番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病抗性鑒定技術(shù)規(guī)程-編制說明

一、項(xiàng)目來源根據(jù)《廣西標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會關(guān)于下達(dá)2020年第三批團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)制定項(xiàng)目計劃的通知》（桂標(biāo)協(xié)[2020]8號）文件精神，由廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所提出，廣西大學(xué)、廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所共同起草的團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)《番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病抗性鑒定技術(shù)規(guī)程》。二、項(xiàng)目背景及目的意義番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病與1933年首次在美國發(fā)現(xiàn)，隨后發(fā)展成為一種世界性冰河，遍及各大洲。番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病最高發(fā)病率可達(dá)100%，造成5%—75%的減產(chǎn)。降低果實(shí)的外觀品質(zhì)，對其商品性影響較大，該病已被列入我國的出入境檢疫有害生物名錄。番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病在植株苗期和成株期均可發(fā)生，可對植株的葉、莖、果柄、萼片、果面造成危害。近年來，在華南秋冬番茄的主產(chǎn)區(qū)廣西百色市田陽區(qū)爆發(fā)的番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病病害對番茄植株的莖部危害嚴(yán)重，且發(fā)病率可達(dá)80%以上，嚴(yán)重制約了廣西番茄主產(chǎn)區(qū)的發(fā)展。該病病原菌通過遺留在病葉、病果、發(fā)病枝條等植株殘余組織中以及田塊內(nèi)的雜草上。翌年借助風(fēng)雨傳播、灌溉水等傳播到植株上，或經(jīng)過人工整枝打杈等農(nóng)事活動造成的傷口以及植株上的氣孔、皮孔、水孔等自然孔口侵入組織，在植株的薄壁組織細(xì)胞間隙中蔓延，造成寄主細(xì)胞的破壞。同時病原菌在新田塊中可以通過帶菌的種子傳播。病原菌在干燥的種子上存活數(shù)年，環(huán)境條件適宜，在苗期即可侵染植株。低溫高濕是番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病發(fā)病的主要條件。氣溫在15℃以上，且連續(xù)陰雨達(dá)3d以上時，最有利于病情的發(fā)展。在栽培管理上，澆水多，排水不良，雨后積水，肥料供應(yīng)不足或偏施氮肥均會加重病害發(fā)生。在廣西番茄主產(chǎn)區(qū)之一的百色，地處亞熱帶氣候區(qū)，春季與量，冬季溫暖潮濕。番茄的種植主要在夏秋季節(jié)播種，冬季到翌年春季上市，多為露地栽培。冬季及早春易發(fā)生連續(xù)早晚間霧露重、陰雨天氣，導(dǎo)致該病呈現(xiàn)流行態(tài)勢。為解決這一問題，育種家針對番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病開展了抗病育種。然而再進(jìn)行抗病鑒定中遇到較多問題。一是病原菌的致病力在人工接種過程中的影響。病原菌致病力的分化，在同一病株的表現(xiàn)不同。二是缺乏統(tǒng)一的接種濃度。在眾多研究中表明，病原菌的濃度與病害的嚴(yán)重程度有關(guān)。在一定的范圍內(nèi)，病原菌的濃度越大，病害越嚴(yán)重；相反病原菌濃度過低，病害發(fā)生不充分，無法區(qū)分品種間的抗性。三是接種方法，不同病原菌的接種方法對抗性鑒定有較大的影響。接種方法應(yīng)根據(jù)病害的侵染特性等方面進(jìn)行綜合考慮。四是作物類型，作物不同的生長期對病害的敏感程度會出現(xiàn)差異。五是接種環(huán)境因素會影響病原菌的繁殖、侵染。因此，通過制定團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)《番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病抗性鑒定技術(shù)規(guī)程》，以標(biāo)準(zhǔn)為抓手，讓廣大科研院所和番茄育種企業(yè)規(guī)范鑒定番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病，從源頭上更好保障番茄的生長，提高番茄的經(jīng)濟(jì)價值，增加農(nóng)民收入，對推動我區(qū)番茄產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展，打造廣西番茄品牌，促進(jìn)農(nóng)民增收脫貧和鄉(xiāng)村振興均具有重要意義。三、項(xiàng)目編制過程（一）成立標(biāo)準(zhǔn)編制工作組團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)《番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病抗性鑒定技術(shù)規(guī)程》項(xiàng)目任務(wù)下達(dá)后，廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所成立了標(biāo)準(zhǔn)編制工作組，起草單位制定了起草編寫方案與進(jìn)度安排，明確任務(wù)職責(zé)，確定工作技術(shù)路線，開展標(biāo)準(zhǔn)研制工作。具體標(biāo)準(zhǔn)編制工作由廣西大學(xué)，廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所等起草單位組成標(biāo)準(zhǔn)編制工作組，編制工作組成員如下：。編制工作組下設(shè)三個組，分別是資料收集組、草案編寫組、標(biāo)準(zhǔn)實(shí)施組。資料收集組負(fù)責(zé)國內(nèi)外有關(guān)番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病的文獻(xiàn)資料的查詢、收集和整理工作，查閱前人對番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病抗病性鑒定研究情況和目前科學(xué)界對番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病抗病性鑒定方法的研究進(jìn)展。草案編寫組負(fù)責(zé)起草標(biāo)準(zhǔn)草案、征求意見稿和標(biāo)準(zhǔn)編制說明、送審稿及編制說明的編寫工作，包括后期召開征求意見會、網(wǎng)上征求意見，以及標(biāo)準(zhǔn)的不斷修改和完善。標(biāo)準(zhǔn)實(shí)施組負(fù)責(zé)《番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病抗性鑒定技術(shù)規(guī)程》團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)發(fā)布后，組織科研院所、相關(guān)育種企業(yè)開展標(biāo)準(zhǔn)宣貫培訓(xùn)會，對標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行詳細(xì)解讀，讓相關(guān)人員了解標(biāo)準(zhǔn)，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)對甘番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病抗病性鑒定方法進(jìn)行規(guī)范化操作，保證番茄品種抗病性鑒定的準(zhǔn)確性，并對標(biāo)準(zhǔn)實(shí)施情況進(jìn)行總結(jié)分析，不斷對團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)提出修正意見。（二）收集整理文獻(xiàn)資料標(biāo)準(zhǔn)編制工作組收集了國內(nèi)有關(guān)甘薯外源硒生物強(qiáng)化生產(chǎn)相關(guān)文獻(xiàn)資料。主要有：NY/T1858—2010(所有部分）番茄主要病害抗病性鑒定技術(shù)規(guī)程（三）研討確定標(biāo)準(zhǔn)主體內(nèi)容標(biāo)準(zhǔn)編制工作組在對收集的資料進(jìn)行整理研究之后，2020年4月，標(biāo)準(zhǔn)編制工作組召開了標(biāo)準(zhǔn)編制會議，對標(biāo)準(zhǔn)的整體框架結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，并對標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)鍵性內(nèi)容進(jìn)行了初步探討。經(jīng)過研究，標(biāo)準(zhǔn)的主體內(nèi)容確定為番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病抗性鑒定技術(shù)的術(shù)語和定義、試劑與材料、接種體制備、病原菌鑒定、鑒定條件和實(shí)驗(yàn)設(shè)計、接種、病情調(diào)查、抗病性評價。（四）調(diào)研、形成征求意見稿2020年4月—9月，標(biāo)準(zhǔn)起草工作小組進(jìn)行了廣泛實(shí)地調(diào)研工作，查閱了大量的國內(nèi)外文獻(xiàn)資料，對番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病抗性鑒定技術(shù)的前人研究成果進(jìn)行系統(tǒng)總結(jié)。形成了標(biāo)準(zhǔn)的基本構(gòu)架，對主要內(nèi)容進(jìn)行了討論并對項(xiàng)目的工作進(jìn)行了部署和安排。2020年10月，在前期工作的基礎(chǔ)之上，通過理清邏輯脈絡(luò)，整合已有的參考資料中有關(guān)番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病抗性鑒定技術(shù)要求，并結(jié)合廣西大學(xué)、廣西農(nóng)科院蔬菜所實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上，按照簡化、統(tǒng)一等原則編制完成團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)《番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病抗性鑒定技術(shù)規(guī)程》（草案）。2020年11月—2021年3月，標(biāo)準(zhǔn)起草工作組再次深入?yún)^(qū)內(nèi)番茄種植區(qū)進(jìn)行采樣，針對番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病抗性鑒定技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，掌握番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病抗性鑒定的具體技術(shù)要求。并實(shí)際征求意見，通過收集反饋了大量意見，標(biāo)準(zhǔn)編制工作組多次召開會議，對標(biāo)準(zhǔn)草案進(jìn)行了反復(fù)修改和研究討論。最終形成了團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)《番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病抗性鑒定技術(shù)規(guī)程》（征求意見稿）和（征求意見稿）編制說明。四、標(biāo)準(zhǔn)制定原則1、實(shí)用性原則本文件是在充分收集相關(guān)資料和文獻(xiàn)，分析番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病抗性鑒定技術(shù)當(dāng)前現(xiàn)狀，調(diào)研番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病的發(fā)病情況，在現(xiàn)有國家、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)相關(guān)番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病抗性鑒定技術(shù)要求的基礎(chǔ)上，結(jié)合廣西大學(xué)、廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所等多年的番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病抗性鑒定試驗(yàn)而總結(jié)起草的。符合當(dāng)前番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病抗性鑒定技術(shù)發(fā)展的方向與市場需求，有利于行業(yè)的長遠(yuǎn)發(fā)展，有利于提高番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病抗性鑒定效率，對推動我區(qū)番茄產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展，打造廣西番茄品牌，促進(jìn)農(nóng)民增收脫貧，具有較強(qiáng)的實(shí)用性和可操作性。2、協(xié)調(diào)性原則本文件編寫過程中注意了與番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病抗性鑒定技術(shù)相關(guān)法律法規(guī)的協(xié)調(diào)問題，在內(nèi)容上與現(xiàn)行法律法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)協(xié)調(diào)一致。3、規(guī)范性原則本文件嚴(yán)格按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的要求和規(guī)定編寫本標(biāo)準(zhǔn)的內(nèi)容，保證標(biāo)準(zhǔn)的編寫質(zhì)量。4、前瞻性原則本文件在兼顧當(dāng)前區(qū)內(nèi)番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病抗性鑒定現(xiàn)實(shí)情況的同時，還考慮到了番茄產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展的趨勢和需要，在標(biāo)準(zhǔn)中體現(xiàn)了個別特色性、前瞻性和先進(jìn)性條款，作為對番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病抗性鑒定技術(shù)的指導(dǎo)。五、標(biāo)準(zhǔn)主要內(nèi)容及依據(jù)來源團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)《番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病抗性鑒定技術(shù)規(guī)程》主要章節(jié)內(nèi)容包括術(shù)語和定義、試劑與材料、接種體制備、病原菌鑒定、鑒定條件和實(shí)驗(yàn)設(shè)計、接種、病情調(diào)查、抗病性評價。其中術(shù)語和定義主要依據(jù)番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病的主要發(fā)生情況和癥狀要求確定。試劑與材料、接種體制備、病原菌鑒定等主要依據(jù)廣西大學(xué)、廣西農(nóng)科院蔬菜研究所經(jīng)過試驗(yàn)驗(yàn)證確定。病原菌的分離鑒定在廣西田陽區(qū)那坡鎮(zhèn)番茄產(chǎn)地采樣的番茄葉片，經(jīng)分離純化后，菌落呈圓形，全緣或鋸齒狀，乳白色，表面光滑，略有光澤，質(zhì)地粘稠，菌落半徑在2mm左右。菌落形態(tài)特征見圖1。圖1.菌落形態(tài)特征煙葉過敏反應(yīng)與回接結(jié)果將保存的病原菌轉(zhuǎn)移到液體ＮＡ培養(yǎng)基中，設(shè)置溫度28℃，轉(zhuǎn)速120r/min震蕩培養(yǎng)48ｈ。用分光光度計在波長入＝600的條件下測定OD值，將菌液稀釋至OD為0.6—0.8。用注射器吸取菌液，沿著葉脈注射到煙草葉片葉肉組織中，24h觀察是否有斑枯過敏反應(yīng)。并將病原菌接種到健康番茄植株上，接種后，番茄植株放置于人工氣候箱中培養(yǎng)，溫度設(shè)定在25℃，空氣濕度為95±5％。結(jié)果表明病原菌發(fā)生煙葉過敏反應(yīng)；接種健康番茄植株，葉片出現(xiàn)斑點(diǎn)，斑點(diǎn)有黃色暈圈等典型癥狀。（圖2）圖2.煙葉過敏反應(yīng)及回接葉片發(fā)病情況分子鑒定結(jié)果分子鑒定擴(kuò)展程序與條件依據(jù)黃立飛等（2011）方法。以病原細(xì)菌的總基因組DNA為模板，上游引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’），下游引物1942R（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）進(jìn)行擴(kuò)增。進(jìn)行16srDNAPCR擴(kuò)增后，得到一條約1500bp的條帶（圖3）。通過與GenBank中的核酸序列進(jìn)行對比，其與丁香假單胞桿菌番茄致病變種的同源性達(dá)99%。圖3.病原菌的16srDNAPCR擴(kuò)增電泳圖不同接種方法對苗期植株病情指數(shù)的影響由圖4可知，對照組均不發(fā)病，說明發(fā)病是人工接種導(dǎo)致的；葉片針刺法在Ｂ、Ｃ、Ｄ種質(zhì)中病情指數(shù)均最高；剪葉接種法、葉柄接種法、莖干接種法在不同番茄種質(zhì)中，對病情指數(shù)的影響互有高低；菌土法的病情指數(shù)最低，使用菌土接種法，Ａ種質(zhì)的所有重復(fù)試驗(yàn)及Ｂ、Ｃ、Ｄ種質(zhì)的部分重復(fù)試驗(yàn)中，葉片出現(xiàn)無病癥的情況。Ｄ為感病對照番茄材料，利用針刺葉片接種法、剪葉接種法、莖干接種法、葉柄接種，Ｄ種質(zhì)均達(dá)到感病級別（病情指數(shù)＞40），不同的接種方法對４個種質(zhì)的接種病情指數(shù)的影響趨勢較一致。從病害充分發(fā)病的角度來看，針刺葉片接種法、剪葉接種法、莖干接種法、葉柄接種法均能滿足要求。圖4.不同接種方法對苗期植株病情指數(shù)的影響不同接種方法下的發(fā)病癥狀發(fā)病癥狀看，針刺葉片法發(fā)病從葉片開始發(fā)病，后逐漸蔓延到莖干，斑點(diǎn)在葉片上分布均勻（圖5Ａ）；剪葉法操作簡便，病癥首先出現(xiàn)在葉片上（圖5Ｂ）；葉柄法先在葉柄上形成斑點(diǎn)，后蔓延到葉片上，后期接種葉片常提前掉落（圖5Ｃ）；莖干接種法病癥顯癥時間要較葉片的兩種接種方法慢1到2ｄ，癥狀首先出現(xiàn)在莖部傷口周圍，形成水漬狀斑塊（圖5Ｄ），后面逐漸變黑，葉片出現(xiàn)典型癥狀較莖干慢，但是莖干接種法在接種植株之間發(fā)病較均勻。圖5.不同的接種方法的發(fā)病特點(diǎn)不同接種濃度下的病情指數(shù)從圖6中可以看出，隨著接種液濃度的升髙，４份番茄材料的病情指數(shù)均呈現(xiàn)增加的結(jié)果。在接種液濃度為1×106、1×107cfu/ml時候病情指數(shù)均顯著增加。由于Ｄ是己知的高感病的番茄種質(zhì)材料，在接種濃度為1×103、1×104、1×105、1×106cfu/ml時，病情指數(shù)＜40，發(fā)病不夠充分。當(dāng)用濃度為1×108、1×109cfu/ml的接種液進(jìn)行接種時，D發(fā)病充分。圖6.不同濃度接種液對番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病病情指數(shù)的影響不同生長階段接種的病情指數(shù)在番茄植株的三個生長階段進(jìn)行接種，４份番茄材料均表現(xiàn)出番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病的典型癥狀，從圖7中可以看出，在Ａ種質(zhì)中，開花期接種的病情指數(shù)最高，病情指數(shù)平均值達(dá)到44.8，極顯著高于３—５葉期和７—９葉期接種的病情指數(shù)，３—５葉期和７—９葉期之間病情指數(shù)差異不顯著；在Ｂ、Ｃ、Ｄ材料中，開花期和3—５葉期接種病情指數(shù)差異不顯著，兩時期均顯著高于７—９葉期接種。由此可知，病原菌最容易浸染花果期植株，其次為苗期，在營養(yǎng)生長旺盛的７—９葉期接種效果較差。從病情指數(shù)在不同種質(zhì)之間的變化趨勢上來看，３個生長階段的對不同種質(zhì)的抗性鑒定結(jié)果的變化趨勢較一致，但是７—８葉時期接種接種發(fā)病效果低，不能反映出種質(zhì)的抗性差異。圖7.接種不同生長階段番茄植株細(xì)菌性斑點(diǎn)病的病情指數(shù)不同接種調(diào)查時間對發(fā)病情況的影響如圖8所示，材料間接種后的病情發(fā)展趨勢基本一致：接種后第五天開始顯現(xiàn)病癥；第5到8天接種病情發(fā)展迅速；第8到11天，病情指數(shù)增長速度減緩；11天后病情趨于穩(wěn)定。在接種后14±2天是病情觀察的適宜時期。圖8.接種后病情指數(shù)隨著接種天數(shù)的變化不同溫度和保濕時間對發(fā)病情況的影響給出了不同溫度和不同保濕時間下番茄植株的病情指數(shù)。當(dāng)溫度固定時，病情指數(shù)隨保濕時間的增加而增加，當(dāng)保濕時間為固定時，病情指數(shù)隨溫度的升高先增加后降低，合適的溫度（20—25℃）和較長的保濕時間（＞96h）有利于病情的蔓延，病情指數(shù)較高。在25℃保濕時間為144ｈ時候，病情指數(shù)達(dá)到最大的86.58。表1.溫度和保濕時間對番茄接種細(xì)菌性斑點(diǎn)病病菌的病情指數(shù)的影響番茄種質(zhì)抗性鑒定試驗(yàn)對74份番茄種質(zhì)資源進(jìn)行細(xì)菌性斑點(diǎn)病抗性鑒定。采用苗期莖干接種法對這74份種質(zhì)資源進(jìn)行抗性鑒定。接種第5天出現(xiàn)了典型葉部斑點(diǎn)的發(fā)病癥狀，斑點(diǎn)褐色或深褐色，周圍有黃色暈圈，莖干傷口處變黑，在第10天左右莖干出現(xiàn)病斑。苗期莖千接種法的病情指數(shù)范圍為8.15—87.55，浸種法的病情指數(shù)范圍為12.5—86.67。比較苗期莖千法與浸種法的接種結(jié)果，兩種方法下抗性分型結(jié)果相同的番茄種質(zhì)資源有26份，對兩