高效液相色譜法

高效液相色譜法

2018年10月5日

第一節(jié)高效液相色譜法簡介

第二節(jié)高效液相色譜儀構(gòu)造

(1)貯液罐、

(2)髙壓輸液泵、

(3)進樣裝置、

(4)色譜柱、

(5)檢測器、

(6)記錄儀數(shù)據(jù)處理裝置、

第三節(jié)固定相和流動相第四節(jié)高效液相色譜儀的使用和維護髙效液相色譜法是在20世紀60年代末期，從氣相色譜和經(jīng)典液相色譜的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的新型分離，分析技術(shù)。從分析原理上講，它和經(jīng)典的液相色譜沒有本質(zhì)的差別，但是由于它采用了新型高壓輸液泵、高靈敏度檢測器及高效微粒固定相，從而使經(jīng)典的液相色譜獲得了徹底的更新，煥發(fā)出新的活力。

現(xiàn)在高效液相色譜在分離速度、分離效能以及檢測靈敏度和自動化方面都達到了可以和氣相色譜相媲美的程度，并且還保持了液相色譜對樣品適用范圍廣、流動相可選擇的種類多及便于用作制備色譜等獨特的優(yōu)點。至今高效液相色譜已在化工生產(chǎn)、制藥工業(yè)、食品工業(yè)、生物化工、醫(yī)學(xué)臨床檢驗和環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域獲得廣泛的應(yīng)用。

第一節(jié)高效液相色譜法簡介—、方法特點髙效液相色譜法不受樣品揮發(fā)性的限制，它可完成氣相色譜法不易完成的分析任務(wù)，在使用中具有以下特點。(1)分離效能高由于新型高效微粒固定相填料的使用，它的柱效可達30000塊/m理論塔板數(shù)，遠遠大于氣相色譜填充柱2000塊/m理論塔板數(shù)的柱效。(2)

檢測靈敏度高如在髙效液相色譜中廣泛使用的紫外吸收檢測器，其最小檢測量可達10-9g，熒光檢測器的靈敏度可達10-11g。(3)分析速度快相對經(jīng)典液相色譜，其分析時間大大縮短。由于使用了高壓輸液泵，輸液壓力可達40MPa,使流動相流速大大加快，可達1?10mL/min，完成一個樣品分析僅需幾分鐘至幾十分鐘。(4)選擇性高

它不僅可分析有機化合物的同分異構(gòu)體，還可分析在性質(zhì)上極為相似的旋光異構(gòu)體，現(xiàn)已在高療效的藥物生產(chǎn)中發(fā)揮了極重要的作用。

高效液相色譜法發(fā)展的初期，由于高壓輸液泵的使用，加快了分析速度，曾將其稱為高壓液相色譜或髙速液相色譜。但這樣的名稱不能表達它具有的高柱效、高靈敏度、高選擇性的特點，因此現(xiàn)在廣泛采用高效液相色譜的名稱。為了突出它和經(jīng)典液相色譜的區(qū)別，有的文獻上也將它稱為現(xiàn)代液相色譜法。二、應(yīng)用范圍和局限性高效液相色譜法適于分析沸點高、相對分子質(zhì)量大，受熱易分解的不穩(wěn)定有機化合物、生物活性物質(zhì)以及多種天然產(chǎn)物。

這些化合物約占全部有機化合物的80%。髙效液相色譜的應(yīng)用范圍和氣相色譜法比較如圖17-1所示。高效液相色譜法雖具有適用范圍廣的優(yōu)點，但也有如下一些局限性：①高效液相色譜法中缺少像氣相色譜法中使用的熱導(dǎo)池檢測器，氫火焰離子化檢測器那樣的通用型檢測器。②離效液相色譜法中需使用多種溶劑，其成本比氣相色譜法髙，且易引起環(huán)境污染；當進行梯度淋洗時，操作比氣相色譜的程序升溫操作復(fù)雜。③髙效液相色譜法不能替代氣相色譜法去完成要求柱效達10萬塊理論塔板數(shù)以上的，組成復(fù)雜的石油樣品分析。

第二節(jié)

高效液相色譜儀高效液相色譜儀自1967年問世以來，由于吸取了氣相色譜儀研制的經(jīng)驗，獲得快速發(fā)展，提供的商品儀有如下兩種組合方式：①完全緊湊的整體系統(tǒng)死體積小、靈敏度高，體現(xiàn)髙效液相色譜儀總體實用的特點。②獨立部件的組合系統(tǒng)靈活性高，可根據(jù)不同目的，組裝成不同的連接方式。現(xiàn)在用微處理機控制的髙效液相色譜儀，其自動化程度很高，即能控制儀器的操作參數(shù)（如溶劑梯度洗脫、流動相流量、柱溫、自動進樣、洗脫液收集、檢測器功能等，又能對獲得的色譜圖進行收縮、放大、疊加以及對保留數(shù)據(jù)和峰高、峰面積進行處理等，為色譜分析工作者提供了髙效率、功能全面的分析工具。髙效液相色譜儀的組成示意圖構(gòu)成髙效液相色譜儀的主要部件：

貯液罐、髙壓輸液泵、進樣裝置、色譜柱、檢測器，記錄儀和數(shù)據(jù)處理裝置。一、流動相的儲液罐儲液罐的材料應(yīng)耐腐蝕，可為玻璃、不銹鋼或特種塑料聚醚醚酮（PEEK)。容積約為0.5?2.0L。分析中使用的流動相為有機溶劑、緩沖溶液、水及其混合物。使用前必

使用前必須進行脫氣處理，以除去其中溶解的氣體（如02)，以防止洗脫時當流動相由色譜柱流至檢測器時，因壓力降低而產(chǎn)生氣泡。若低死體積檢測池中存在氣泡會增加基線噪聲，嚴重時會造成分析靈敏度下降，而無法進行分析。流動相脫氣常使用抽真空或超聲振蕩方法，脫氣后的流動相液體應(yīng)密封保存以防止外部氣體的重新溶入。二、高壓輸液泵及梯度洗脫裝置

(一）離壓輸液泵對髙壓輸液泵的要求是：

①泵體材料能耐化學(xué)腐蝕通常使用普通耐酸不銹鋼或優(yōu)質(zhì)耐酸不銹鋼，為防止酸、堿緩沖溶液的腐蝕，在離子色譜或親和色譜分析中現(xiàn)已使用由聚醚醚酮（PEEK)材料制成的髙壓輸液泵。②能在髙壓下連續(xù)工作通常要求耐壓40?50MPa/cm2,能在8?24h連續(xù)工作。③輸出流量范圍寬對填充柱：0.1?10mL/min（分析型）1?100mL/min（制備型）。對微孔柱:10?1000ML/min（分析型）

1?9900ML/min（制備型）。④輸出流量穩(wěn)定，重復(fù)性髙高效液相色譜使用的檢測器，大多數(shù)對流量變化敏感，高壓輸液泵應(yīng)提供無脈沖流量。這樣可以降低基線噪聲并獲較好的檢測下限。流量控制的精密度應(yīng)小于1%，最好為0.5%，重復(fù)性最好為0.5%。高壓輸液泵可以分為兩類。1.桓流泵(1)注射型泵(2)往復(fù)型泵2.恒壓泵1.桓流泵恒流泵可輸出恒定體積流量的流動相。(1)注射型泵又稱注射式螺桿泵①工作原理它利用步進電動機經(jīng)齒輪螺桿傳動、帶動活塞以緩慢恒定的速度移動，使載液在高壓下以恒定流量輸出。當活塞達到每個輸出沖程末端時，暫時停止輸出流動相，然后以極快速度進入吸入沖程，再次將流動相由單向閥封閉的載液入口吸入泵中，再重新進人輸出沖程的運行。如此往復(fù)交替進行。②此泵的優(yōu)點是：可在髙輸液壓力下給出精確的(0.1%)無脈動、可重現(xiàn)的流量：可通過改變電動機的電壓，控制電動機的轉(zhuǎn)速，來改變活塞的移動速度，從而可調(diào)節(jié)流動相流量，使其輸出流量與系統(tǒng)阻力無關(guān)；因其流量穩(wěn)定、操作方便，可與多種高靈敏度檢測器連接使用。③此泵的缺點是：a.由于泵液缸容積（約100?150mL)有限，每次流動相輸完后，需重新吸人流動相，故當流動相流量大時，流動相中斷頻繁，不利于連續(xù)工作，使用兩臺泵交替工作可克服此不足之處。b.此泵在高壓下工作，對活塞和液缸間的密封要求髙，更換溶劑不方便，且價格昂貴。由于上述不足之處，現(xiàn)在注射式螵桿泵在高效液相色譜儀中使用較少，而廣泛用于超臨界流體色譜儀中。(2)往復(fù)型泵①工作原理:機械柱塞式往復(fù)泵，通常由電動機帶動凸輪（或偏心輪）轉(zhuǎn)動，再用凸輪驅(qū)動一活塞桿作往復(fù)運動，通過單向閥的開啟和關(guān)閉，定期將儲存在液缸里(0.1?0.5mL)的液體以高壓連續(xù)輸出。當改變電動機轉(zhuǎn)速時，通過調(diào)節(jié)活塞沖程的頻率（30?100次/min),就可調(diào)節(jié)輸出液體的流量。如圖所示。隔膜式往復(fù)泵的工作原理與柱塞式往復(fù)泵相似，只是流動相接觸的不是活塞，而是具有彈性的不銹鋼或聚四氟乙烯隔膜。此隔膜經(jīng)液壓驅(qū)動脈沖式地排出或吸人流動相。隔膜式往復(fù)泵的優(yōu)點是可避免流動相被污染。②往復(fù)型泵的優(yōu)點是：a.可在高壓下連續(xù)大量輸液。每個泵頭在活塞的輸出沖程中推動少量流動相進入色譜柱；在吸液沖程中利用單向閥從儲液罐吸流動相，此過程可反復(fù)、連續(xù)進行。b.此泵的液缸容積很小只有幾十至幾百微升，其柱塞尺寸小易于密封，柱塞、單向閥的閥球和閥座使用人造紅寶石材料，造價低廉，操作方便。③此泵的缺點是：a.輸出流動相雖然連續(xù)、恒流量，但存在脈動，若與對流量敏感的折光指數(shù)檢測器連接，就產(chǎn)生基線波動，難以進行準確的定量分析工作?？朔}動的影響可采取以下措施：第一，使用具有兩個泵頭的往復(fù)式泵，電動機帶動一個偏心輪，在相位相差180度的相反方向，同時驅(qū)動兩個柱塞，使一個泵頭輸液，另一個泵頭充液，從而可大大減少流動相輸出時的脈動現(xiàn)象（圖17-5)?，F(xiàn)在有的儀器已配備具有三個泵頭的往復(fù)泵，一個偏心輪在三個方向（相差120。）同時驅(qū)動三個柱塞（或三個機械閥），使輸液和充液的脈動進一步減小，從而輸出流量穩(wěn)定的流動相，見圖。第二，可在往復(fù)泵和進樣器之間安裝脈沖緩沖器或阻尼限制器。第三，可用電子器件調(diào)節(jié)活塞沖程頻率，以補償輸液的脈動。b.柱塞式往復(fù)泵，柱塞直接與流動相接觸造成污染。使用隔膜式往復(fù)泵可克服此缺點。c.長期運轉(zhuǎn)后，因流動相含有的機械雜質(zhì)會造成單向閥的阻塞；或因單向閥的閥球磨損不能關(guān)閉單向閥。這些都會造成往復(fù)泵不能正常工作。

至今柱塞式往復(fù)泵在髙效液相色譜儀中獲得最廣泛的應(yīng)用，也是最重要的高壓輸液泵。2.恒壓泵恒壓泵又稱氣動放大泵，是輸出恒定壓力的泵。當系統(tǒng)阻力不變時可保持恒定流量，當系統(tǒng)阻力發(fā)生變化時，就不能保持恒定流了。恒壓泵是利用氣體的壓力去驅(qū)動和調(diào)節(jié)流動相的壓力。通常采用壓縮空氣作為動力去驅(qū)動氣缸中橫截面積大的活塞5,再經(jīng)過一個連桿去驅(qū)動液缸中橫截面積小的活塞6。由于兩個活塞面積有一定的比例（約50:1)，則氣缸壓力P2至液缸壓力P1時，其壓力也增加相應(yīng)的倍數(shù)，而獲得輸出液的髙壓P1圖為氣動放大泵示意圖單液缸氣動放大泵，每個輸液沖程結(jié)束，氣缸和液缸活塞即快速反向運行而重新吸液，結(jié)果幾乎不中斷流動相輸出。但基線會有暫時（約1s)的波動。若其具有雙液缸，則可通過兩個電磁閥定時切換氣體壓力，實現(xiàn)在一個液缸輸液的同時，另一個液缸正在吸液，從而實現(xiàn)流動相連續(xù)輸出且不引起基線波動。使用氣動放大泵時，輸出流動相的流量不僅由泵的輸出壓力決定，還取決于流動相的黏度及色譜柱的壓力降（由柱長、固定相粒度和填充情況有關(guān)），因此在分析過程不能獲得穩(wěn)定的流量。氣動放大泵的優(yōu)點是：能以比較簡單的方式建立高壓并輸出無脈動的恒壓流動相液流；可與折光指數(shù)檢測器配合使用；可利用改變氣源壓力的方法來調(diào)節(jié)載液流速。此泵的缺點是：不能輸出恒定流量的流動相；不易測出重復(fù)的保留時間；不能獲得可靠的定性結(jié)果。此外由于泵的液缸體積大約70mL，更換載液時操作不方便。在高效液相色譜儀發(fā)展初期，恒壓泵使用較多，隨往復(fù)式恒流泵的廣泛使用，恒壓泵現(xiàn)已不再使用。但在制備高效液相色譜柱時，使用的勻漿裝柱機都配備氣動放大泵，以快速建立所需的離壓輸出。（二）輸液系統(tǒng)的輔助設(shè)備為給色譜柱提供穩(wěn)定、無脈動、流量準確的流動相，釋有高壓輸液泵外，還需配備管道過濾器和脈動阻尼器。1.管道過濾器

在高壓輸液泵的進口和它的出口與進樣閥之間，應(yīng)設(shè)置過濾器：髙壓輸液泵的柱塞和進樣閥閥芯的機械加工精密度非常高，微小機械雜質(zhì)進入流動相，會導(dǎo)致上述部件的損壞；同時機械雜質(zhì)在柱頭的積累，會造成柱壓升高，使色譜柱不能正常工作，因此管道過濾器的安裝是十分必要的。過濾器的濾芯是用不銹鋼燒結(jié)材料制造的，孔徑約2?3微米,耐有機溶劑的侵蝕。若發(fā)現(xiàn)過濾器堵塞（發(fā)生流量減小的現(xiàn)象），可將其浸入稀HN03溶液中，在超聲波清洗器中用超聲波振蕩10?15min，即可將堵塞的固體雜質(zhì)洗出。若淸洗后仍不能達到要求，則應(yīng)更換濾芯。2.脈動阻尼器往復(fù)式柱塞泵輸出的壓力脈動，會引起記錄儀基線的波動，這種脈動可以通過在高壓輸液泵出口與色譜柱人口之間安裝一個脈動阻尼器（或稱緩沖器）來加以消除。圖17-8為幾種脈動阻尼器示意圖。其中圖17-8(a)為最簡單的常用的脈動阻尼器，它由一根徑約1.1?1.5mm，內(nèi)徑0.25mm，長約5m的螺旋狀不銹鋼毛細管組成，利用它的撓性來阻滯壓力和流量的波動，起到緩沖作用，毛細管內(nèi)徑越細，其阻滯作用越大。這種阻尼器制作簡單，但會引起系統(tǒng)一定的壓力損失。如將它改裝成圖17-8C所示的三通式，可避免壓力損失，且阻尼效果更好。圖17-8(c)和圖17-8(d)分別是可調(diào)彈簧式和波紋管式脈動阻尼器，它們的阻尼效果好，但其體積大，更換溶劑很不方便不適于梯度洗脫。圖17-8(e)為一種新式脈動阻尼器，它的內(nèi)管壁用彈性材料制成，內(nèi)、外管之間裝有已脫氣可壓縮的液體，內(nèi)管的彈性和裝填液體的可壓縮性，都可吸收輸液系統(tǒng)中的壓力波動。這種阻尼器死體積小，適用于梯度洗脫。在輸液系統(tǒng)中還應(yīng)配備由壓力傳感器組成的壓力測量、顯示裝置及流動相流量的測量裝置。(三)梯度洗脫裝置梯度洗脫是使流動相中含有兩種或兩種以上不同極性的溶劑，在洗脫過程連續(xù)或間斷改變流動相的組成，以調(diào)節(jié)它的極性，使每個流出的組分都有合適的容量因子，并使樣品中的所有組分可在最短的分析時間內(nèi)，以適用的分離度獲得圓滿地選擇性地分離。梯度洗脫技術(shù)可以提高柱效、縮短分析時間，并可改善檢測器的靈敏度。當樣品中第一個組分的值和最后一個峰的值相差幾十倍至上百倍時，使用梯度洗脫的效果就特別好。此技術(shù)相似于氣相色譜中使用的程序升溫技術(shù)，現(xiàn)已在高效液相色譜法中獲得廣泛的應(yīng)用，它可以低壓梯度和高壓梯度兩種方式進行操作。1.低壓梯度（外梯度）在常壓下將兩種溶劑（或多元溶劑）輸至混合器中混合，然后用高壓輸液泵將流動相輸入到色譜柱中，其裝置如圖17-9所示。此法的主要優(yōu)點是僅需使用一個高壓輸液泵。2.高壓梯度（內(nèi)梯度）目前，大多數(shù)髙效液相色譜儀皆配有髙壓梯度裝置，它是用兩臺髙壓輸液泵將強度不同的兩種溶劑A、B輸入混合室，進行混合后再進入色譜柱。兩種溶劑進入混合室的比例可由溶劑程序控制器或計算機來調(diào)節(jié)。此類裝置如圖17-11所示，它的主要優(yōu)點是兩臺高壓輸液泵的流量皆可獨立控制，可獲得任何形式的梯度程序，且易于實現(xiàn)自動化。由于高壓梯度裝置中，每種溶劑是分別由泵輸送的，進入混合器后，溶劑的可壓縮性和溶劑混合時熱力學(xué)體積的變化，可能影響輸入到色譜柱中的流動相的組成。在梯度洗脫中為保證流速穩(wěn)定必須使用恒流泵，否則很難獲得重復(fù)性結(jié)果。三、進樣裝置在高效液相色譜分析中由于使用了高效微粒固定相及高壓流動相，樣品以柱塞式注入色譜柱后，因柱的阻力大，樣品分子在柱中的分子擴散很小，直至它從色譜柱流出后，也未與色譜柱內(nèi)壁接觸，因而引起的色譜峰形擴展很小，能保持高柱效。此現(xiàn)象常稱作髙效液相色譜分析中的“無限直徑效應(yīng)”。在髙效液相色譜分析中如何保持柱塞式進樣就是一個重要的關(guān)鍵操作。進樣時應(yīng)將樣品定量地瞬間注人色譜柱的上端填料中心，形成集中的一點。常用的進樣器有以下兩種：1.注射器進樣裝置用高效液相色譜專用注射器抽取一定量的樣品，經(jīng)橡膠進樣隔墊注入到色譜柱頭。對使用水-醇體系作流動相的反相色譜可使用硅橡膠隔墊。對使用多種有機溶劑的正相色譜應(yīng)使用亞硝基氟橡膠隔墊。當色譜柱操作壓力超過15MPa時，帶壓操作會引起流動相泄漏，為此可采用停流進樣技術(shù)。即進樣前，先打開流動相泄流閥，使柱前壓降至常壓，再用注射器進樣，然后關(guān)閉泄流閥，完成一次進樣。這種停流進樣技術(shù)可取得與帶壓進樣時的同樣效果。2.六通閥進樣使用耐髙壓、低死體積的六通閥進樣，其原理與氣相色譜中的氣體樣品的六通閥進樣完全相似（圖17-14)。此閥的閥體用不銹鋼材料，旋轉(zhuǎn)密封部分由堅硬的合金陶瓷材料制成，既耐磨、密封，性能又好。當進樣閥手柄置“取樣”位置，用特制的平頭注射器(10mL)吸取比定量管體積（5微升或10微升)稍多的樣品從“6”處注入定量管，多余的樣品由“5”排出。再將進樣閥手柄置“進樣”位置，流動相將樣品攜帶進人色譜柱。此種進樣重現(xiàn)性好，能耐20MPa高壓。此外還可使用自動進樣裝置，它是由計算機自動控制定量閥工作。取樣、進樣、復(fù)位、樣品管路清洗和樣品盤的轉(zhuǎn)動，全部按預(yù)定程序自動進行，一次可進行幾十個或上百個樣品的自動分析。自進樣的樣品量可連續(xù)調(diào)節(jié)，進樣重復(fù)性高，適合作大量樣品分析。但此裝置一次性投資很髙，目前在國內(nèi)尚未得到廣泛應(yīng)用。

四、色譜柱色譜柱是髙效液相色譜儀的最重要的部件。1.柱材料常用內(nèi)壁拋光的不銹鋼管作色譜柱的柱管以獲得髙柱效。使用管先用氯仿、甲醇，水依次清洗，再用50%的HN03對柱內(nèi)壁作鈍化處理。鈍化時使HN03在柱管內(nèi)至少滯留10min,以在內(nèi)壁形成鈍化的氧化物涂層。2.柱規(guī)格一般采用直形柱管，標準填充柱柱管內(nèi)徑為4.6mm或3.9mm,長10?50cm，填料粒度5?10微米時，柱效達7000?10000塊/m理論塔板數(shù)。使用3?5微米填料，柱長可減至5?10cm。當使用內(nèi)徑在0.5?1.0mm的微孔填充柱或內(nèi)徑為30?50pm的毛細管柱時，柱長為15?50cm。當使用粗內(nèi)徑短柱或細內(nèi)徑長柱時，應(yīng)注意由于柱內(nèi)體積減小，由柱外效應(yīng)引起的峰形擴展不可忽視。此時應(yīng)對進樣器、檢測器和連接接頭作特殊設(shè)計以減少柱外死體積。這對儀器和實驗技術(shù)提出了更高的要求。但這樣會降低流動相的消耗量并提髙檢測靈敏度。3.柱填料高效液相色譜柱裝填的固定相粒度多為5?10微米或3?5微米以全多孔球形或無定形硅膠、三氧化二鋁、二氧化鋯、苯乙烯-二乙烯基苯共聚微球、脲醛樹脂微球為基體，其表面經(jīng)化學(xué)改性并經(jīng)化學(xué)鍵合制成：非極性烷基（C4、Cs、C18)、苯基固定相，弱極性的酚基、醚基、二醇基、芳硝基固定相和極性腈基、胺基、二胺基固定相；具有磺酸基和季銨基的離子色譜固定相；具有不同孔徑的凝膠色譜固定相。4.保護柱保護柱為內(nèi)徑2.0?4.6mm,長度不超過3cm的短柱，填充和分析柱相同的固定相，它的作用是收集、阻斷來自進樣器的機械雜質(zhì)和化學(xué)雜質(zhì)，以保護和延長分析柱的使用壽命。保護柱填充的填料是消耗品，通常分析50?100次樣品就應(yīng)更換，使用保護柱會使分析柱柱效稍有損失，用得當對分離效果無影響。有些廠商將流路過濾器和保護柱組裝成一個單元，安裝在進樣器和分析柱之間，使用很方便。5.柱接頭和連接管柱接頭通過過濾片與色譜柱管連接，在色譜柱管的上、下兩端要安裝過濾片，過濾片一般用多孔不銹鋼燒結(jié)材料。此燒結(jié)片上的孔徑小于填料顆粒直徑，卻讓流動相順利通過，并可阻擋流動相中的極小的機械雜質(zhì)以保護色譜柱。柱出、入口的連接管的死體積亦應(yīng)愈小愈好，一般常用窄孔（內(nèi)徑0.13mm)的厚壁（1.5?2.0mm)不鎊鋼管，以減少柱外死體積。柱管兩端柱接頭的連接方式如圖17-15所示，所用柱接頭，連接螺帽，密封圈皆為不銹鋼材料。

五、檢測器在高效液相色譜儀中檢測器是三大關(guān)鍵部件（髙壓輸液泵、色譜柱、檢測器）之一。常用的檢測器為紫外吸收檢測器（UVD)、折光播數(shù)檢測器（RID）、電導(dǎo)檢測器（ECD）、熒光檢測器（FD）和蒸發(fā)光散射檢測（ELSD）。一、檢測器的分類和響應(yīng)特性(一）分類1.按檢測的對象分類(1)整體性質(zhì)檢測器檢測從色譜柱中流出的流動相總體物理性質(zhì)的變化櫝況。如折光指數(shù)檢測器（RID)和電導(dǎo)檢測器(ECD),它們分別測定柱后流出液總體的折射率和電導(dǎo)率。此類檢測器測定靈敏度低，必須用雙流路進行補償測量；易受溫度和流量波動的影響，造成較大的漂移和噪聲；不適合于痕量分析和梯度洗脫。(2)溶質(zhì)性質(zhì)檢測器此類檢測器只檢測柱后流出液中溶質(zhì)的某一物理或化學(xué)性質(zhì)的變化。例如，紫外吸收檢測器(UVD)和熒光檢測器（FD),它們分別測量溶質(zhì)對紫外光的吸收和溶質(zhì)在紫外光照射下發(fā)射的熒光強度。此類檢測器靈敏度高，可單流路或雙流路補償測量，對流動相流量和溫度變化不敏感。但不能使用對紫外線有吸收的流動相。它們可用于痕量分析和梯度洗脫。2.按適用性分類(1)選擇性檢測器它對不同組成的物質(zhì)響應(yīng)差別極大，因此只能選擇性的檢測某些物質(zhì)，如紫外吸收檢測器、熒光檢測器和電導(dǎo)檢測器。(2)通用型檢測器它對大多數(shù)物質(zhì)的響應(yīng)相差不大幾乎適用于所有物質(zhì)。折光指數(shù)檢測器屬于通用型檢測器，但它的靈敏度低，受溫度影響波動大、使用時有一定局限性。上面提到的UVD、RID、FD、ECD4種檢測器皆屬于非破壞性檢測器，樣品流出檢測器后可進行餾分收集，并可與其它檢測器串聯(lián)使用。對熒光檢測器因測定中加人熒光試劑，其對樣品會產(chǎn)生沾污，當串聯(lián)使用時應(yīng)將它放在最后檢測。（二）檢測器的性能指標在評價檢測器時，要強調(diào)以下幾點：(1)噪聲通常噪聲是指由儀器的電器元件、溫度波動、電壓的線性脈沖以及其它非溶質(zhì)作用產(chǎn)生的髙頻噪聲和基線的無規(guī)則波動。高頻噪聲似“絨毛”使基線變寬；短周期噪聲是記錄器的基線變化，呈無規(guī)則的峰或谷。噪聲的存在會降低檢測靈敏度，嚴重時使儀器無法工作。(2)基線漂移漂移是基線的一種向上或向下的緩慢移動，可在較長時間（0.5?1.0h)觀察到。它可掩蔽噪聲和小峰。漂移與整個液相色譜系統(tǒng)有關(guān)，而不僅是由檢測器引起的。(3)靈敏度（最小檢出濃度或最小檢出量）在一個特定分離工作中，檢測器是否有足夠的靈敏度是十分重要的。當比較檢測器時，常使用敏感度這一性能指標。敏感度即指信號與噪聲的比值(信噪比）等于2時，在單位時間內(nèi)進入檢測器的溶質(zhì)的濃度或質(zhì)量。(4)線性范圍在進行定量分析時，希望檢測器有寬的線性范圍，以便在一次分析中可同時對主要組分和痕量組分同時進行檢測。(5)檢測器的池體積它應(yīng)小于最早流出的死時間色譜峰的洗脫體積的1/10，否則會產(chǎn)生嚴重的柱外譜帶擴展。一紫外吸收檢測器紫外吸收檢測器（UVD)是髙效液相色譜儀中使用最廣泛的一種檢測器，它分為固定波長，可變波長和二極管陣列檢測三種類型，分別介紹如下。1.固定波長紫外吸收檢測器固定波長紫外吸收檢測器，由低壓汞燈提供固定波長A=254nm(或A=280nm)的紫外光，其結(jié)構(gòu)如圖17-16所示。由低壓汞燈發(fā)出的紫外光經(jīng)入射石英棱鏡準直、再經(jīng)遮光板分為一對平行光束分別進入流通池的測量臂和參比臂。經(jīng)流通池吸收后的出射光，經(jīng)過遮光板、出射石英棱鏡及紫外濾光片，只讓254nm的紫外光被雙光電池接收。雙光電池檢測的光強度經(jīng)對數(shù)放大器轉(zhuǎn)化成吸光度后，經(jīng)放大器輸送至記錄儀。為減少死體積，流通池的體積很小，僅為5?10微升，光路約5?10mm,結(jié)構(gòu)常采用H形，如圖17-17所示。此檢測器結(jié)構(gòu)緊湊、造價低、操作維修方便、靈敏度髙適于梯度洗脫。2.可變波長紫外吸收檢測器可變波長紫外吸收檢測器的結(jié)構(gòu)示意圖。由光源（氘燈-紫外光；鎢燈-可見光）發(fā)出的光經(jīng)凹面鏡、入口狹縫進入單色器，從出口狹縫射出。經(jīng)濾光片，由調(diào)制器將光線分別交替射人測量池和參比池光路。再經(jīng)凹面反光鏡，將光聚集在光電倍增管進行檢測。

可變波長紫外吸收檢測器，由于可選擇的波長范圍很大，既提高了檢測器的選擇性，又可選用組分的最靈敏吸收波長進行測定，從而提高了檢測的靈敏度。它還有停流掃描功能，可繪出組分的光吸收譜圖，以進行吸收波長的選擇。3.光二極管陣列檢測器光二極管陣列檢測器（PDAD)是20世紀80年代發(fā)展起來的一種新型紫外吸收檢測器，它與普通紫外吸收檢測器的區(qū)別在于進入流通池的不再是單色光，獲得的檢測信號不是在單一波長上的，而是在全部紫外光波長上的色譜信號。因此它不僅可進行定量檢測，還可提供組分的光譜定性的信息。單光路二極管陣列檢測器的光路示意圖如圖17-19所示。由氘燈發(fā)出的紫外光經(jīng)消除色差透鏡系統(tǒng)聚焦后，照射到流通（4.5微升）上，透過光經(jīng)全息凹面衍射光柵色散后，由一個二極管陣列檢測元件接收。此光路系統(tǒng)中光閘是惟一的運動部件，它有三個動作位置：①光閘將入射光束全部遮擋，以進行暗電流補償；②將氧化鈥濾光片插入光路，對衍射后的波長進行精確校正；③打開光閘使人射光通過流通池照在光柵上。此光學(xué)系統(tǒng)稱為“反置光學(xué)系統(tǒng)”，不同于一般紫外吸收檢測器的光路。其中二極管陣列檢測元件，可由1024、512或211個光電二極管組成，可同時檢測180?600mn的全部紫外光和可見光的波長范圍內(nèi)的信號。由211個光電二極管構(gòu)成的陣列元件，可在10ms內(nèi)完成一次檢測，因此在1s(1000ms)內(nèi)，可進行快速掃描以采集20000個檢測數(shù)據(jù)。它可繪制出隨時間t的變化進入檢測器液流的光譜吸收曲線—吸光度（A）隨波長A變化的曲線，因而可由獲得的A、t信息繪制出具有三維空間的立體色譜圖(圖17-20),可用于被測組分的定性分析及純度測定。二、折光指數(shù)檢測器折光指數(shù)檢測器（RID)又稱示差折光檢測器（DRD），它是用連續(xù)監(jiān)測參比池和測量池中溶液的折射率之差的方法來測定試樣濃度的檢測器。由于每種物質(zhì)都具有與其它物質(zhì)不相同的折射率，因此RID是一種通用型檢測器。溶液的折射率等于溶劑及其中所含各組分溶質(zhì)的折射率與其各自的摩爾分數(shù)的乘積之和。當樣品濃度低時，由樣品在流動相中流經(jīng)測量池時的折射率與純流動相流經(jīng)參比池時的折射率之差，指示出樣品在流動相中的濃度。此類檢測器一般不能用于梯度洗脫，因為它對流動相組成的任何變化都有明顯的響應(yīng)，會干擾被測樣品的監(jiān)測。折光指數(shù)檢測器按工作原理可分為反射式、偏轉(zhuǎn)式和干涉式三種。其中干涉式造價昂貴使用較少。偏轉(zhuǎn)式池體積大（約10微升)，可適用于各種溶劑折光指數(shù)的測定。反射式池體積?。s3微升），應(yīng)用較多，但當測定不同的折光指數(shù)范圍的樣品時(通常折光指數(shù)分為1.31?1.44和1.40?1.60兩個區(qū)間），需要更換固定在三棱鏡上的流通池。三、電導(dǎo)檢測器電導(dǎo)檢測器（ECD）是一種選擇性檢測器，用于檢測陽離子或陰離子，其在離子色譜中獲得廣泛應(yīng)用。由于電導(dǎo)率隨溫度變化，因此測量時要保持恒溫。它不適用于梯度洗脫。透過空氣-三棱鏡界面、三棱鏡-液體界面的平行光，由池底鏡面折射后再反射出來，再經(jīng)透鏡L2聚焦在雙光電管D上。信號經(jīng)放大后，送入記錄儀或微處理機繪出色譜圖。此檢測器就是通過測定經(jīng)流動相折射后反射光的強度變化，來檢測樣品中組分濃度。電導(dǎo)檢測器結(jié)構(gòu)如圖17-22所示。其主體為由玻璃碳（或鉑片）制成的導(dǎo)電正極和負極。兩電極間用0.05mm厚的聚四氟乙烯薄膜分隔開。此薄膜中間開一長條形孔道作為流通池，僅有1?3微升的體積，正、負電極間僅相距0.05mm，當流動相中含有的離子通過流通池時，會引起電導(dǎo)率的改變。此二電極構(gòu)成交流電橋的臂，電橋產(chǎn)生的不平衡信號，經(jīng)放大、整流后輸入記錄儀。此檢測器具有較高靈敏度，能檢測電導(dǎo)率的差值為5X10-4

S/m2的組分。當使用緩沖溶液作流動相時，其檢測靈敏度會下降。四、熒光檢測器熒光檢測器（FD)是利用某些溶質(zhì)在受紫外光激發(fā)后，能發(fā)射可見光（熒光）的性質(zhì)來進行檢測的。它是一種具有髙靈敏度和高選擇性的檢測器。對不產(chǎn)生熒光的物質(zhì)，可使其與熒光試劑反應(yīng)，制成可發(fā)生熒光的衍生物再進行測定。熒光檢測器的靈敏度比紫外吸收檢測器髙100倍，當要對痕量組分進行選擇性檢測時，它是一種有力的檢測工具。但它的線性范圍較窄，不宜作為一般的檢測器來使用的，可用于梯度洗脫。測定中不能使用可熄滅、抑制或吸收熒光的溶劑作流動相。對不能直接產(chǎn)生熒光的物質(zhì)，要使用色譜柱后衍生技術(shù)，操作比較復(fù)雜。此檢測器現(xiàn)已在生物化工、臨床醫(yī)學(xué)檢驗、食品檢驗、環(huán)境監(jiān)測中獲得廣泛的應(yīng)用。五、蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）在髙效液相色譜分析中，人們一直希望能有一臺像FID那樣的通用型質(zhì)量檢測器，它能對各種物質(zhì)均有響應(yīng)，且響應(yīng)因子基本一致，它的檢測不依賴于樣品分子中的官能團，且可用于梯度洗脫。目前最能接近滿足這些要求的就是蒸發(fā)光散射檢測器圖17-24為蒸發(fā)光散射檢測器工作原理示意圖。色譜柱后流出物在通向檢測器途中，被髙速載氣（N2）噴成霧狀液滴。在受溫度控制的蒸發(fā)漂移管中，流動相不斷蒸發(fā)，溶質(zhì)形成不揮發(fā)的微小顆粒，被載氣載帶通過檢測系統(tǒng)。檢測系統(tǒng)由一個激光光源和一個光二極管檢測器構(gòu)成。在散射室中，光被散射的程度取決于散射室中溶質(zhì)顆粒的大小和數(shù)量。粒子的數(shù)量取決于流動相的性質(zhì)及噴霧氣體和流動相的流速。當流動相和噴霧氣體的流速恒定時，散射光的強度僅取決于溶質(zhì)的濃度。此檢測器可用于梯度洗脫，且響應(yīng)值僅與光束中溶質(zhì)顆粒的大小和數(shù)量有關(guān)，而與溶質(zhì)的化學(xué)組成無關(guān)。蒸發(fā)光散射檢測器與RID和UVD比較，它消除了溶劑的干擾和因溫度變化引起的基線漂移，即使用梯度洗脫也不會產(chǎn)生基線漂移。它還具有噴霧器、漂移管易于清洗；死體積小，靈敏度高；噴霧氣體消耗少等優(yōu)點?？梢灶A(yù)料，此種檢測器現(xiàn)已獲得廣泛應(yīng)用。

高效液相色譜檢測器的聯(lián)用在髙效液相色譜分析中為實現(xiàn)一次進樣獲取多重信息，可在色譜柱后利用等比例分流器（三通），并聯(lián)兩個檢測器（UVD和RID);或在色譜柱后串聯(lián)一個UVD和一個RID，實現(xiàn)非破壞性檢測器的聯(lián)用。六、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)高效液相色譜分析使用的數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)與氣相色譜分析使用的完全相同。分析結(jié)果除可用記錄儀繪制譜圖外，現(xiàn)已廣泛使用微處理機和色譜數(shù)據(jù)工作站來記錄和處理色譜分析的數(shù)據(jù)。微處理機在每次色譜分析結(jié)束，可繪出色譜圖，自動打印出分析結(jié)果。它也可通過對色譜參數(shù)的逐個提問，來進行指令定時控制，如，自動進樣、流量變化、梯度洗脫（或程序升溫）、級分收集、譜圖儲存等，可指導(dǎo)操作者輸人相應(yīng)的數(shù)據(jù)，可利用鍵盤給出指令和數(shù)據(jù)。色譜數(shù)據(jù)工作站的出現(xiàn)，不僅大大提髙色譜分析工作的速度，為色譜分析工作者進行理論研究、開拓新型分析方法創(chuàng)造了有利條件?？梢灶A(yù)料隨電子計算機技術(shù)的迅速發(fā)展，色譜數(shù)據(jù)工作站的功能也會日益完善。

第三節(jié)固定相和流動相一、液固吸附色譜液固吸附色譜法的固定相為固體吸附劑，常用的是碳酸鈣、硅膠、三氧化二鋁、氧化鎂、活性炭等。尤其是硅膠，它在經(jīng)典柱色譜和薄層色譜中已獲廣泛應(yīng)用，在高效液相（柱）色譜中，使用了特制的全多孔微粒硅膠，它不僅可直接用作液固色譜法的固定相，還是液液色譜法和鍵合相色譜法固定相的主要基體材料。

液固吸附色譜法對具有中等分子量的油溶性樣品（如油品、脂肪、芳烴等）可獲最佳的分離，而對強極性或離子型樣品，因有時會發(fā)生不可逆吸附，常不能獲得滿意的分離效果。液固色譜法對具有不同極性取代基的化合物或異構(gòu)體混合物表現(xiàn)出較高的選擇性，對同系物的分離能力較差。(―)液固色譜固定相液固色譜固定相可分為極性和非極性兩大類。極性固定相主要為硅膠（酸性）、氧化鎂、硅酸鎂分子篩（堿性）等。非極性固定相為高強度多孔微粒活性炭，近來開始使用的5?10pm的多孔石墨化炭黑，以及高交聯(lián)度苯乙烯-二乙烯基苯共聚物的單分散多孔微球（5-10微米)和碳多孔小球（TDX)。

至今在液固色譜法中最廣泛應(yīng)用的是極性固定相硅膠。1.極性固定相在極性吸附劑中，硅膠和硅酸鎂為酸性吸附劑（表面PH=5)，氧化鋁和氧化鎂為堿性吸附劑（表面pH=10?12)。

如用酸性吸附劑分離堿性物質(zhì)（如胺類），或用堿性吸附劑分離酸性物質(zhì)（如羧酸、酚類），就可能造成色譜峰的嚴重拖尾或不可逆的保留，為克服此現(xiàn)象，可向流動相中加入改性劑。如用硅膠分離堿性樣品時，若向流動相中加入少許堿性物質(zhì)（如三乙胺），就可減輕色譜峰的拖尾或永久性吸附。最常用的硅膠吸附劑，其含水量對色譜分離性能有很大的影響。對于未經(jīng)加熱處理的硅膠，其表面游離型硅羥基皆被水分子覆蓋，不呈現(xiàn)吸附活性。當將其在150?200度以下加熱，進行活化處理時，會除去一些水分子，使表面相鄰的游離硅羥基之間形成氫鍵，而獲得具有最強活性吸附中心的氫鍵型硅羥基，用于髙效液固色譜的商品硅膠皆屬于此種類型。若加熱超過200度，部分氫鍵型硅膠再脫水，就形成吸附性能很差的硅氧烷鍵型。對大孔硅膠上述活化處理過程是可逆的，對小孔硅膠此過程是不可逆的。若加熱溫度超過600度，則硅膠表面皆成為硅氧烷鍵而失去吸附活性。購置的商品硅膠吸附劑，表面皆為氫鍵型硅羥基，表現(xiàn)出很強的吸附活性，反而會引起化學(xué)吸附，造成色譜峰峰形拖尾，并延長吸附柱的再生時間。為消除此種不良影響，常向硅膠柱中加入少量極性改性劑，如在流動相中加人適量水，就可鈍化最強的吸附活性中心，使其由氫鍵型硅羥基轉(zhuǎn)化成對樣品的適當吸附作用的游離型硅經(jīng)基。通常使每100m2吸附劑表面含水0.02?0.03g就可達此目的，如對每l00g吸附劑中加入8?12g水，就可達到硅膠表面改性，而保持適當吸附活性的目的。為控制硅膠吸附劑的含水量，通常都采用含一定量水的流動相來使硅膠固定相的含水量達到平衡。2.非極性固定相在非極性吸附劑中，髙交聯(lián)度（>40%)苯乙烯-二乙烯基苯共聚微球，如日立凝膠3011、YanacoGel-5510(柳本制造廠）、styragel(Waters)等，應(yīng)用日益廣泛。另外用聚合物涂漬或包覆硅膠、氧化鋁、氧化鋯的新型非極性疏水固定相近年來獲快速發(fā)展。如在硅膠表面涂漬聚乙烯、氧化鋁表面涂漬聚丁二烯等。

這類固定相表現(xiàn)出即提高選擇性，又增加了化學(xué)穩(wěn)定性。在氣相色譜中使用的石墨化炭黑和炭多孔小球，在液固色譜法中的應(yīng)用也已開始探索并受到愈來愈多的關(guān)注。吸附劑的形狀和粒徑不僅直接影響柱效率，并影響填充色譜柱的方法。吸附劑的比表面積是一個最重要的特性因素，它直接決定色譜柱對樣品的負載量（即柱容量）和對樣品的保留性質(zhì)。如欲保持色譜柱對樣品的保留性質(zhì)不變，必須控制吸附劑的比表面積僅在一個較窄的范圍內(nèi)變化。對大多數(shù)多孔性吸附劑，其比表面積約為400m2/g。這是一個具有實用價值的最佳值。比表面積又是平均孔徑的函數(shù)。隨平均孔徑和粒徑的減小會增加比表面積，但同時也會使溶質(zhì)在色譜柱中的傳質(zhì)過程變壞。比表面積的降低，意味著降低樣品的負載量。對硅膠吸附劑平均孔徑為6?80nm,若孔徑小于6nm,它會對小分子溶質(zhì)產(chǎn)生排阻作用，用它填充的色譜柱柱效要比具有相同粒徑、孔徑大于6nm的填充柱低。（二）液固色譜的流動相在高效液相色譜分析中，除了固定相對樣品的分離起主要作用外，流動相的恰當選擇對改善分離效果也產(chǎn)生重要的輔助效應(yīng)。從實用角度考慮，選用作為流動相的溶劑應(yīng)當價廉，容易購得，使用安全，純度要高。除此之外，還應(yīng)滿足高效液相色譜分析的下述要求：①用作流動相的溶劑應(yīng)與固定相不互溶，并能保持色譜柱的穩(wěn)定性；所用溶劑應(yīng)有高純度，以防所含微量雜質(zhì)在柱中積累，引起柱性能的改變。

②選用的溶劑性能應(yīng)與所使用的檢測器相匹配。如使用紫外吸收檢測器，就不能選用在檢測波長有紫外吸收的溶劑；若使用示差折光檢測器，就不能使用梯度洗脫（因隨溶劑組成的改變，流動相的折光指數(shù)也在改變，就無法使基線穩(wěn)定）。③選用的溶劑應(yīng)對樣品有足夠的溶解能力，以提髙測定的靈敏度。④選用的溶劑應(yīng)具有低的黏度和適當?shù)偷姆悬c。使用低黏度溶劑，可減小溶質(zhì)的傳質(zhì)阻力，利于提高柱效。另外從制備、純化樣品考慮，低沸點的溶劑易用蒸餾方法從柱后收集液中除去，利于樣品的純化。⑤應(yīng)盡量避免使用具有顯著毒性的溶劑，以保操作人員的安全。當進行色譜分析時，樣品中兩個相鄰組分（1，2)的分離度R,可按下式計算：1.液相色譜選擇流動相的一般方法如果以影響分離度的因素來考慮作為流動相的溶劑的選擇原則，則如圖17-25所示。此三角形圖表明了在液相色譜分離中選擇流動相的一般方法。如將整個三角形代表所有的溶劑，首先應(yīng)排除一些物理性質(zhì)(沸點、黏度、紫外吸收等）不適于在液相色譜中使用的溶劑，如圖17-25三角形底部劃橫線部分的面積，相當于一半以上的溶劑被排除在外。在剩下物理性質(zhì)適用的溶劑中，還需選擇洗脫強度適當?shù)娜軇?，即選擇能使被分析樣品中組分的容量因子K‘值保持在最佳的1?10之間，對含多組分的樣品，K’值可擴展在0.5?20之間。這樣又排除了圖17-25中劃交叉線部分的面積。在能提供洗脫強度適當，使樣品組分值保持最佳的溶劑當中，還要進一步選擇能將樣品中不同組分分離開，且能使每兩個相鄰組分的分離因子大于1.05，以獲得具有滿意分離度的分析結(jié)果。這樣只有位于三角形頂端的空白面積對應(yīng)的溶劑，才能滿足液相色譜法的要求。當選擇了能夠提供適用值的溶劑，作為液相色譜的流動相后，還必須與能提供高理論塔板數(shù)的色譜柱相組合，才能使樣品中不同組分的分離達到所期望的分離度。由上述可知，表征溶劑物理和化學(xué)特性的重要參數(shù)，對液相色譜法中流動相的選擇會起到十分重要的作用。因此了解相關(guān)的特性參數(shù)和掌握選擇溶劑的一般原則，對進行高效液相色譜的實踐特別重要。2.表征溶劑特性的重要參數(shù)表征溶劑特性的參數(shù)有沸點、分子量、相對密度、介電常數(shù)、偶極矩、水溶性等物理性質(zhì)以及與所用檢測器有關(guān)的折射率、紫外吸收截止波長。與髙效液相色譜柱分離過程密切相關(guān)的最重要溶劑特性參數(shù)是溶劑強度參數(shù)，溶解度參數(shù)極性參數(shù)和黏度。在液固吸附色譜法中，對復(fù)雜混合物的分離難以用純?nèi)軇┫疵搧韺崿F(xiàn)，此時需采用二元混合溶劑體系來提高分離的選擇性。在二元混合溶劑中，其洗脫強度，隨其組成的改變而連續(xù)變化，從而可找到具有適用的值的混合物。在確定了混合溶劑洗脫強度的前提下，還應(yīng)選用黏度低的溶劑體系，以降低柱壓并提高柱效。對以硅膠為固定相的液固色譜法，當欲分離不同類型的有機化合物時，所選用的作為流動相的溶劑，應(yīng)具有適用溶劑強度參數(shù)。在正相液液色譜中，溶劑的值愈大，其洗脫強度愈大，會使溶質(zhì)在固定相的容量因子值愈?。辉诜聪嘁阂荷V中，溶劑的值愈大其洗脫強度愈小，會使溶質(zhì)在固定相的容量因子愈大。(4)黏度在髙效液相色譜分析中，溶劑的黏度（系指動力黏度）是影響色譜分離的重要參數(shù)，當溶劑的黏度大時，會降低溶質(zhì)在流動相中的擴散及在兩相間的傳質(zhì)速度，并降低了柱子的滲透性，導(dǎo)致柱效的下降和分析時間的延長。3.液固色譜的流動相在液固色譜法中，當某溶質(zhì)在極性吸附劑硅膠色譜柱上進行分離時，變更不同洗脫強度的溶劑作流動相時，此溶質(zhì)的容量因子不同，依據(jù)下式可知：在液固色譜法中，若使用硅膠、氧化鋁等極性固定相，應(yīng)以弱極性的戊烷、己烷、庚烷作流動相的主體，再適當加入二氯甲烷、氯仿、乙醚、異丙醚、乙酸乙酯、甲基叔丁基醚等中等極性溶劑，或四氫呋喃、乙腈、異丙醇、甲醇、水等極性溶劑作為改性劑，以調(diào)節(jié)流動相的洗脫強度，實現(xiàn)樣品中不同組分的良好分離。若使用苯乙烯-二乙烯基苯共聚物微球、石墨化炭黑微球等非極性固定相，應(yīng)以水、甲醇、乙醇作為流動相的主體，可加入乙腈、四氫呋喃等改性劑，以調(diào)節(jié)流動相的洗脫強度。在液固色譜法中，常用水對硅膠固定相進行減活處理，此時流動相中水的飽和度應(yīng)小于25%，若水含量過髙，大量水附著在硅膠上會使液固色譜過程轉(zhuǎn)變成液液色譜過程而影響分離效果。若選用極性強的有機溶劑，如甲醇、乙腈、異丙醇等代替水作減活劑，就可克服水的負面影響，并會對分離因子容量因子的變化產(chǎn)生更大的影響。在液固色譜法中，使用混合溶劑的最大優(yōu)點是可獲得最佳的分離選擇性。此時，若混合溶劑中強極性溶劑的含量占絕對優(yōu)勢或含量很低，其分離因子呈現(xiàn)最大值。此外若使用具有氫鍵效應(yīng)的溶劑，如正丙胺、三乙胺、乙醚、異丙醚、甲醇、二氣甲烷、氣仿等作改性劑，則可顯著改善色譜分離的選擇性。使用混合溶劑的另一個優(yōu)點是可使流動相保持低的黏度，并可保持高的柱效。如使用強極性乙二醇作改性劑，它的黏度高達16.5mPa?s,大大超過高效液相色譜允許使用的黏度范圍，但實際使用時，僅需將1%?2%的乙二醇加到弱極性溶劑中，就可獲得洗脫強度高的混合溶劑，其黏度卻符合高效液相色譜分析的要求。二、液液分配色譜液液色譜法或稱分配色譜法，是在20世紀40年代由馬丁(MartinA.J.P.)和塞格（SyngeL.M.)提出的，它的固定相是將一種極性或非極性固定液吸附載帶在惰性固相載體上而構(gòu)成。髙效液固色譜法使用的載體材料為全多孔型或薄殼型（表面多孔）微粒硅膠吸附劑。由于可涂漬固定液的種類繁多，因此液液色譜法已發(fā)展成為能分離多種類型的樣品的方法，包括水溶性和油溶性樣品，極性和非極性化合物，離子型和非離子型化合物等。在色譜分離過程，由于固定液是機械涂漬在載體上的，在流動相中會產(chǎn)生微量溶解，在流動相連續(xù)通過色譜柱的機械沖擊下，固定液也會不斷地流失，而流失的固定液又會污染已被分離開的組分，對色譜分離帶來不良影響，這些又使液液色譜的應(yīng)用受到了限制。（一）液液色譜固定相液液色譜固定相由兩部分組成，一部分是惰性載體，另一部分是涂漬在惰性載體上的固定液。在液固色譜中使用的固體吸附劑，如全多孔球形或無定形微粒硅膠、全多孔氧化鋁等皆可作為液液色譜固定相的情性栽體。要求其比表面積約50?250m2/g,平均孔徑約10?50nm栽體的比表面積太大，會引起不可忽視的吸附效應(yīng)，從而引起色譜峰峰形拖尾。在惰性載體表面涂漬固定液有兩種方法，一種是用含固定液的溶液浸漬惰性載體，再用蒸發(fā)法緩慢除去溶劑，此法固定液涂潰在載體上比較均勻。另一種方法是先將惰性載體裝填在色譜柱中，再用含一定量固定液的流動相流經(jīng)柱子，使固定液吸附在惰性載體上，此法若達穩(wěn)定狀態(tài)需較長時間，且固定液不易達到均勻分布。固定液涂漬量約為每克載體0.1?1.0g，當涂漬量每克載體>0.3g為重負載柱。液液色譜柱的柱容量比液固色譜柱大一個數(shù)量級，每克固定液約為10-3?10-4（樣品），而峰形無明顯的擴展。經(jīng)過在惰性載體上機械涂潰固定液后制成的液液色譜柱，在使用過程由于大量流動相通過色譜柱，會溶解固定液而造成固定液的流失，并導(dǎo)致保留值減