云上黑山羊養(yǎng)殖規(guī)范 第3部分：胚胎移植

1DBFORMTEXT53/T丄FORMTEXTX云上黑山羊養(yǎng)殖規(guī)范云上黑山羊養(yǎng)殖規(guī)范第3部分：胚胎移植本文件確立了供體羊的選擇與飼養(yǎng)管理、超數(shù)排卵和配種、胚胎回收、胚胎質(zhì)量鑒定、胚胎冷凍保存與解凍、胚胎移植等技術(shù)要求。本文件適用于云上黑山羊擴繁。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。NY/T826綿羊胚胎移植技術(shù)規(guī)程NY5027無公害食品畜禽飲用水水質(zhì)DB53/T***云上黑山羊養(yǎng)殖規(guī)范第2部分：人工授精3術(shù)語和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。4供體羊的選擇與飼養(yǎng)管理4.1供體羊的選擇供體羊選擇應(yīng)符合以下條件：a)符合云上黑山羊的典型特征，一級及以上等級，系譜清楚，遺傳性能穩(wěn)定；b)健康、體質(zhì)健壯、中等及以上膘情；c)發(fā)情周期正常，生殖機能正常，無遺傳性或傳染性疾病；d)年齡1.5周歲～4周歲，體重40kg以上，空懷；e)經(jīng)產(chǎn)母羊產(chǎn)后90d以上，羔羊已斷奶，生殖機能恢復正常；f)重復超排間隔時間在60d以上。4.2飼養(yǎng)管理供體羊的飼養(yǎng)管理應(yīng)滿足以下要求：a)分群飼養(yǎng)，專人管理；b)保持飼養(yǎng)環(huán)境相對穩(wěn)定，飼養(yǎng)環(huán)境衛(wèi)生、干燥、圈舍溫度適宜，避免應(yīng)激反應(yīng)；c)營養(yǎng)均衡，飲用水符合NY5027的要求。5超數(shù)排卵和配種2DBFORMTEXT53/T丄FORMTEXTX5.1超數(shù)排卵5.1.1激素FSH（垂體促卵泡素）、P（孕酮，激素包埋在硅膠栓CIDR內(nèi)，在陰道內(nèi)緩慢釋放）。5.1.2方法按以下方法進行超數(shù)排卵：a)于發(fā)情周期的任意一天埋置陰道孕酮硅膠栓（CIDR），計為第1d，第9d更換第二個CIDR；b)第15d開始采用減量法每天早、晚間隔12h各注射一次FSH，連續(xù)注射4d共8次，4d注射總劑量比例為4：3：2：1；c)在第7次注射FSH時取出CIDR；d)FSH注射總劑量按供體羊體重計算，宜在0.20mg/kg～0.25mg/kg之間。5.2記錄按NY/T826要求記錄供體羊超數(shù)排卵。5.3配種供體羊取栓后12h～36h進行發(fā)情鑒定，發(fā)情母羊進行本交或人工授精，發(fā)情鑒定和人工授精方法按DB53/T****.2要求執(zhí)行。6胚胎回收6.1時間供體羊發(fā)情后第一次配種或輸精當日記為0d，在第2d～3d或第6d～7d用手術(shù)法分別從輸卵管或子宮角回收胚胎，母羊回收胚胎前禁食24h，禁水12h。6.2沖胚方法6.2.1輸卵管法操作方法參照NY/T826執(zhí)行。6.2.2子宮法子宮法沖胚按照以下步驟和要求進行：a)按NY/T826規(guī)定準備藥品、器材、配制沖胚液，也可以使用商品化的專用沖胚液；b)將供體羊仰臥于手術(shù)保定架上，按每公斤體重靜脈注射0.02mL～0.03mL2%鹽酸賽拉唑麻醉；c)手術(shù)部位宜選擇乳房前腹中線部，刮凈術(shù)部毛，分別用清水和消毒液清洗，然后由里向外涂以2%～4%的碘酒，待干后再用75%的酒精棉脫碘；d)蓋上創(chuàng)巾，使預(yù)定的切口部位暴露在創(chuàng)巾開口的中部；e)按皮膚、皮下組織、肌肉、腹膜的順序切口，然后將食指及中指由切口伸入腹腔，在骨盆腔、膀胱周圍觸摸子宮，并將子宮、卵巢引出切口外；f)記錄兩側(cè)卵巢黃體數(shù)和卵泡數(shù)；g)在子宮體基部打孔，將沖卵管插入，依據(jù)羊只發(fā)情到?jīng)_胚當天時間間隔，使氣球在子宮角中部，沖卵管尖端靠近子宮角前端；3DBFORMTEXT53/T丄FORMTEXTXh)使用5mL一次性注射器緩慢注入3mL～5mL氣體，沖卵管另一端接大平皿；i)用套管針在子宮角細部無血管處插入，外接抽取25mL37℃沖胚液的注射器，一只手的手指在套管針頭后方捏緊子宮角細部，另一只手推注射器，緩慢注入液體，使液體順暢地從沖卵管流入大平皿中待檢；j)沖完后將氣球放氣，抽出沖卵管和套管針，用同樣方法回收另一側(cè)胚胎。6.3記錄按NY/T826要求記錄供體羊胚胎回收。7胚胎質(zhì)量鑒定7.1檢胚收集檢胚收集按下列要求進行：a)實驗室溫度20℃~25℃,體視顯微鏡下由低倍到高倍檢胚，一般在40倍左右發(fā)現(xiàn)胚胎，100倍對胚胎鑒定分級；b)將檢出的胚胎放入盛有保存液的Φ35mm培養(yǎng)皿中，沖洗胚胎3次～5次，然后把全部胚胎移至另一個培養(yǎng)皿；一只供體羊的胚胎放在同一個培養(yǎng)皿內(nèi)。7.2發(fā)育階段鑒定在40倍～120倍的體視顯微鏡下，觀察受精卵或胚胎的發(fā)育狀態(tài)、形態(tài)輪廓、色澤、卵裂球的大小、均勻度、細胞密度、變性程度以及胚齡與發(fā)育期是否吻合等，胚胎發(fā)育期劃分為下列七個階段：a)第2d～3d從輸卵管回收的胚胎，發(fā)育階段為2細胞期～8細胞期，可清楚地觀察到卵裂球，卵黃腔內(nèi)空隙較大，為受精卵；b)第3d～4.5d回收的胚胎，可以觀察到球狀的細胞團，分不清卵裂球，細胞團占據(jù)卵黃腔的大部分，為桑椹胚；c)第4.5d～5d回收的胚胎，細胞團變小，占卵黃的60%～70%，為致密桑椹胚；d)第5d～6d天回收的胚胎，細胞團的一部分出現(xiàn)發(fā)亮的胚泡團和滋養(yǎng)層，為早期囊胚；e)第6d～7d天回收的胚胎，內(nèi)細胞團和滋養(yǎng)層界線清晰，胚泡腔明顯，細胞充滿卵黃腔，為囊胚；f)發(fā)情后第7d～7.5d回收的胚胎，囊腔明顯擴大，體積增大到原來的1.2倍～1.5倍，與透明帶之間無空隙，透明帶變薄，相當于正常厚度的1/3，為擴張囊胚；g)在發(fā)情后的第7.5d～8d，由于胚泡腔繼續(xù)擴張，致使透明帶破裂，胚細胞脫出，為孵化胚。7.3等級評定分為以下四個等級：a)A級，優(yōu)質(zhì)胚。發(fā)育正常，胚齡與發(fā)育期相吻合，輪廓清楚，透明度適中，細胞密度大，卵裂均勻，無變性的細胞；b)B級，良好胚。發(fā)育基本符合預(yù)定胚齡，輪廓清楚，明暗適中或稍暗稍淡，細胞密度較小或小型卵裂球過多，細胞變性率為10%～20%；c)C級，普通胚。輪廓不清楚，色澤過暗或過淡，細胞密度小，細胞變性率為30%～40%；d)D級，等外胚（不可用胚）。未受精卵和變性胚。7.4各等級胚胎的使用4DBFORMTEXT53/T丄FORMTEXTX各等級胚胎的使用按以下要求執(zhí)行：a)冷凍保存用胚胎應(yīng)選擇A級囊胚；b)鮮胚移植時按可用胚胎總數(shù)和可移植胚胎受體羊數(shù)量，以A、B、C級胚胎混合使用；c)每只受體羊移植不超過2枚A級胚胎或3枚B級胚胎；d)C級胚胎不單獨移植，應(yīng)與A級胚胎按1：1或B級胚胎1：2進行搭配移植。8胚胎冷凍保存與解凍8.1冷凍保存8.1.1儀器及材料體視顯微鏡、程序冷凍儀、0.25mL塑料冷凍細管、培養(yǎng)皿、封口粉、冷凍記號筆等。8.1.2試劑沖胚液、以沖胚液為基礎(chǔ)液配制的0.5mol/L乙二醇、1.0mol/L乙二醇、1.5mol/L乙二醇、0.5mol/L蔗糖。8.1.3冷凍按下列方法進行冷凍：a)標記，在0.25mL細管上用冷凍記號筆寫上品種、耳號、胚胎數(shù)量、發(fā)育階段和質(zhì)量等級；b)洗滌與平衡，先將胚胎用沖胚液洗滌3次，依次在0.5mol/L和1.0mol/L乙二醇中各平衡5min后裝管；c)裝管，用0.25mL細管吸取少量0.5mol/L蔗糖、空氣、1.5mol/L乙二醇、空氣、1.5mol/L乙二醇，并在此段放入已平衡好的胚胎，再吸取空氣、1.5mol/L乙二醇、空氣、0.5mol/L蔗糖，最后，用封口粉封口；d)0.25ml冷凍細管各段分布圖詳見圖1；e)冷凍，胚胎放入冷凍細管后再平衡15min，然后將細管放入程序冷凍儀，以-3℃/min的速率從室溫降至-6.5℃并植冰（用沾有液氮的脫脂棉輕觸胚胎段兩頭的冷凍液，誘發(fā)細管內(nèi)冰晶的形成在此溫度下平衡10min，再以-0.3℃/min的速率降至-35℃,平衡10min后投入液氮保存，程序圖詳見圖2。圖1胚胎冷凍保存細管（0.25ml）裝管圖5DBFORMTEXT53/T丄FORMTEXTX圖2胚胎冷凍程序圖8.2解凍解凍按照以下步驟進行：a)從液氮中取出裝有胚胎的細管，空氣浴7s～10s后37℃水浴10s；b)用消毒紙巾擦干細管，再用半干的酒精棉球擦拭細管表面，剪掉細管兩端封口；c)將細管內(nèi)液體盛放于培養(yǎng)皿中，于體視顯微鏡下快速檢出胚胎移入0.5mol/L蔗糖緩沖液中平衡5min，再用沖胚液洗滌3次后備用。9胚胎移植9.1受體羊選擇受體羊選擇應(yīng)符合以下要求：a)空懷；b)繁殖性能良好、健康，膘情在7成以上；c)年齡1.5歲～5歲，經(jīng)觀察有兩個正常發(fā)情周期。9.2受體羊飼養(yǎng)管理受體羊應(yīng)按以下要求飼養(yǎng)管理：a)單獨組群加強飼養(yǎng)，在移植前30d開始補飼；b)飼養(yǎng)環(huán)境穩(wěn)定，避免應(yīng)激反應(yīng)；c)加強公羊管理，避免偷配；d)新購進受體羊需進行驅(qū)蟲和綜合免疫處理，隔離觀察、復膘適應(yīng)新環(huán)境，發(fā)情周期正常后再做為受體羊使用。9.3受體羊同期發(fā)情處理受體羊同期發(fā)情按以下方法處理：a)將孕酮硅膠栓（CIDR，孕酮含量為300mg/個）或海綿栓（孕酮含量為400mg/個）埋置入母羊陰道，放置15d～17d后取出；b)取栓時肌注孕馬血清促性腺激素（PMSG）200IU/只～250IU/只，24h～48h內(nèi)觀察發(fā)情；c)受體羊發(fā)情之日為0d，按胚齡一致性要求進行移植。9.4受體羊發(fā)情鑒定6DBFORMTEXT53/T丄FORMTEXTX受體羊的發(fā)情鑒定按DB53/T****.2規(guī)定執(zhí)行。9.5要求胚胎移植應(yīng)滿足以下要求：a)根據(jù)發(fā)情記錄判定供體（胚齡）與受體羊的發(fā)情時間差確定移植時間，供、受體羊發(fā)情時間差宜在±12h以內(nèi)；b)根據(jù)黃體突出卵巢的直徑，將黃體發(fā)育程度分為優(yōu)（0.5cm～1.0cm）、中（0.3cm～0.49cm）、差（小于0.3cm黃體發(fā)育為中等及以上時適合進行移植操作；c)胚胎移植部位應(yīng)與供體母羊回收胚胎的部位一致，即輸卵管回收的胚胎移植于輸卵管，子宮角回收的胚胎移植于子宮角；d)受體羊術(shù)前需禁食24h、禁水12h。9.6操作9.6.1常規(guī)手術(shù)法將受體羊仰臥于手術(shù)保定架上，按每公斤體重靜脈注射0.01mL～0.02mL2%鹽酸賽拉唑，手術(shù)部位及手術(shù)要求執(zhí)行5.2.2相關(guān)規(guī)定，具體方法如下：a)輸卵管移植時，將有黃體一側(cè)的輸卵管傘部撥開，找到管口，把裝有胚胎的移植器從此插入3cm～4cm，然后將胚胎輕輕推出即可，操作中不可用力牽拉卵巢，不能觸摸黃體；b)子宮角移植時，將黃體較好一側(cè)的子宮角拉出，避開血管，用曲別針制成的打孔針在子宮角打孔，把裝有胚胎的移植器從此孔插入子宮腔內(nèi)，伸至子宮角尖端后將胚胎輕輕推出即可。9.6.2腹腔內(nèi)窺鏡法將受體羊仰臥于手術(shù)保定架上，按每公斤體重靜脈注射0.01mL～0.02mL2%鹽酸賽拉唑，手術(shù)部位及手術(shù)要求執(zhí)行5.2.2相關(guān)規(guī)定，具體方法如下：a)用手術(shù)刀片在腹中線兩側(cè)，距乳房2cm處，各切一個1.0cm～1.5cm的小口；b)用與腹腔鏡配套的專用打孔器將腹膜、肌肉打通，在兩側(cè)刀口內(nèi)放入腹腔鏡和子宮鉗；c)在子宮不暴露于體外的情況下，利用腹腔鏡觀察卵巢上黃體發(fā)育情況；d)用子宮鉗夾住黃體較好側(cè)子宮角尖端系膜并將其拉出，避開血管，在子宮角打孔；將裝有胚胎的移植槍朝子宮角方向推出胚胎。9.7記錄胚胎移植記錄參見表1。表1胚胎移植記錄表9.8術(shù)后管理9.8.1創(chuàng)口處理及觀察7DBFORMTEXT53/T丄FORMTEXTX術(shù)后創(chuàng)口處理及觀察要求如下：a)供體沖胚完畢后，用37℃滅菌生理鹽水濕潤母羊子宮，沖去凝血塊，器官復位，腹腔內(nèi)倒入250mL37℃滅菌生理鹽水；b)腹膜、肌肉層采用連續(xù)縫合后撒適量青霉素粉，皮膚層采用節(jié)節(jié)縫合法縫合后傷口用碘酒消毒；c)從手術(shù)當天開始每天早、晚肌肉注射青霉素、鏈霉素各80萬IU，同時用碘酒對傷口進行消毒，連續(xù)3d，第7d可拆線；d)受體羊移植胚胎后，將子宮角復位即可縫合，方法和供體羊一致，縫合完畢后肌肉注射孕酮2mL和青霉素、鏈霉素各80萬IU；e)供體、受體羊術(shù)后觀察24h，無異常后跟群放牧或與其他羊只混群；f)如有臥地不起、弓腰弓背或不進食不排便的現(xiàn)象，應(yīng)及