玉米粉作為碳源時(shí)最有利于菌絲體的生長(zhǎng)和多糖的合成，葡萄糖次之。而且從經(jīng)濟(jì)上考慮，玉米粉比較廉價(jià)易得，因此，玉米粉可作為桑黃菌絲工業(yè)化液體發(fā)酵的廉價(jià)碳源。3.1.4培養(yǎng)基氮源的篩選（1）試驗(yàn)數(shù)據(jù)表中3.1-4列出了不同氮源的培養(yǎng)基中桑黃菌絲體干重的質(zhì)量。不同氮源對(duì)菌絲體干重的影響圖見(jiàn)圖3.1-5。表3.1-5不同氮源對(duì)菌絲體產(chǎn)量的影響氮源土豆蛋白胨黃豆餅粉牛肉膏+酵母浸出汁(NH4)2SO4菌絲體產(chǎn)量(g/L)13.8345.2835.7613.0121.86024.1805.0975.9213.2342.04634.5665.3236.0033.3872.097平均值4.1935.2345.8953.2112.001圖3.1-5不同氮源對(duì)菌絲體干重的影響圖上圖中1、2、3、4、5分別代表土豆、蛋白胨、黃豆餅粉、牛肉膏+酵母浸出汁和(NH4)2SO4。（2）結(jié)果分析凡是構(gòu)成微生物細(xì)胞物質(zhì)或代謝產(chǎn)物中氮元素來(lái)源的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，稱(chēng)為氮源。細(xì)胞的干物質(zhì)中氮含量?jī)H次于碳和氧。氮素是真菌合成蛋白質(zhì)、核酸的必要原料，對(duì)菌絲的生長(zhǎng)發(fā)育至關(guān)重要。從表3.1-4可知，5種氮源中，蛋白胨和黃豆餅粉作為氮源對(duì)桑黃菌絲生長(zhǎng)都很好，但從工業(yè)化角度來(lái)說(shuō)，選黃豆餅粉作為氮源較實(shí)際，因?yàn)辄S豆餅粉比較廉價(jià)而且易得。3.1.5驗(yàn)證培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)（1）試驗(yàn)數(shù)據(jù)優(yōu)化培養(yǎng)基及對(duì)照組中桑黃菌絲體的產(chǎn)量見(jiàn)表3.1-5。表3.1-5優(yōu)化培養(yǎng)基及其對(duì)照組中桑黃菌絲體的產(chǎn)量實(shí)驗(yàn)1實(shí)驗(yàn)2實(shí)驗(yàn)3平均值優(yōu)化培養(yǎng)基菌絲體干重(g/L)6.8027.1227.3437.089對(duì)照組菌絲體干重(g/L)3.7454.1923.8163.981（2）結(jié)果分析根據(jù)表3.1-5，優(yōu)化后的培養(yǎng)基菌絲干重比對(duì)照組菌絲干重超出1.78倍，足以說(shuō)明優(yōu)化培養(yǎng)基的高產(chǎn)的有效性。由于所用的實(shí)驗(yàn)材料均為農(nóng)副產(chǎn)品，價(jià)格低廉、資源豐富，便于工業(yè)化。3.2多糖提取工藝數(shù)據(jù)及分析3.2.1乙醇濃度對(duì)多糖得率的影響（1）試驗(yàn)數(shù)據(jù)根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)算桑黃胞外多糖的得率：發(fā)酵液100ml，收率=多糖產(chǎn)量/100(ml)，如表3.2-1表3.2-1胞外多糖收率數(shù)據(jù)記錄組別123乙醇濃度（%）758595多糖(g)1.98642.39772.4736單位收率(g/ml)0.0198640.0239770.024736（2）結(jié)果分析通過(guò)表3.2-1數(shù)據(jù)表明，95%濃度的乙醇溶液粗多糖的析出量最多，單位收率最高.85%及95%乙醇溶液的粗多糖的收率方差顯著性較小，而對(duì)75%的乙醇溶液的粗多糖的收率方差顯著性較大。說(shuō)明使用85%的乙醇溶液進(jìn)行粗多糖的收率與使用95%的乙醇溶液進(jìn)行粗多糖的收率接近。在工業(yè)化生產(chǎn)過(guò)程中醇沉使用的乙醇需要回收利用，回收的乙醇達(dá)到85%濃度比達(dá)到95%濃度要節(jié)省動(dòng)力消耗，為工業(yè)化生產(chǎn)上使用回收的乙醇提供了理論依據(jù)。3.2.2桑黃胞內(nèi)多糖提取實(shí)驗(yàn)（1）試驗(yàn)數(shù)據(jù)根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)算桑黃包內(nèi)多糖的產(chǎn)率：菌絲體4g，產(chǎn)率=多糖產(chǎn)量/4(g多糖/g菌絲體)表3.2-2蒸煮時(shí)間不同組別123蒸煮時(shí)間（h）11.52多糖產(chǎn)量(g)0.29940.32070.4355單位產(chǎn)量(g/g)0.074850.0801750.108875粗多糖提取率%7.4858.017510.8875表3.2-3蒸煮次數(shù)不同組別456蒸煮次數(shù)123多糖產(chǎn)量(g)0.37650.46530.4021單位產(chǎn)量(g/g)0.0941250.1163250.100525粗多糖提取率%9.412511.632510.0525表3.2-4固液比不同組別789加水量（倍）1:7.51:101:12.5多糖產(chǎn)量(g)0.36740.40530.4326單位產(chǎn)量(g/g)0.091850.1013250.10815粗多糖提取率%9.18510.132510.815（2）結(jié)果分析根據(jù)表3.2-2可知，隨著水煮時(shí)間的延長(zhǎng)，多糖的提取率也隨之提高，并且差異比較顯著。根據(jù)表3.2-3可知，每次水煮1h，隨著水煮時(shí)間的延長(zhǎng)，多糖的提取率也隨之提高，并且差異比較顯著。如果采用逆流式連續(xù)提取可能效果會(huì)更好，這在以后的工作中再詳細(xì)地研究。根據(jù)表3.2-4可知，隨著固液比的增大，多糖的提取率也隨之提高，并且差異比較顯著。但是固液比增大后期濃縮的能耗也會(huì)增大，在本試驗(yàn)的條件下采用1:10比例較好。3.2.3超聲波處理時(shí)間對(duì)多糖收率的影響（1）試驗(yàn)數(shù)據(jù)在超聲波處理時(shí)間的確定實(shí)驗(yàn)中，5組方案的桑黃多糖產(chǎn)率見(jiàn)表3.2-5：表3.2-5不同超聲時(shí)間桑黃多糖產(chǎn)率組別超聲處理時(shí)間（min）多糖（g）得率（%）1101.08110.82151.25512.553201.69316.934251.91319.135301.79217.93圖3.2-1超聲時(shí)間多桑黃多糖產(chǎn)率的影響（2）結(jié)果分析由圖3.2-1可以看出，在超聲處理時(shí)間小于20min時(shí)，桑黃多糖的產(chǎn)率隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，在超聲處理25min時(shí)，達(dá)到提取最大值，而后隨超聲時(shí)間延長(zhǎng)，多糖提取率有所下降，這是由于超聲處理數(shù)分鐘，細(xì)胞破碎程度增大后，細(xì)胞內(nèi)部的多糖物質(zhì)開(kāi)始向外擴(kuò)散，多糖的提取率開(kāi)始上升較快，達(dá)到最大值。但是超聲波具有較強(qiáng)的機(jī)械剪切作用，長(zhǎng)時(shí)間作用會(huì)使多糖結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致多糖提取率有所下降。另外，超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，細(xì)胞進(jìn)一步破碎，雜質(zhì)溶出，這也是多糖提取率有所下降的原因之一。因此確定本實(shí)驗(yàn)超聲時(shí)間為25min。3.3桑黃菌絲生長(zhǎng)形態(tài)在平板上觀察桑黃菌絲體生長(zhǎng)的形態(tài)，菌蓋半球形，表面淺黃線至深，有同心紋和環(huán)棱，初期有微細(xì)絨毛，后變光滑，稍龜裂，硬而木質(zhì)化，均邊緣銳或鈍，其下側(cè)無(wú)子實(shí)層，剖面扁平至馬蹄形，而幼嫩子實(shí)體呈黃色，邊緣（生長(zhǎng)輪）鮮黃色，成熟時(shí)菌肉顏色加深呈淺咖啡色至銹褐色。液體培養(yǎng)的桑黃主要是生長(zhǎng)在液體中，聚集成球狀，但仍有一部分菌絲為貼壁生長(zhǎng)。

結(jié)論本項(xiàng)目分為三個(gè)部分，分別是菌絲培養(yǎng)、多糖提取、發(fā)酵設(shè)計(jì)，分別加以總結(jié)。4.1桑黃菌絲液體培養(yǎng)工藝優(yōu)化（1）桑黃多糖產(chǎn)量與菌絲體產(chǎn)量有密切的關(guān)系，因此，在實(shí)驗(yàn)中可以用菌絲體產(chǎn)量的大小來(lái)評(píng)估多糖產(chǎn)量的高低。與此同時(shí)，我們可以得出：作為培養(yǎng)發(fā)酵菌種，培養(yǎng)5～7天是最佳的接種時(shí)間；若為微生物發(fā)酵，則根據(jù)所要的產(chǎn)物來(lái)確定發(fā)酵時(shí)間。在桑黃的液體培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，若要求高產(chǎn)的菌絲體或胞內(nèi)多糖，則發(fā)酵時(shí)間為7天，若要求得到胞外多糖，就要在桑黃菌絲體開(kāi)始自溶后的1～2天停止發(fā)酵。（2）pH對(duì)桑黃培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)中表明：桑黃菌在弱酸性培養(yǎng)液中生長(zhǎng)較好，而在堿性培養(yǎng)液中很難生長(zhǎng)；最適的pH在5.5～6.5之間。（3）桑黃對(duì)糖類(lèi)的利用很廣泛，單糖、雙糖以及多糖都可以利用。實(shí)驗(yàn)表明，桑黃對(duì)玉米粉的利用最佳，是我們篩選出來(lái)的最佳碳源。（4）桑黃菌絲對(duì)氮源的利用有較強(qiáng)的選擇性，黃豆餅粉是五種供試氮源中最佳的氮源，而桑黃對(duì)硝態(tài)氮的利用率差。（6）將篩選出來(lái)的最佳碳源（玉米粉）、最佳氮源（豆餅粉碳）以及最適pH（5.5～6.5）用于實(shí)驗(yàn)，即優(yōu)化的培養(yǎng)基為：3%玉米粉、1.2%黃豆餅粉、0.3%KH2PO4、0.15%MgSO4、20μg/100mL維生素B1和30μg/100mL維生素B2，pH為5.5～6.5；250mL的三角瓶中裝液量為70mL，接種后于溫度為30℃、轉(zhuǎn)速為130r/min的條件下用搖床培養(yǎng)發(fā)酵時(shí)間為7天。利用優(yōu)化的培養(yǎng)基培養(yǎng)桑黃，菌絲體干重達(dá)到7.089g/L，與PDA培養(yǎng)基相比，桑黃菌絲體產(chǎn)量提高了80.93%。4.2多糖提取工藝優(yōu)化（1）95%濃度的乙醇溶液粗多糖的析出量最多，單位收率最高85%及95%乙醇溶液的粗多糖的收率方差顯著性較小，而對(duì)75%的乙醇溶液的粗多糖的收率方差顯著性較大。如果采用85%的乙醇溶液進(jìn)行粗多糖的收率與使用95%的乙醇溶液進(jìn)行粗多糖的收率接近。在工業(yè)化生產(chǎn)過(guò)程中醇沉使用的乙醇需要回收利用，回收的乙醇達(dá)到85%濃度比達(dá)到95%濃度要節(jié)省動(dòng)力消耗，為多糖工業(yè)化生產(chǎn)上使用回收的乙醇提供了理論依據(jù)。（2）桑黃菌絲體采用水煎煮的方法來(lái)提取多糖，水提時(shí)間、水提次數(shù)、水提溫度對(duì)多糖的提取有非常顯著影響。經(jīng)分析，桑黃菌絲體最佳的提取工藝為:蒸煮時(shí)間2h；蒸煮次數(shù)為2次；用水量為菌絲體的50倍；水提溫度為100℃，得到最高胞內(nèi)多糖產(chǎn)量為0.108g多糖/g菌絲體。（3）采用超聲波預(yù)處理提取多糖可以減少水提時(shí)間，減少能耗。在超聲波預(yù)處理25min時(shí)，達(dá)到提取最大值，而后隨超聲時(shí)間延長(zhǎng)，多糖提取率有所下降，這是由于超聲處理數(shù)分鐘，細(xì)胞破碎程度增大后，細(xì)胞內(nèi)部的多糖物質(zhì)開(kāi)始向外擴(kuò)散，多糖的提取率開(kāi)始上升較快，達(dá)到最大值。但是超聲波具有較強(qiáng)的機(jī)械剪切作用，長(zhǎng)時(shí)間作用會(huì)使多糖結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致多糖提取率有所下降。另外，超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，細(xì)胞進(jìn)一步破碎，雜質(zhì)溶出，這也是多糖提取率有所下降的原因之一。因此確定本實(shí)驗(yàn)超聲時(shí)間為25min。由于桑黃菌的人工培養(yǎng)研究在國(guó)內(nèi)剛剛起步，還有許多問(wèn)題沒(méi)有搞清，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)：桑黃菌的生長(zhǎng)速度和生長(zhǎng)量的差異較大，重現(xiàn)性不好；在培養(yǎng)過(guò)程中出現(xiàn)不同形態(tài)的菌絲，培養(yǎng)液顏色也會(huì)出現(xiàn)差異；這些說(shuō)明桑黃菌的培養(yǎng)過(guò)程還有許多潛在的影響因素有待進(jìn)一步研究，液體培養(yǎng)條件有待進(jìn)一步優(yōu)化。同時(shí)，桑黃是一種藥用真菌，含有落葉松酸、脂肪酸、麥角甾醇等多種藥用成分，而主要成分是多糖，因此有必要在保證菌絲高產(chǎn)的同時(shí)，增加液體發(fā)酵條件下菌絲體中多糖及其它成分的含量，提高藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值?？傊?，利用液體發(fā)酵技術(shù)，不僅能在短期內(nèi)能獲得大量的桑黃的菌絲體，而且周期短不受季節(jié)和環(huán)境的限制，為工業(yè)化生產(chǎn)菌絲體提供了依據(jù)，為進(jìn)一步研究其發(fā)酵液的生物活性奠定了基礎(chǔ)，且可以大幅度地降低桑黃作為新藥開(kāi)發(fā)的成本，采用液體發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)桑黃菌絲體將是一種重要的方法，具有廣闊的前景。

第二篇桑黃菌絲發(fā)酵工藝放大設(shè)計(jì)第1章發(fā)酵過(guò)程的說(shuō)明書(shū)工業(yè)發(fā)酵過(guò)程的研究，一般分為三種規(guī)模或三個(gè)階段：1實(shí)驗(yàn)室規(guī)模，進(jìn)行菌種的篩選和培養(yǎng)基的研究；2中試工廠規(guī)模，確定菌種培養(yǎng)的最佳操作條件；3工廠生產(chǎn)規(guī)模，進(jìn)行大規(guī)模的生產(chǎn)，取得經(jīng)濟(jì)效益的過(guò)程。微生物培養(yǎng)過(guò)程的研究有兩個(gè)主要作用：一是將科研所的的新方法應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)；二是通過(guò)試驗(yàn)找到更好的菌種、最佳的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件以及更好的設(shè)備去改進(jìn)現(xiàn)行的生產(chǎn)。因此，一個(gè)工業(yè)微生物學(xué)家，首先就要在實(shí)驗(yàn)室對(duì)已篩出的心菌種（或改良的新菌株）進(jìn)行開(kāi)發(fā)研究，獲得高產(chǎn)基因表達(dá)的最佳條件，在逐步轉(zhuǎn)移到工廠生產(chǎn)中去，并能得到重顯，也就是所說(shuō)的新發(fā)酵工藝的放大；或者是，在現(xiàn)有生產(chǎn)中如何將實(shí)驗(yàn)室所得的培養(yǎng)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化（或放大）成生產(chǎn)工藝，達(dá)到工藝改革的目的。1.1工業(yè)發(fā)酵研究過(guò)程1.1.1實(shí)驗(yàn)室規(guī)模實(shí)驗(yàn)室規(guī)模進(jìn)行基本的生物細(xì)胞（菌種）的篩選和培養(yǎng)基的研究，確定該生物發(fā)酵技術(shù)工藝的可行性，初步選擇最優(yōu)的培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，常用大小不同的小發(fā)酵罐，見(jiàn)下表。有的罐體是玻璃制作的，有的是不銹鋼制作的。它們附有溫度、pH值、溶氧、氧化還原電位、泡沫、和液位等參數(shù)的傳感器，有的還有微型電子計(jì)算機(jī)，用于監(jiān)測(cè)和自動(dòng)控制發(fā)酵過(guò)程。因此，可以用這樣的設(shè)備考察通氣、溫度、培養(yǎng)基組成、pH值發(fā)酵時(shí)間等參數(shù)對(duì)發(fā)酵過(guò)程和速率的影響，也可考查對(duì)產(chǎn)物產(chǎn)量的影響。一般1L發(fā)酵罐用于制備種子和適應(yīng)性試驗(yàn)；4～28L發(fā)酵罐適用于基礎(chǔ)考查實(shí)驗(yàn)；30～150L或更大的發(fā)酵罐適用于中間放大試驗(yàn)等。經(jīng)過(guò)這樣的試驗(yàn)，即可為生產(chǎn)放大提供試驗(yàn)數(shù)據(jù)。本設(shè)計(jì)就是以這樣的思路，先進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室小試研究，找到最佳工藝，在以此為基礎(chǔ)，經(jīng)中試等進(jìn)行逐步放大設(shè)計(jì)。最終，得到生產(chǎn)規(guī)模的最佳工藝條件和操作條件。表1.1-1發(fā)酵裝置的類(lèi)型1.搖瓶培養(yǎng)裝置燒瓶大小每臺(tái)震蕩機(jī)500ml燒瓶的裝置轉(zhuǎn)速用途錐形大篩選和開(kāi)發(fā)燒瓶小2.實(shí)驗(yàn)室—中間工廠設(shè)備攪拌工作容積攪拌器用途發(fā)酵罐大?。↙）（直徑；轉(zhuǎn)速）小，研究試驗(yàn)中開(kāi)發(fā)和制備大開(kāi)發(fā)和提取注1）發(fā)酵裝置的類(lèi)型續(xù)表1.1.2中試規(guī)模中試是放大過(guò)程中重要的階段：（1）參考搖瓶的結(jié)果，用中小型的發(fā)酵反應(yīng)器進(jìn)行生物培養(yǎng)或發(fā)酵，進(jìn)一步確定最優(yōu)的培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件；（2）進(jìn)行環(huán)境因素的最佳操作條件的研究，以掌握細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)及產(chǎn)物生成動(dòng)力學(xué)等特性；（3）試驗(yàn)影響溶氧速率的因素及其關(guān)系，發(fā)酵熱及其降溫控制條件等反應(yīng)器設(shè)計(jì)參數(shù)，為反應(yīng)器的工業(yè)化放大提供依據(jù)。大多用50～500L規(guī)模的發(fā)酵反應(yīng)器進(jìn)行試驗(yàn)。中試不是一次性的驗(yàn)證行為，而是一個(gè)從小批量驗(yàn)證到逐漸放大產(chǎn)品驗(yàn)證數(shù)量的循序漸進(jìn)的過(guò)程。中試分為三個(gè)小階段：（1）小量中試：主要針對(duì)硬件、結(jié)構(gòu)、軟件設(shè)計(jì)驗(yàn)證，初步驗(yàn)證可生產(chǎn)性，可能包含一次或者數(shù)次生產(chǎn)，直到無(wú)重大硬件、結(jié)構(gòu)、軟件問(wèn)題為止；（2）放量中試：主要針對(duì)硬件、結(jié)構(gòu)、軟件、工藝、測(cè)試、維修、物料的驗(yàn)證，主要驗(yàn)證設(shè)計(jì)遺留問(wèn)題以及批量可生產(chǎn)性驗(yàn)證，直到無(wú)重大可生產(chǎn)性問(wèn)題為止；（3）小批量生產(chǎn)：主要對(duì)硬件、結(jié)構(gòu)、軟件、工藝、測(cè)試、維修、物料、質(zhì)量以及相關(guān)生產(chǎn)文件進(jìn)行全面驗(yàn)證，以可生產(chǎn)性驗(yàn)證為主；直到生產(chǎn)質(zhì)量管理成本、合格率到達(dá)企業(yè)目標(biāo)為止。1.1.3工廠生產(chǎn)規(guī)模工廠生產(chǎn)規(guī)模依據(jù)第一、二階段取得的數(shù)據(jù)，進(jìn)行生產(chǎn)規(guī)模的設(shè)計(jì)、試驗(yàn)、修正，直至在商業(yè)化生產(chǎn)中，再現(xiàn)甚至超過(guò)研究水平，向社會(huì)化、產(chǎn)業(yè)化提供技術(shù)和產(chǎn)品，獲得社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益。工業(yè)化反應(yīng)器20～2000m3不等，一般也需要逐級(jí)放大。本設(shè)計(jì)根據(jù)相關(guān)知識(shí)和經(jīng)驗(yàn)，逐步放大到100m3，具體過(guò)程：5L→250L→5→50→100。放大倍數(shù)依次為：50倍、20倍、10倍、2倍。1.2生物反應(yīng)器的比擬放大1.2.1放大的概念所謂生物反應(yīng)過(guò)程的放大，就是指以實(shí)驗(yàn)室或中試反應(yīng)器所取得的試驗(yàn)數(shù)據(jù)和規(guī)律為依據(jù)，設(shè)計(jì)、制造大規(guī)模的反應(yīng)器，以實(shí)現(xiàn)工業(yè)規(guī)模。在反應(yīng)器放大過(guò)程中，維持細(xì)胞生長(zhǎng)與生物反應(yīng)速率相似生產(chǎn)。生物發(fā)酵過(guò)程的復(fù)雜性遠(yuǎn)大于普通的化工過(guò)程，影響過(guò)程的參變數(shù)很多。即使對(duì)同一發(fā)酵生產(chǎn)使用不同規(guī)模的發(fā)酵罐中所進(jìn)行的生物反應(yīng)是相同的，但反應(yīng)溶液的混合狀態(tài)、傳質(zhì)與傳熱速率等不盡相同。因此，發(fā)酵過(guò)程的放大問(wèn)題，仍存在很多問(wèn)題。根據(jù)文獻(xiàn)和相關(guān)資料表明，在工業(yè)化放大發(fā)酵過(guò)程，大多采用經(jīng)驗(yàn)放大法。在生物反應(yīng)器的反應(yīng)系統(tǒng)中，存在3種不同類(lèi)型的重要過(guò)程，即熱力學(xué)過(guò)程、微觀動(dòng)力學(xué)過(guò)程和傳遞過(guò)程。傳遞過(guò)程受系統(tǒng)規(guī)模的影響很大。在發(fā)酵過(guò)程中游離分散狀態(tài)的生物細(xì)胞的生長(zhǎng)與代謝產(chǎn)物的生成是環(huán)境條件（如基質(zhì)和生長(zhǎng)因子的濃度、pH、溫度等）的函數(shù)，這些是培養(yǎng)基的組成與環(huán)境因素，與反應(yīng)器的規(guī)模基本無(wú)關(guān)。隨著反應(yīng)器規(guī)模的改變，系統(tǒng)內(nèi)的動(dòng)量傳遞過(guò)程就相應(yīng)變化，尤其是攪拌器對(duì)生物細(xì)胞的攪拌剪切作用隨反應(yīng)器規(guī)模增大而增強(qiáng)，不僅影響細(xì)胞（團(tuán)）的分散狀態(tài)如絮凝、懸浮、結(jié)成團(tuán)塊等，而且嚴(yán)重時(shí)還會(huì)使細(xì)胞本身產(chǎn)生剪切損傷作用。因此傳遞過(guò)程是放大的核心問(wèn)題。小型生物反應(yīng)器往往表現(xiàn)為反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模式即反應(yīng)速度控制，而大型生物反應(yīng)系統(tǒng)則受傳遞現(xiàn)象控制，其原因是小型反應(yīng)裝置的tc＞tf（或tD），而大型反應(yīng)器的tc＜tf（或tD）。1.2.2生物反應(yīng)器放大的目的任務(wù)應(yīng)用理論分析和實(shí)驗(yàn)研究相結(jié)合的方法，總結(jié)生物反應(yīng)系統(tǒng)的內(nèi)在規(guī)律及影響因素，重點(diǎn)研究解決有關(guān)的質(zhì)量傳遞、動(dòng)量傳遞和熱量傳遞問(wèn)題，以便在反應(yīng)器的放大過(guò)程中盡可能維持生物細(xì)胞的生長(zhǎng)速率、代謝產(chǎn)物的生成速率，這就是生物反應(yīng)器的放大目的。概括：以實(shí)驗(yàn)室或中試反應(yīng)器的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為依據(jù)，確定大規(guī)模反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)尺寸和操作參數(shù)。1.2.3生物反應(yīng)器放大的方法生物反應(yīng)器放大的放大有許多種，主要有理論放大方法、半理論放大方法、因次分析法、經(jīng)驗(yàn)放大方法。本設(shè)計(jì)根據(jù)設(shè)計(jì)方案采用經(jīng)驗(yàn)放大法。經(jīng)驗(yàn)法就是以試驗(yàn)為基礎(chǔ)，按照主導(dǎo)因素相等或接近的原則進(jìn)行放大的方法。表1.2-1通氣發(fā)酵罐放大準(zhǔn)則放大準(zhǔn)則所占比例維持不變30%維持不變30%維持?jǐn)嚢杵魅~端速度不變20%維持培養(yǎng)液溶氧濃度不變20%1.3機(jī)械攪拌通風(fēng)發(fā)酵罐的比擬放大1.3.1放大計(jì)算程序（1）明確試驗(yàn)條件和結(jié)果，明確放大要求和放大依據(jù)；（2）計(jì)算試驗(yàn)條件下的P0、Pg、、V線；（3）按幾何相似計(jì)算大罐的幾何尺寸；（4）按經(jīng)驗(yàn)選擇通氣空截流速（1.7—2m/min)，根據(jù)P0、Pg、關(guān)系式，按或P0/VL相等，求解大罐的轉(zhuǎn)速N；（5）對(duì)于絲狀菌絲體或?qū)嚢杓羟忻舾械纳锓磻?yīng)，還要根據(jù)攪拌葉尖線速度調(diào)整N與Di，使和V線均能符合要求；（6）列出放大前后對(duì)照表。1.3.2以體積溶氧系數(shù)或相等為基準(zhǔn)的放大法許多好氧發(fā)酵，特別是生物細(xì)胞濃度較高時(shí)耗氧很快，故溶氧速率是否能滿(mǎn)足生物細(xì)胞的代謝與生長(zhǎng)就成為生物發(fā)酵生產(chǎn)的限制性因素。生物發(fā)酵的耗氧速率可通過(guò)實(shí)驗(yàn)測(cè)定。實(shí)踐證明，高好氧發(fā)酵應(yīng)用等的原則進(jìn)行反應(yīng)器放大通?？色@得良好結(jié)果。（1）主要參數(shù)及計(jì)算公式不通氣的攪拌功率通氣攪拌功率循環(huán)時(shí)間循環(huán)速率攪拌器泵送能力混合時(shí)間體積溶氧系數(shù)（2）放大步驟（l）計(jì)算試驗(yàn)罐的值：求攪拌雷諾準(zhǔn)數(shù)→判斷發(fā)酵系統(tǒng)狀態(tài)→功率系數(shù)→求不通氣時(shí)攪拌功率→通氣時(shí)攪拌功率→根據(jù)空截面氣速算出試驗(yàn)罐的溶氧系數(shù)（2）按幾何相似原則確定試驗(yàn)罐的尺寸（3）確定大罐的通氣流速，計(jì)算通風(fēng)強(qiáng)度（4）按相等原則計(jì)算放大罐的攪拌轉(zhuǎn)速和攪拌軸功率（5）將計(jì)算結(jié)果列成表放大過(guò)程框圖見(jiàn)附錄1盡管試驗(yàn)罐和放大罐的溶氧系數(shù)相同，其幾何尺寸也相似，但經(jīng)放大后，大罐的通氣強(qiáng)度和攪拌轉(zhuǎn)速均大大下降。1.2單體發(fā)酵罐設(shè)計(jì)1.2.1本設(shè)計(jì)的是一臺(tái)100機(jī)械攪拌通風(fēng)發(fā)酵罐，發(fā)酵生產(chǎn)桑黃菌絲。經(jīng)查閱資料得知生產(chǎn)桑黃菌絲的最佳工藝條件是：搖瓶發(fā)酵最佳發(fā)酵條件為溫度32.3℃，pH5.1，搖床轉(zhuǎn)速176r/min，此時(shí)桑黃菌絲產(chǎn)量達(dá)到167.10mg/ml。得出最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組成為初始糖蜜43.0%、玉米漿2.1%、KH2PO44.7g/L。發(fā)酵罐主要由罐體和冷卻蛇管，以及攪拌裝置，傳動(dòng)裝置，軸封裝置，人孔和其它的一些附件組成。這次設(shè)計(jì)就是要對(duì)機(jī)械攪拌通風(fēng)發(fā)酵罐的幾何尺寸進(jìn)行計(jì)算；考慮壓力，溫度，腐蝕因素，選擇罐體材料，確定罐體外形、罐體和封頭的壁厚；根據(jù)發(fā)酵微生物產(chǎn)生的發(fā)酵熱、發(fā)酵罐的裝液量、冷卻方式等進(jìn)行冷卻裝置的設(shè)計(jì)、計(jì)算；根據(jù)上面的一系列計(jì)算選擇適合的攪拌裝置，傳動(dòng)裝置，和人孔等一些附件的確定，完成整個(gè)裝備圖，完成這次設(shè)計(jì)。表1.2-1

發(fā)酵罐主要設(shè)計(jì)條件步驟項(xiàng)目及代號(hào)參數(shù)及結(jié)果備注1發(fā)酵菌種高滲假絲酵母RH-UV-L4-F9由工藝條件確定2工作壓力0—0.1MPa由工藝條件確定3設(shè)計(jì)壓力0.2—0.3MPa由工藝條件確定4發(fā)酵溫度30由工藝條件確定5設(shè)計(jì)溫度100~140由工藝條件確定6冷卻方式蛇管冷卻由工藝條件確定設(shè)計(jì)工程中發(fā)酵罐的罐體尺寸設(shè)計(jì)根據(jù)、、、量值不變進(jìn)行計(jì)算，最終確定生產(chǎn)罐的尺寸大小。根據(jù)比擬放大法核算出生產(chǎn)罐的功率大小。發(fā)酵罐的附屬設(shè)備設(shè)計(jì)中采用相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行設(shè)計(jì)計(jì)算，最終確定生產(chǎn)罐的冷卻蛇管，以及攪拌裝置，傳動(dòng)裝置，軸封裝置，人孔和其它的一些附件組成。1.2.2罐體有灌頂、圓柱體與錐底3部分組成，其中：灌頂：為圓拱形，中央開(kāi)孔用于可拆卸大直徑法蘭，以安裝CO2與CIP管道及其連接件，灌頂還裝有真空閥，安全閥與壓力傳感器。圓柱體：為發(fā)酵罐主體，發(fā)酵罐的高度主要決定于圓柱體的直徑與徑高比，由于大直徑的光耐壓低，考慮到使用鋼板的厚度，一般直徑＜6.0m。圓錐底：它的夾角多為60~90°，也有90~120°，但這多用于大直徑的罐及大容量的罐；如夾角過(guò)小會(huì)使椎體部分很高。圓錐底的外壁一般安裝冷卻夾套、閥門(mén)與視鏡、取樣管閥、測(cè)溫、測(cè)壓的傳感元件或溫度計(jì)，CO2洗滌裝置等。發(fā)酵罐尺寸設(shè)計(jì)根據(jù)試驗(yàn)罐的相應(yīng)參數(shù)，采用幾何相似進(jìn)行設(shè)計(jì)。主要計(jì)算罐的直徑DT、高度H、攪拌器渦輪直徑D。桑黃菌絲發(fā)酵是好氧發(fā)酵，因此，在發(fā)酵過(guò)程中通氣和攪拌是十分重要的影響因素。好氧發(fā)酵需要通入充沛的空氣，以滿(mǎn)足微生物需氧要求，因而空氣量通入量越大，微生物獲得氧有可能越多;其次培養(yǎng)液層高度越大，空氣在培養(yǎng)基停留時(shí)間就有可能增加，有益于微生物利用空氣中的氧;但是空氣中氧是通過(guò)培養(yǎng)基傳遞給微生物，傳遞速率很大程度上取決氣液相的傳質(zhì)面積，也就是說(shuō)取決氣泡大小和氣泡的停留時(shí)間，氣泡越小和越分散就使微生物可以越充沛獲得氧氣，但是強(qiáng)化氣泡的粉碎單靠氣體分布器的形式和結(jié)構(gòu)是不夠的，或者說(shuō)效果是不明顯的，只有通過(guò)發(fā)酵罐內(nèi)的葉輪轉(zhuǎn)動(dòng)將氣泡粉碎，才可獲得最佳的發(fā)酵供氧條件。通過(guò)攪拌器的攪拌作用，使培養(yǎng)基在發(fā)酵罐內(nèi)得到充分宏觀混和，盡可能使微生物在罐內(nèi)每一處均能得到充足氧氣和培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，此外良好的攪拌有利于微生物發(fā)酵過(guò)程產(chǎn)生的熱量傳遞給冷卻管和發(fā)酵罐的冷卻內(nèi)表面。這就是具有通氣和攪拌的標(biāo)準(zhǔn)式發(fā)酵罐普遍使用在生化工程的原因。通氣裝置是指將無(wú)菌空氣導(dǎo)入培養(yǎng)基中的裝置，最簡(jiǎn)單的裝置是一單孔管，單孔管的出口位于罐的中央，開(kāi)口向下，以免培養(yǎng)基中的固體物質(zhì)在開(kāi)口處堆積和罐底固形物沉淀。近年來(lái)由于發(fā)酵罐的容積的增大，為了保證攪拌系統(tǒng)的穩(wěn)定運(yùn)行，在罐底設(shè)置了底軸承，因而占去了空氣管的位置，為了使空氣分布仍居中央，提出了將空氣管在罐內(nèi)分散成3-4個(gè)口，使其均勻分布在罐中央附近的設(shè)計(jì)方案。發(fā)酵罐內(nèi)安裝攪拌器首先用來(lái)分散氣泡以得到盡可能高的傳質(zhì)系數(shù)KLa。此外還要使被攪拌的發(fā)酵液循環(huán)來(lái)增加氣泡的平均停留時(shí)間，并在整個(gè)系統(tǒng)中均勻分布，阻止其聚并。近來(lái)發(fā)酵罐的攪拌系統(tǒng)多采用在罐底部安裝一個(gè)用來(lái)分散空氣的渦輪攪拌器，其上再安裝一組軸流式攪拌器，用來(lái)循環(huán)培養(yǎng)介質(zhì)、均勻分布?xì)馀?、加?qiáng)熱量傳遞和消除罐內(nèi)上、下部之間含氧量梯度差。根據(jù)文獻(xiàn)]，本設(shè)計(jì)所選擇的攪拌器為徑流渦輪/高效軸流攪拌器組合，其是20世紀(jì)80年代中期推出，其特點(diǎn)如下：罐底部裝徑向渦輪攪拌器，上部裝軸向流攪拌器；總體流形（flowpattern）較好，無(wú)死角，無(wú)分層現(xiàn)象對(duì)“氣泛”和混合時(shí)間有改善。將徑向流渦輪攪拌器與高效軸向流攪拌葉組合起來(lái)是較佳選擇。在分散氣體作業(yè)的罐內(nèi)，攪拌葉的數(shù)目取決于通氣的液面高度和罐直徑之比。攪拌器之間的距離一般為攪拌器直徑的1.4～2.0倍，而攪拌葉之間的距離不得小于最小攪拌葉的直徑。軸流式攪拌葉的直徑約為徑流式攪拌葉直徑的1.3倍。徑流式攪拌葉直徑為罐直徑的0.3～0.4倍，高效軸流攪拌葉直徑為罐直徑的0.4～0.65倍?？諝夥峙淦魑挥谧畹撞康臄嚢枞~之下。罐內(nèi)安裝4～6塊擋板；擋板寬度取罐徑，一般以罐徑較普遍，擋板離罐壁的距離為擋板寬度，這樣可以減少死角。氣-液反應(yīng)器的流動(dòng)型式?jīng)Q定分散的均勻度，并且影響氣體的截留率(gasholdup)、傳質(zhì)速率和局部溶氧濃度。第二章發(fā)酵放大設(shè)計(jì)計(jì)算2.1設(shè)計(jì)計(jì)算條件2.1.1設(shè)計(jì)主要條件及技術(shù)參數(shù)（1）放大倍數(shù)：依次為50倍、20倍、10倍、2倍。（2）放大次數(shù)：進(jìn)行四次逐級(jí)放大，并逐級(jí)優(yōu)化（3）設(shè)計(jì)罐容積：250L、5、50、100（4）放大方法：以（或）為基準(zhǔn)的放大方法（5）試驗(yàn)罐參數(shù)：表2.1-1試驗(yàn)罐基礎(chǔ)參數(shù)項(xiàng)目數(shù)值試驗(yàn)罐參數(shù)罐直徑（DT）145mm攪拌葉輪直徑（D）60mm高徑比H：DT2.07:1液深HL210mm裝液量70%通氣強(qiáng)度Q2.0vvm轉(zhuǎn)速（N）800發(fā)酵液參數(shù)發(fā)酵液配比葡萄糖300g/L，酵母膏5g/L，脲1g/L，MgSO4·7H2O5g/L黏度密度（6）生產(chǎn)罐設(shè)計(jì)參數(shù)：表2.1-2生產(chǎn)罐設(shè)計(jì)要求參數(shù)步驟項(xiàng)目及代號(hào)參數(shù)及結(jié)果備注1發(fā)酵菌種高滲假絲酵母RH-UV-L4-F9由工藝條件確定2工作壓力0~3MPa由工藝條件確定3設(shè)計(jì)壓力0~3MPa由工藝條件確定4發(fā)酵溫度32由工藝條件確定5設(shè)計(jì)溫度100~140由工藝條件確定6冷卻方式蛇管冷卻由工藝條件確定2.2設(shè)計(jì)基礎(chǔ)數(shù)據(jù)表2.2-1生產(chǎn)發(fā)酵罐參數(shù)項(xiàng)目數(shù)值罐體總體積（L）357工作體積（L）235罐體尺寸（含冷凝器）高度（mm）580580680通風(fēng)流量（SLPM）0~50~100~10氣體分布器r環(huán)形氣體分布器（SUS316L）入口過(guò)濾器0.2空氣過(guò)濾器空氣壓縮機(jī)空氣壓力冷凝器安裝在頂盤(pán)上的水冷冷凝器攪拌范圍50~1200rpm攪拌槳2只圓盤(pán)六彎葉渦輪，1個(gè)破泡漿傳感器磁性霍耳傳感器驅(qū)動(dòng)頂部驅(qū)動(dòng)功率為60W電機(jī)（可選100W）控制基于PID微處理器顯示以10為增量的數(shù)字顯示溫度范圍冷水溫度+3~80（精度0.1）控制PID加熱器200watt傳感器RTD（Pt-100）pH設(shè)定范圍pH2.0~12.0控制PID電極MettlerTolede或Hamiltonelectrode電源電源100V~240V/50~60Hz熔絲電流DC24V6A尺寸重量5表2.2-2水的物性數(shù)據(jù)物質(zhì)分子式相對(duì)分子量比熱容（）2040水H2O18.024.1834.174表2.2-3不同型號(hào)單壁罐參數(shù)商品號(hào)總體積（工作體積）內(nèi)徑（mm）內(nèi)高（mm）電極長(zhǎng)度（mm）最小工作體積（L）N攪拌槳直徑（mm）D/P（%）H：DTDTHPPF1G2SL021.5L（1L）1101501200.360551.36:1PF1G2SL033L（2.5L）1302201200.560451.7:1PF1G2SL055L（3L）1453002251.560422.07:1PF1G2SL077L（5L）1703102253.272451.82:1PF1G2SL1010L（7L）190355320680421.87:12.3初步放大設(shè)計(jì)計(jì)算發(fā)酵放大過(guò)程中必須遵循的前提是在大型發(fā)酵設(shè)備和小型設(shè)備中的菌體所處的整個(gè)環(huán)境條件，包括化學(xué)因素（基質(zhì)濃度、前體濃度等）和物理因素（溫度、黏度、pH等）必須是完全相同的。放大倍數(shù)實(shí)際上就是發(fā)酵罐體積的增加倍數(shù)。2.3.1發(fā)酵液流形的確定發(fā)酵液的組成[9]為：葡萄糖300g/L，酵母膏5g/L，脲1g/L，MgSO4·7H2O5g/L，pH5，32℃，搖床轉(zhuǎn)速800r/min，接種量10%。根據(jù)實(shí)驗(yàn)測(cè)得該發(fā)酵液滿(mǎn)足牛頓粘性定律，屬于牛頓流體。其中懸浮固體與懸浮液總體積之比為0.10。2.3.2發(fā)酵罐尺寸的計(jì)算根據(jù)幾何相似法計(jì)算發(fā)酵生產(chǎn)罐的尺寸：試驗(yàn)罐的幾何尺寸由表1-1得知：試驗(yàn)罐：四塊垂直擋板：（為擋板寬度）按幾何相似原則確定250L罐主尺寸：取有效容積70%，若忽略封底的容積，計(jì)算：則2.3.3通氣量的計(jì)算（1）試驗(yàn)罐的通氣量計(jì)算因?yàn)椋菏街校阂驗(yàn)樵囼?yàn)罐：vvm=2.0根據(jù)上式可以求得：（2）放大罐的通氣量計(jì)算確定放大后通氣流量Q：按幾何相似原則放大設(shè)備，放大倍數(shù)越高，單位容積液體具有的罐的橫截面積愈小，如果以vvm表示的通氣流量相等，則放大罐的比原型罐的要顯著增大。過(guò)大的將造成太多的泡沫盒帶出液體。因此，在確定放大罐的通氣流量Q時(shí)，必須考慮這個(gè)因素。通氣量的放大過(guò)程中，有三種放大原則：（1）（2）（3）本設(shè)計(jì)采用第三種放大原則，此時(shí)，選用公式，來(lái)關(guān)聯(lián)與其它量的關(guān)系時(shí)，則有：又因?yàn)椋?，并且，將?式代入上式，得到：及將相應(yīng)數(shù)據(jù)代入上式，可以計(jì)算出，因?yàn)樵O(shè)計(jì)壓力與試驗(yàn)壓力之比為1.5，所以：代入公式、、計(jì)算的：2.3.4攪拌器功率、轉(zhuǎn)速的計(jì)算（1）試驗(yàn)罐的值計(jì)算根據(jù)攪拌器類(lèi)型相等進(jìn)行設(shè)計(jì)計(jì)算。試驗(yàn)罐采用兩只圓盤(pán)六彎葉渦輪，因此設(shè)計(jì)罐同樣采用兩只圓盤(pán)六彎葉渦輪。通過(guò)試驗(yàn)，認(rèn)為此菌株是高耗氧速率菌，體系對(duì)剪切速率不敏感。故按等進(jìn)行設(shè)計(jì)計(jì)算。因?yàn)椋核詰?yīng)用和是等量的。Rushton關(guān)于單位傳質(zhì)面積上的傳質(zhì)速率的因次分析式[25]為：Calderbank關(guān)于通氣攪拌罐內(nèi)單位液體體積所具有的氣-液兩相界面的實(shí)驗(yàn)式[26]為：Richards將兩式結(jié)合起來(lái)。在亞硫酸鈉水溶液中，液相的黏度、密度、表面張力、氣體溶質(zhì)在液相中的擴(kuò)散度、氣泡最終上升速率可視為常量。又根據(jù)實(shí)驗(yàn)求的，得Richards關(guān)聯(lián)式[27]：福田秀雄等人對(duì)上式進(jìn)行修正，用60組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，得福田秀雄修正式：式中——以氧分壓為推動(dòng)力的體積溶解氧系數(shù)，——通氣時(shí)攪拌器軸功率，——裝液體積，——攪拌轉(zhuǎn)速，——空截面氣速，——渦輪只數(shù)試驗(yàn)罐裝有兩只圓盤(pán)六彎葉渦輪，轉(zhuǎn)速為所以，試驗(yàn)罐的亞硫酸鹽氧化值法值可求。由圖1-1得=4.7試驗(yàn)罐雙渦輪攪拌器功率：圖2.3-1幾種攪拌槳的曲線本圖是Rushton原圖的簡(jiǎn)化，原圖中共有14條曲線表2.3-2攪拌槳的曲線曲線號(hào)攪拌槳型號(hào)比例尺寸擋板數(shù)量/只1螺旋槳2.5~62~410.142圓盤(pán)平直葉渦輪2~72~40.7~1.60.143圓盤(pán)彎葉渦輪2~72~40.7~1.60.144圓盤(pán)箭葉渦輪2~72~40.7~1.60.14注：——分別為罐與渦輪槳葉直徑（m）——罐內(nèi)液面高度（m）——底部渦輪只罐底距離（m）——擋板寬度（m）同一攪拌器在相同的轉(zhuǎn)速下輸入的通氣液體的功率比輸入的不通氣液體的較低。常見(jiàn)的解釋就是通氣時(shí)液體的重度降低，導(dǎo)致攪拌功率的降低。Michel等人根據(jù)實(shí)驗(yàn)資料得出Michel經(jīng)驗(yàn)式。福田秀雄在Michel經(jīng)驗(yàn)式的基礎(chǔ)上，在100~40000L的五只設(shè)備對(duì)Michel經(jīng)驗(yàn)式進(jìn)行了校正。獲得：根據(jù)五只發(fā)酵設(shè)備的尺寸大小，攪拌渦輪數(shù)位1~3只。福田秀雄將60組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)在雙對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙標(biāo)繪，得出未知參量A、m，得修正的Michel式為：式中——通氣、不通氣時(shí)攪拌器的軸功率，——攪拌器轉(zhuǎn)速，——攪拌器直徑，——通氣流量，將試驗(yàn)罐的尺寸、轉(zhuǎn)速等代入修正的Michel式，得：則試驗(yàn)罐的值計(jì)算結(jié)果如下：（2）放大罐功率及轉(zhuǎn)速的計(jì)算按相等準(zhǔn)則決定放大罐的攪拌器的轉(zhuǎn)速及攪拌器的軸功率：按相等，則放大罐的將上式進(jìn)行化簡(jiǎn)，得：放大罐的：是放大罐兩只渦輪通氣時(shí)的攪拌功率。一個(gè)方程式中有兩個(gè)未知數(shù)，無(wú)法求解。故在從修正的Michel式列出的另一個(gè)算式，兩式中的相等。所以：是兩只渦輪不通氣時(shí)的攪拌軸功率。又知：聯(lián)立求解：解得：2.4逐步放大設(shè)計(jì)計(jì)算根據(jù)實(shí)際生產(chǎn)的過(guò)程，并參照谷氨酸發(fā)酵，通用式發(fā)酵罐尺寸，見(jiàn)下表[31]，進(jìn)行經(jīng)驗(yàn)優(yōu)化過(guò)程。為保障桑黃菌絲發(fā)酵的順利進(jìn)行，使攪拌器的轉(zhuǎn)速略大一些，其功率也略大一些。依據(jù)相同的計(jì)算原理，分別計(jì)算出5、50、100的發(fā)酵罐的攪拌器的轉(zhuǎn)速和軸功率。在計(jì)算工程中同樣對(duì)5、50、100的發(fā)酵罐進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證和優(yōu)化過(guò)程，保證桑黃菌絲的發(fā)酵以最高的轉(zhuǎn)化率進(jìn)行發(fā)酵。表2.4-1通用式發(fā)酵罐系列尺寸公稱(chēng)容積罐內(nèi)徑DT/mm攪拌槳直徑D/mm攪拌轉(zhuǎn)速r/min電動(dòng)機(jī)功率/kW冷卻方式50L3201124700.4夾套100L4001354000.4200L5001683600.6500L7002452651.11.09003152201.55.015005251605.510180063014513夾套或列管20230077012523列管續(xù)表1-7公稱(chēng)容積罐內(nèi)徑DT/mm攪拌槳直徑D/mm攪拌轉(zhuǎn)速r/min電動(dòng)機(jī)功率/kW冷卻方式503100105011055列管10040001350AA20050001700AA注：（1）本表以谷氨酸發(fā)酵罐為依據(jù)（采用兩組六彎葉攪拌槳）。（2）100m3以上的發(fā)酵罐要考慮傳到的方式，故有Δ的幾項(xiàng)為列入。2.4.1二次放大計(jì)算根據(jù)上面計(jì)算250L發(fā)酵罐的攪拌器的轉(zhuǎn)速和軸功率，實(shí)際中試生產(chǎn)過(guò)程中，參照表1-8，對(duì)易觀測(cè)參量進(jìn)行優(yōu)化。發(fā)酵罐的尺寸按設(shè)計(jì)計(jì)算量。優(yōu)化結(jié)果：表2.4-2250L發(fā)酵罐中試生產(chǎn)優(yōu)化結(jié)果參量