番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病抗性鑒定技術(shù)規(guī)程-編制說明

一、項(xiàng)目來(lái)源根據(jù)《廣西標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)關(guān)于下達(dá)2020年第三批團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)制定項(xiàng)目計(jì)劃的通知》（桂標(biāo)協(xié)[2020]8號(hào)）文件精神，由廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所提出，廣西大學(xué)、廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所共同起草的團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)《番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病抗性鑒定技術(shù)規(guī)程》。二、項(xiàng)目背景及目的意義番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病與1933年首次在美國(guó)發(fā)現(xiàn)，隨后發(fā)展成為一種世界性冰河，遍及各大洲。番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病最高發(fā)病率可達(dá)100%，造成5%—75%的減產(chǎn)。降低果實(shí)的外觀品質(zhì)，對(duì)其商品性影響較大，該病已被列入我國(guó)的出入境檢疫有害生物名錄。番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病在植株苗期和成株期均可發(fā)生，可對(duì)植株的葉、莖、果柄、萼片、果面造成危害。近年來(lái)，在華南秋冬番茄的主產(chǎn)區(qū)廣西百色市田陽(yáng)區(qū)爆發(fā)的番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病病害對(duì)番茄植株的莖部危害嚴(yán)重，且發(fā)病率可達(dá)80%以上，嚴(yán)重制約了廣西番茄主產(chǎn)區(qū)的發(fā)展。該病病原菌通過遺留在病葉、病果、發(fā)病枝條等植株殘余組織中以及田塊內(nèi)的雜草上。翌年借助風(fēng)雨傳播、灌溉水等傳播到植株上，或經(jīng)過人工整枝打杈等農(nóng)事活動(dòng)造成的傷口以及植株上的氣孔、皮孔、水孔等自然孔口侵入組織，在植株的薄壁組織細(xì)胞間隙中蔓延，造成寄主細(xì)胞的破壞。同時(shí)病原菌在新田塊中可以通過帶菌的種子傳播。病原菌在干燥的種子上存活數(shù)年，環(huán)境條件適宜，在苗期即可侵染植株。低溫高濕是番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病發(fā)病的主要條件。氣溫在15℃以上，且連續(xù)陰雨達(dá)3d以上時(shí)，最有利于病情的發(fā)展。在栽培管理上，澆水多，排水不良，雨后積水，肥料供應(yīng)不足或偏施氮肥均會(huì)加重病害發(fā)生。在廣西番茄主產(chǎn)區(qū)之一的百色，地處亞熱帶氣候區(qū)，春季與量，冬季溫暖潮濕。番茄的種植主要在夏秋季節(jié)播種，冬季到翌年春季上市，多為露地栽培。冬季及早春易發(fā)生連續(xù)早晚間霧露重、陰雨天氣，導(dǎo)致該病呈現(xiàn)流行態(tài)勢(shì)。為解決這一問題，育種家針對(duì)番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病開展了抗病育種。然而再進(jìn)行抗病鑒定中遇到較多問題。一是病原菌的致病力在人工接種過程中的影響。病原菌致病力的分化，在同一病株的表現(xiàn)不同。二是缺乏統(tǒng)一的接種濃度。在眾多研究中表明，病原菌的濃度與病害的嚴(yán)重程度有關(guān)。在一定的范圍內(nèi)，病原菌的濃度越大，病害越嚴(yán)重；相反病原菌濃度過低，病害發(fā)生不充分，無(wú)法區(qū)分品種間的抗性。三是接種方法，不同病原菌的接種方法對(duì)抗性鑒定有較大的影響。接種方法應(yīng)根據(jù)病害的侵染特性等方面進(jìn)行綜合考慮。四是作物類型，作物不同的生長(zhǎng)期對(duì)病害的敏感程度會(huì)出現(xiàn)差異。五是接種環(huán)境因素會(huì)影響病原菌的繁殖、侵染。因此，通過制定團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)《番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病抗性鑒定技術(shù)規(guī)程》，以標(biāo)準(zhǔn)為抓手，讓廣大科研院所和番茄育種企業(yè)規(guī)范鑒定番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病，從源頭上更好保障番茄的生長(zhǎng)，提高番茄的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，增加農(nóng)民收入，對(duì)推動(dòng)我區(qū)番茄產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展，打造廣西番茄品牌，促進(jìn)農(nóng)民增收脫貧和鄉(xiāng)村振興均具有重要意義。三、項(xiàng)目編制過程（一）成立標(biāo)準(zhǔn)編制工作組團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)《番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病抗性鑒定技術(shù)規(guī)程》項(xiàng)目任務(wù)下達(dá)后，廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所成立了標(biāo)準(zhǔn)編制工作組，起草單位制定了起草編寫方案與進(jìn)度安排，明確任務(wù)職責(zé)，確定工作技術(shù)路線，開展標(biāo)準(zhǔn)研制工作。具體標(biāo)準(zhǔn)編制工作由廣西大學(xué)，廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所等起草單位組成標(biāo)準(zhǔn)編制工作組，編制工作組成員如下：。編制工作組下設(shè)三個(gè)組，分別是資料收集組、草案編寫組、標(biāo)準(zhǔn)實(shí)施組。資料收集組負(fù)責(zé)國(guó)內(nèi)外有關(guān)番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病的文獻(xiàn)資料的查詢、收集和整理工作，查閱前人對(duì)番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病抗病性鑒定研究情況和目前科學(xué)界對(duì)番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病抗病性鑒定方法的研究進(jìn)展。草案編寫組負(fù)責(zé)起草標(biāo)準(zhǔn)草案、征求意見稿和標(biāo)準(zhǔn)編制說明、送審稿及編制說明的編寫工作，包括后期召開征求意見會(huì)、網(wǎng)上征求意見，以及標(biāo)準(zhǔn)的不斷修改和完善。標(biāo)準(zhǔn)實(shí)施組負(fù)責(zé)《番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病抗性鑒定技術(shù)規(guī)程》團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)發(fā)布后，組織科研院所、相關(guān)育種企業(yè)開展標(biāo)準(zhǔn)宣貫培訓(xùn)會(huì)，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行詳細(xì)解讀，讓相關(guān)人員了解標(biāo)準(zhǔn)，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)甘番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病抗病性鑒定方法進(jìn)行規(guī)范化操作，保證番茄品種抗病性鑒定的準(zhǔn)確性，并對(duì)標(biāo)準(zhǔn)實(shí)施情況進(jìn)行總結(jié)分析，不斷對(duì)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)提出修正意見。（二）收集整理文獻(xiàn)資料標(biāo)準(zhǔn)編制工作組收集了國(guó)內(nèi)有關(guān)甘薯外源硒生物強(qiáng)化生產(chǎn)相關(guān)文獻(xiàn)資料。主要有：NY/T1858—2010(所有部分）番茄主要病害抗病性鑒定技術(shù)規(guī)程（三）研討確定標(biāo)準(zhǔn)主體內(nèi)容標(biāo)準(zhǔn)編制工作組在對(duì)收集的資料進(jìn)行整理研究之后，2020年4月，標(biāo)準(zhǔn)編制工作組召開了標(biāo)準(zhǔn)編制會(huì)議，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)的整體框架結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，并對(duì)標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)鍵性內(nèi)容進(jìn)行了初步探討。經(jīng)過研究，標(biāo)準(zhǔn)的主體內(nèi)容確定為番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病抗性鑒定技術(shù)的術(shù)語(yǔ)和定義、試劑與材料、接種體制備、病原菌鑒定、鑒定條件和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、接種、病情調(diào)查、抗病性評(píng)價(jià)。（四）調(diào)研、形成征求意見稿2020年4月—9月，標(biāo)準(zhǔn)起草工作小組進(jìn)行了廣泛實(shí)地調(diào)研工作，查閱了大量的國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)資料，對(duì)番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病抗性鑒定技術(shù)的前人研究成果進(jìn)行系統(tǒng)總結(jié)。形成了標(biāo)準(zhǔn)的基本構(gòu)架，對(duì)主要內(nèi)容進(jìn)行了討論并對(duì)項(xiàng)目的工作進(jìn)行了部署和安排。2020年10月，在前期工作的基礎(chǔ)之上，通過理清邏輯脈絡(luò)，整合已有的參考資料中有關(guān)番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病抗性鑒定技術(shù)要求，并結(jié)合廣西大學(xué)、廣西農(nóng)科院蔬菜所實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上，按照簡(jiǎn)化、統(tǒng)一等原則編制完成團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)《番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病抗性鑒定技術(shù)規(guī)程》（草案）。2020年11月—2021年3月，標(biāo)準(zhǔn)起草工作組再次深入?yún)^(qū)內(nèi)番茄種植區(qū)進(jìn)行采樣，針對(duì)番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病抗性鑒定技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，掌握番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病抗性鑒定的具體技術(shù)要求。并實(shí)際征求意見，通過收集反饋了大量意見，標(biāo)準(zhǔn)編制工作組多次召開會(huì)議，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)草案進(jìn)行了反復(fù)修改和研究討論。最終形成了團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)《番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病抗性鑒定技術(shù)規(guī)程》（征求意見稿）和（征求意見稿）編制說明。四、標(biāo)準(zhǔn)制定原則1、實(shí)用性原則本文件是在充分收集相關(guān)資料和文獻(xiàn)，分析番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病抗性鑒定技術(shù)當(dāng)前現(xiàn)狀，調(diào)研番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病的發(fā)病情況，在現(xiàn)有國(guó)家、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)相關(guān)番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病抗性鑒定技術(shù)要求的基礎(chǔ)上，結(jié)合廣西大學(xué)、廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所等多年的番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病抗性鑒定試驗(yàn)而總結(jié)起草的。符合當(dāng)前番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病抗性鑒定技術(shù)發(fā)展的方向與市場(chǎng)需求，有利于行業(yè)的長(zhǎng)遠(yuǎn)發(fā)展，有利于提高番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病抗性鑒定效率，對(duì)推動(dòng)我區(qū)番茄產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展，打造廣西番茄品牌，促進(jìn)農(nóng)民增收脫貧，具有較強(qiáng)的實(shí)用性和可操作性。2、協(xié)調(diào)性原則本文件編寫過程中注意了與番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病抗性鑒定技術(shù)相關(guān)法律法規(guī)的協(xié)調(diào)問題，在內(nèi)容上與現(xiàn)行法律法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)協(xié)調(diào)一致。3、規(guī)范性原則本文件嚴(yán)格按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的要求和規(guī)定編寫本標(biāo)準(zhǔn)的內(nèi)容，保證標(biāo)準(zhǔn)的編寫質(zhì)量。4、前瞻性原則本文件在兼顧當(dāng)前區(qū)內(nèi)番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病抗性鑒定現(xiàn)實(shí)情況的同時(shí)，還考慮到了番茄產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展的趨勢(shì)和需要，在標(biāo)準(zhǔn)中體現(xiàn)了個(gè)別特色性、前瞻性和先進(jìn)性條款，作為對(duì)番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病抗性鑒定技術(shù)的指導(dǎo)。五、標(biāo)準(zhǔn)主要內(nèi)容及依據(jù)來(lái)源團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)《番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病抗性鑒定技術(shù)規(guī)程》主要章節(jié)內(nèi)容包括術(shù)語(yǔ)和定義、試劑與材料、接種體制備、病原菌鑒定、鑒定條件和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、接種、病情調(diào)查、抗病性評(píng)價(jià)。其中術(shù)語(yǔ)和定義主要依據(jù)番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病的主要發(fā)生情況和癥狀要求確定。試劑與材料、接種體制備、病原菌鑒定等主要依據(jù)廣西大學(xué)、廣西農(nóng)科院蔬菜研究所經(jīng)過試驗(yàn)驗(yàn)證確定。病原菌的分離鑒定在廣西田陽(yáng)區(qū)那坡鎮(zhèn)番茄產(chǎn)地采樣的番茄葉片，經(jīng)分離純化后，菌落呈圓形，全緣或鋸齒狀，乳白色，表面光滑，略有光澤，質(zhì)地粘稠，菌落半徑在2mm左右。菌落形態(tài)特征見圖1。圖1.菌落形態(tài)特征煙葉過敏反應(yīng)與回接結(jié)果將保存的病原菌轉(zhuǎn)移到液體ＮＡ培養(yǎng)基中，設(shè)置溫度28℃，轉(zhuǎn)速120r/min震蕩培養(yǎng)48ｈ。用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)入＝600的條件下測(cè)定OD值，將菌液稀釋至OD為0.6—0.8。用注射器吸取菌液，沿著葉脈注射到煙草葉片葉肉組織中，24h觀察是否有斑枯過敏反應(yīng)。并將病原菌接種到健康番茄植株上，接種后，番茄植株放置于人工氣候箱中培養(yǎng)，溫度設(shè)定在25℃，空氣濕度為95±5％。結(jié)果表明病原菌發(fā)生煙葉過敏反應(yīng)；接種健康番茄植株，葉片出現(xiàn)斑點(diǎn)，斑點(diǎn)有黃色暈圈等典型癥狀。（圖2）圖2.煙葉過敏反應(yīng)及回接葉片發(fā)病情況分子鑒定結(jié)果分子鑒定擴(kuò)展程序與條件依據(jù)黃立飛等（2011）方法。以病原細(xì)菌的總基因組DNA為模板，上游引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’），下游引物1942R（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）進(jìn)行擴(kuò)增。進(jìn)行16srDNAPCR擴(kuò)增后，得到一條約1500bp的條帶（圖3）。通過與GenBank中的核酸序列進(jìn)行對(duì)比，其與丁香假單胞桿菌番茄致病變種的同源性達(dá)99%。圖3.病原菌的16srDNAPCR擴(kuò)增電泳圖不同接種方法對(duì)苗期植株病情指數(shù)的影響由圖4可知，對(duì)照組均不發(fā)病，說明發(fā)病是人工接種導(dǎo)致的；葉片針刺法在Ｂ、Ｃ、Ｄ種質(zhì)中病情指數(shù)均最高；剪葉接種法、葉柄接種法、莖干接種法在不同番茄種質(zhì)中，對(duì)病情指數(shù)的影響互有高低；菌土法的病情指數(shù)最低，使用菌土接種法，Ａ種質(zhì)的所有重復(fù)試驗(yàn)及Ｂ、Ｃ、Ｄ種質(zhì)的部分重復(fù)試驗(yàn)中，葉片出現(xiàn)無(wú)病癥的情況。Ｄ為感病對(duì)照番茄材料，利用針刺葉片接種法、剪葉接種法、莖干接種法、葉柄接種，Ｄ種質(zhì)均達(dá)到感病級(jí)別（病情指數(shù)＞40），不同的接種方法對(duì)４個(gè)種質(zhì)的接種病情指數(shù)的影響趨勢(shì)較一致。從病害充分發(fā)病的角度來(lái)看，針刺葉片接種法、剪葉接種法、莖干接種法、葉柄接種法均能滿足要求。圖4.不同接種方法對(duì)苗期植株病情指數(shù)的影響不同接種方法下的發(fā)病癥狀發(fā)病癥狀看，針刺葉片法發(fā)病從葉片開始發(fā)病，后逐漸蔓延到莖干，斑點(diǎn)在葉片上分布均勻（圖5Ａ）；剪葉法操作簡(jiǎn)便，病癥首先出現(xiàn)在葉片上（圖5Ｂ）；葉柄法先在葉柄上形成斑點(diǎn)，后蔓延到葉片上，后期接種葉片常提前掉落（圖5Ｃ）；莖干接種法病癥顯癥時(shí)間要較葉片的兩種接種方法慢1到2ｄ，癥狀首先出現(xiàn)在莖部傷口周圍，形成水漬狀斑塊（圖5Ｄ），后面逐漸變黑，葉片出現(xiàn)典型癥狀較莖干慢，但是莖干接種法在接種植株之間發(fā)病較均勻。圖5.不同的接種方法的發(fā)病特點(diǎn)不同接種濃度下的病情指數(shù)從圖6中可以看出，隨著接種液濃度的升髙，４份番茄材料的病情指數(shù)均呈現(xiàn)增加的結(jié)果。在接種液濃度為1×106、1×107cfu/ml時(shí)候病情指數(shù)均顯著增加。由于Ｄ是己知的高感病的番茄種質(zhì)材料，在接種濃度為1×103、1×104、1×105、1×106cfu/ml時(shí)，病情指數(shù)＜40，發(fā)病不夠充分。當(dāng)用濃度為1×108、1×109cfu/ml的接種液進(jìn)行接種時(shí)，D發(fā)病充分。圖6.不同濃度接種液對(duì)番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病病情指數(shù)的影響不同生長(zhǎng)階段接種的病情指數(shù)在番茄植株的三個(gè)生長(zhǎng)階段進(jìn)行接種，４份番茄材料均表現(xiàn)出番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病的典型癥狀，從圖7中可以看出，在Ａ種質(zhì)中，開花期接種的病情指數(shù)最高，病情指數(shù)平均值達(dá)到44.8，極顯著高于３—５葉期和７—９葉期接種的病情指數(shù)，３—５葉期和７—９葉期之間病情指數(shù)差異不顯著；在Ｂ、Ｃ、Ｄ材料中，開花期和3—５葉期接種病情指數(shù)差異不顯著，兩時(shí)期均顯著高于７—９葉期接種。由此可知，病原菌最容易浸染花果期植株，其次為苗期，在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)旺盛的７—９葉期接種效果較差。從病情指數(shù)在不同種質(zhì)之間的變化趨勢(shì)上來(lái)看，３個(gè)生長(zhǎng)階段的對(duì)不同種質(zhì)的抗性鑒定結(jié)果的變化趨勢(shì)較一致，但是７—８葉時(shí)期接種接種發(fā)病效果低，不能反映出種質(zhì)的抗性差異。圖7.接種不同生長(zhǎng)階段番茄植株細(xì)菌性斑點(diǎn)病的病情指數(shù)不同接種調(diào)查時(shí)間對(duì)發(fā)病情況的影響如圖8所示，材料間接種后的病情發(fā)展趨勢(shì)基本一致：接種后第五天開始顯現(xiàn)病癥；第5到8天接種病情發(fā)展迅速；第8到11天，病情指數(shù)增長(zhǎng)速度減緩；11天后病情趨于穩(wěn)定。在接種后14±2天是病情觀察的適宜時(shí)期。圖8.接種后病情指數(shù)隨著接種天數(shù)的變化不同溫度和保濕時(shí)間對(duì)發(fā)病情況的影響給出了不同溫度和不同保濕時(shí)間下番茄植株的病情指數(shù)。當(dāng)溫度固定時(shí)，病情指數(shù)隨保濕時(shí)間的增加而增加，當(dāng)保濕時(shí)間為固定時(shí)，病情指數(shù)隨溫度的升高先增加后降低，合適的溫度（20—25℃）和較長(zhǎng)的保濕時(shí)間（＞96h）有利于病情的蔓延，病情指數(shù)較高。在25℃保濕時(shí)間為144ｈ時(shí)候，病情指數(shù)達(dá)到最大的86.58。表1.溫度和保濕時(shí)間對(duì)番茄接種細(xì)菌性斑點(diǎn)病病菌的病情指數(shù)的影響番茄種質(zhì)抗性鑒定試驗(yàn)對(duì)74份番茄種質(zhì)資源進(jìn)行細(xì)菌性斑點(diǎn)病抗性鑒定。采用苗期莖干接種法對(duì)這74份種質(zhì)資源進(jìn)行抗性鑒定。接種第5天出現(xiàn)了典型葉部斑點(diǎn)的發(fā)病癥狀，斑點(diǎn)褐色或深褐色，周圍有黃色暈圈，莖干傷口處變黑，在第10天左右莖干出現(xiàn)病斑。苗期莖千接種法的病情指數(shù)范圍為8.15—87.55，浸種法的病情指數(shù)范圍為12.5—86.67。比較苗期莖千法與浸種法的接種結(jié)果，兩種方法下抗性分型結(jié)果相同的番茄種質(zhì)資源有26份，對(duì)兩