DBXM075-2020實(shí)驗(yàn)用水貂胚胎采集及移植技術(shù)規(guī)程

ICSFORMTEXT65.020.30FORMTEXTB44FORMTEXT?????DBFORMTEXT??DBFORMTEXTXM/FORMTEXT075—FORMTEXT2020FORMTEXT?????FORMTEXT實(shí)驗(yàn)用水貂胚胎采集及移植技術(shù)規(guī)程FORMTEXTExperimentalminkembryocollectionandtransfer?procedure????FORMTEXT?????FORMDROPDOWNFORMTEXT?????FORMTEXT????-FORMTEXTXX-FORMTEXTXX發(fā)布FORMTEXTXXXX-FORMTEXTXX-FORMTEXTXX實(shí)施FORMTEXT????????發(fā)布DBXM/075—2020前言 II1范圍 12規(guī)范性引用文件 13術(shù)語(yǔ)和定義 14器械清洗和消毒 25沖胚液及胚胎保存液的配制 26結(jié)扎公貂的準(zhǔn)備 27供體水貂的選擇及配種 38手術(shù)沖胚及收集 39胚胎質(zhì)量鑒定 410受體水貂胚胎移植 4附錄A（資料性附錄）器械清洗和消毒 5附錄B（資料性附錄）沖胚液及胚胎保存液配方及配制 5附錄C（資料性附錄）實(shí)驗(yàn)用水貂的選擇 6附錄D（資料性附錄）實(shí)驗(yàn)器材、藥品及試劑 6附錄E（資料性附錄）實(shí)驗(yàn)用水貂配種、胚胎收集及移植記錄表 7前??言本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件由吉林省科學(xué)技廳提出并歸口。本文件起草單位：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所。本文件主要起草人：刁云飛、李曉霞、許保增、趙偉剛、徐超、魏海軍、楊鎰峰、張穎、唐毓。實(shí)驗(yàn)用水貂胚胎采集及移植技術(shù)規(guī)程范圍本文件規(guī)定了實(shí)驗(yàn)用水貂胚胎采集及移植的術(shù)語(yǔ)和定義、器械清洗和消毒、所需溶液的配制方案、公貂結(jié)扎手術(shù)的技術(shù)及要求、實(shí)驗(yàn)水貂的選擇、水貂手術(shù)的技術(shù)及要求、胚胎采集的技術(shù)及要求、代孕母貂的同期交配處理及胚胎移植手術(shù)的技術(shù)及要求。本文件適用于水貂胚胎的采集及移植。規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件。不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T1.1—2020標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則GB/T35823—2018實(shí)驗(yàn)動(dòng)物動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通用要求術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。供體水貂donormink在胚胎移植過(guò)程中提供胚胎的母水貂。受體水貂recipientmink在胚胎移植過(guò)程中接受胚胎的代孕母水貂。結(jié)扎公貂vasectomizedmalemink用于受體水貂刺激排卵的輸精管結(jié)扎的公水貂。沖胚液embryoflushingmedium用于采集胚胎時(shí)，將胚胎從輸卵管或子宮角中沖洗出體外并提供保護(hù)的化學(xué)試劑。胚胎保存液embryopreservationmedium用于暫時(shí)保存采集到的胚胎，提供營(yíng)養(yǎng)、保護(hù)的化學(xué)試劑。胚胎移植針embryotransferpipette用于吸取胚胎并移植到受體水貂體內(nèi)的毛細(xì)玻璃管。器械清洗和消毒參見(jiàn)附錄A。沖胚液及胚胎保存液的配制參見(jiàn)附錄B。結(jié)扎公貂的準(zhǔn)備結(jié)扎公貂的選擇要求參見(jiàn)附錄C.1。結(jié)扎公貂的輸精管結(jié)扎手術(shù)手術(shù)器材、藥品及試劑參見(jiàn)附錄D。術(shù)前準(zhǔn)備水貂手術(shù)前禁食12小時(shí)以上。麻醉與保定水貂的麻醉與保定應(yīng)符合GB/T35823的要求。全身麻醉后，將水貂腹部朝上，平放于手術(shù)臺(tái)。術(shù)部消毒手術(shù)部位于睪丸下部陰囊縫際處，麻醉后的水貂術(shù)部備皮，用5%碘酊和75%酒精消毒。手術(shù)方法在睪丸下部陰囊縫際一側(cè)，平行于縫際，一次性切開(kāi)皮膚、內(nèi)膜、總鞘膜，做一個(gè)2cm左右切口，將睪丸及輸精管暴露。用尖頭鑷子，將與附睪距離2cm處的輸精管與系膜小心分離，用10號(hào)蠶絲線將輸精管結(jié)扎緊。完成后，用同樣的方法將另一側(cè)輸精管進(jìn)行結(jié)扎?？p合與消毒將輸精管結(jié)扎好的睪丸小心放回陰囊內(nèi)，隨后將總鞘膜、內(nèi)膜、皮膚用可吸收外科縫合線縫合，用5%碘酊消毒，術(shù)后3天內(nèi)每天注射2次青霉素、鏈霉素。術(shù)后恢復(fù)1個(gè)月后，才可用于交配。供體水貂的選擇及配種供體水貂的選擇參見(jiàn)附錄C.2。發(fā)情鑒定母貂發(fā)情表現(xiàn)精神興奮，食欲減退，排尿變頻并呈黃綠色。觀察陰毛明顯分開(kāi)，倒向兩邊?？梢?jiàn)陰唇膨脹、突出或微外翻成四瓣，呈白色或粉紅色，陰門(mén)附著黃白色或白色粘液，視為發(fā)情中期，適于交配。配種將發(fā)情供體水貂與種公貂同籠配種，配種時(shí)間為早6點(diǎn)開(kāi)始至9點(diǎn)結(jié)束，交配后及時(shí)將供體水貂放回原籠內(nèi)。每天1次，連續(xù)交配2天。手術(shù)沖胚及收集沖胚器材、藥品及試劑參見(jiàn)附錄D。輸卵管手術(shù)采集術(shù)前準(zhǔn)備供體水貂第二次交配后第2天手術(shù)沖胚，術(shù)前禁食12小時(shí)以上。麻醉與保定水貂的麻醉與保定應(yīng)符合GB/T35823的要求。進(jìn)行全身麻醉，將水貂腹部朝上平放于手術(shù)臺(tái)上。術(shù)部消毒術(shù)部位于腹中線倒數(shù)第二乳頭處。麻醉后術(shù)部備皮，用5%碘酊和75%酒精消毒。輸卵管手術(shù)采集在腹中線倒數(shù)第二乳頭處做一個(gè)2cm左右切口，將兩側(cè)子宮角、輸卵管、卵巢暴露，觀察左右卵巢黃體發(fā)育情況并記錄。在子宮角和輸卵管結(jié)合部的子宮角端用蠶絲線進(jìn)行結(jié)扎，將卵巢與輸卵管用眼科剪進(jìn)行剝離采集，將取下的輸卵管放置在沖胚液中保存?？p合與消毒將結(jié)扎好的子宮復(fù)位回腹腔內(nèi)，用可吸收外科縫合線將腹膜與肌肉層連續(xù)縫合，皮膚結(jié)結(jié)縫合，用5%碘酊消毒，術(shù)后3天內(nèi)每天注射2次青霉素、鏈霉素。沖胚將采集到輸卵管放在平皿里進(jìn)行沖胚。注射器吸入5ml沖胚液，安裝上沖胚針從輸卵管傘口處插入，用鑷子將包裹沖胚針處的輸卵管夾緊，防止液體倒流。將5ml沖胚液緩慢的注入到輸卵管中，使胚胎隨著沖胚液從輸卵管另一端流出至平皿中。胚胎收集用口吸管連接胚胎收集針，在體式顯微鏡下收集沖胚液中的胚胎。將收集到的胚胎放入胚胎保存液小滴中，并覆蓋礦物油。胚胎質(zhì)量鑒定胚胎檢查在無(wú)菌操作室內(nèi)，將存放胚胎的平皿放在37℃恒溫板上，體視顯微鏡下檢查、鑒定胚胎發(fā)育階段并記錄。隨后放入38.5℃、5%CO2濃度的高濕度培養(yǎng)箱中保存直至后續(xù)實(shí)驗(yàn)或胚胎移植。胚胎質(zhì)量分級(jí)第二次配種后第2天，胚胎應(yīng)為1細(xì)胞或者2細(xì)胞。胚胎可分為A、B、C、D四個(gè)等級(jí)，A、B級(jí)為可用胚胎，C、D級(jí)為不可用胚胎。-A級(jí)：胚胎發(fā)育階段與胚齡一致，輪廓清晰、呈球形，卵周隙適中，若2細(xì)胞則分裂球大小均勻、結(jié)構(gòu)緊湊。-B級(jí)：胚胎發(fā)育階段與胚齡基本一致，輪廓清晰，細(xì)胞球略收縮，卵周隙略大，若2細(xì)胞分裂球大小基本一致。-C級(jí)：胚胎發(fā)育階段與胚齡不太一致，輪廓尚清晰，細(xì)胞球收縮較大，卵周隙大。-D級(jí)：胚胎發(fā)育階段與胚齡不一致，輪廓不清晰，細(xì)胞膜破裂，有細(xì)胞碎片。受體水貂胚胎移植移植器械、藥品及試劑參見(jiàn)附錄D。受體水貂的選擇參見(jiàn)附錄C.2。同期排卵刺激將與供體水貂同期發(fā)情的受體水貂與結(jié)扎公貂同籠交配刺激排卵，每天1次，連續(xù)2天。術(shù)前準(zhǔn)備、麻醉、保定、消毒具體方法與8.2.1、8.2.2和8.2.3相同。胚胎移植在腹中線倒數(shù)第二乳頭處做一個(gè)2cm左右切口，將一側(cè)子宮角、輸卵管、卵巢暴露。在輸卵管的膨大部，用1ml注射器針頭穿一個(gè)小孔，用口吸管連接胚胎移植針吸取4-5枚胚胎及5-10μl胚胎保存液，將胚胎移植針小心插入輸卵管小孔中，緩慢的將全部胚胎及胚胎保存液注入輸卵管中，避免注入大量氣體，完成后將胚胎移植針緩慢拔出。按照同樣方法將4-5枚胚胎移植入另一側(cè)輸卵管中。移植完成后，將輸卵管與子宮復(fù)位回腹腔，并用生理鹽水簡(jiǎn)單沖洗?？p合與消毒具體方法與8.2.5相同。

（資料性附錄）

器械清洗和消毒玻璃器皿的清洗和消毒新購(gòu)置的玻璃器皿或使用后的玻璃器皿，都要用自來(lái)水先浸泡。洗滌時(shí)，先在加有洗滌劑的溫?zé)崛芤褐羞M(jìn)行刷試，如果遇到有污物或油垢不易清洗的，應(yīng)先放入重鉻酸鉀洗液中浸泡數(shù)小時(shí)，然后再用水沖洗干凈，最后用蒸餾水沖洗兩遍，直至器皿光亮、無(wú)水滴附著為止。將洗凈的玻璃器皿放入電熱干燥箱，加熱至160℃后恒溫1小時(shí)，自然冷卻后待用。胚胎移植用的玻璃毛細(xì)管，需用蒸餾水通過(guò)超聲波清洗1小時(shí)，放入鐵制器皿并用錫紙包裝好后，120℃高壓滅菌1小時(shí)，隨后放入電熱干燥箱加熱干燥1小時(shí)，自然冷卻后待用。手術(shù)器械的清洗和消毒手術(shù)器械使用后，用水沖去表面污物，然后在加有洗滌劑的溫?zé)崛芤褐杏瞄L(zhǎng)毛刷刷洗，并用清水沖洗干凈，再用蒸餾水逐個(gè)沖洗。將洗凈的手術(shù)器械放入不銹鋼手術(shù)器械盒中，120℃高壓滅菌1小時(shí)，隨后放入電熱干燥箱加熱干燥1小時(shí)，自然冷卻后待用。手術(shù)前放在0.2%的新潔爾滅溶液浸泡30分鐘后用于手術(shù)。

（資料性附錄）

沖胚液及胚胎保存液配方及配制表B.1沖胚液推薦配方成分含量胎牛血清25mlPBS緩沖液475ml液體配制完成后，用0.22μm過(guò)濾器過(guò)濾表B.2胚胎保存液推薦配方成分含量胎牛血清25mlKSOM培養(yǎng)液475ml液體配制完成后，用0.22μm過(guò)濾器過(guò)濾

（資料性附錄）

實(shí)驗(yàn)用水貂的選擇結(jié)扎公貂的選擇體況良好，生殖機(jī)能正常，年齡在1-2歲的公水貂。供體、受體母貂的選擇體況良好、生殖機(jī)能正常，年齡在1-3歲的母水貂。受體母水貂的發(fā)情時(shí)間與供體水貂同步。

（資料性附錄）

實(shí)驗(yàn)器材、藥品及試劑實(shí)驗(yàn)器材器材具體要求藥品及試劑培養(yǎng)箱可調(diào)節(jié)濕度至95%，溫度38.5℃的二氧化碳培養(yǎng)箱麻醉藥（鹽酸賽拉嗪注射液）體視鏡-蘇醒藥（鹽酸苯噁唑注射液）恒溫板可加熱至37℃青霉素手術(shù)刀-鏈霉素縫合針圓針，1/2弧生理鹽水可吸收外科縫合線型號(hào)：4-0礦物油鑷子尖頭鑷子沖胚液創(chuàng)巾需滅菌胚胎保存液創(chuàng)巾夾-蠶絲線型號(hào)：4號(hào)沖胚針平頭，直徑0.8-1.2mm胚胎移植針針口外徑不能大于1.5mm，內(nèi)徑不能小于0.3mm口吸管-培養(yǎng)皿需滅菌

（資料性附錄）

實(shí)驗(yàn)用水貂配種、胚胎收集及移植記錄