分子生物學方式檢測結(jié)核桿菌對利福平耐藥性研究進展

分子生物學方式檢測結(jié)核桿菌對利福平耐藥性研究進展摘要:最近幾年對結(jié)核桿菌耐藥機制的研究說明，rpoB基因是利福平耐藥相關(guān)基因，耐藥株通常發(fā)生特定位點基因突變，因此能夠通過鑒定突變有無而評估其利福平耐藥性，本文對這方面研究做一簡要綜述。結(jié)核病至今仍是世界上一個嚴峻的公共衛(wèi)生問題，估量目前全世界每一年有800萬新病例發(fā)生，290萬人死于結(jié)核病，是現(xiàn)今單一致病菌致死的最要緊死因。近十幾年來結(jié)核病疫情呈現(xiàn)全世界性明顯上升趨勢，產(chǎn)生緣故之一是耐藥菌株的產(chǎn)生和播散。1990年我國結(jié)核病流行調(diào)查結(jié)果說明，我國臨床分離株耐藥率達％，初始耐藥率％，復治繼發(fā)耐藥率％。利福平是一種要緊的抗結(jié)核藥物，對利福平耐藥常常致使化療失敗，且被以為是多耐藥菌株的標志之一。因此初期迅速對結(jié)核患者利福平耐藥性進行鑒定十分重要?，F(xiàn)將有關(guān)研究進展做進一簡要綜述。傳統(tǒng)方式依托直接或間接含藥培育進行結(jié)核分支桿菌利福平耐藥性鑒定，這是體外結(jié)核桿菌耐藥性的直接證據(jù)，而且能夠了解其對利福平耐藥程度。但各實驗室間所用培育基不同，檢測方式不同，結(jié)果判定標準不一，致使結(jié)果報告不同，而且由于結(jié)核分支桿菌本身屬于緩慢生長菌，使得耐藥培育耗時長，通常需8～12周，不能知足現(xiàn)代短程化療需要。最近幾年進展起來的應用BACTEC460TB系統(tǒng)進行結(jié)核桿菌快速培育及藥敏測定能夠大大縮短結(jié)果回報時刻，但此法成立在培育方式基礎(chǔ)上仍需數(shù)天出結(jié)果，加上儀器試劑昂貴，有放射性污染等，限制了臨床普遍應用。1利福平耐藥基因的研究關(guān)于結(jié)核桿菌利福平耐藥機制一直存在三種假設，膜通透性改變、耐藥質(zhì)粒介導及染色體組基因突變（耐藥性有關(guān)基因），其中已證明耐藥基因突變與利福平耐藥有緊密關(guān)系。關(guān)于細菌利福平耐藥基因研究第一在大腸桿菌取得重要沖破。第一發(fā)覺利福平耐藥的大腸桿菌其RNA聚合酶有突變而且只發(fā)生在β亞單位上，并推知產(chǎn)生這種β亞單位突變的基因位點相接，進一步對基因研究取得了大腸桿菌野生株編碼RNA聚合酶β亞單位基因（rpoB）序列，并發(fā)覺耐利福平的大腸桿菌有rpoB基因突變。由于編碼RNA聚合酶基因在細菌進化中呈高度序列保守性，依照對大腸桿菌利福平耐藥基因的研究資料，Telenti[1]第一對結(jié)核分支桿菌利福平耐藥基因突變進行了全面研究，發(fā)此刻與大腸桿菌rpoB基因突變多發(fā)區(qū)（Ⅰ區(qū)）相應位點（511～533aa）的長69bp片段內(nèi)，64/66耐藥株有突變發(fā)生，而未見于56株利福平靈敏結(jié)核菌株。爾后許多研究都證明這一結(jié)果，并發(fā)覺發(fā)生于此區(qū)城內(nèi)新的突變位點[2～5]。而Miller[6]做了如此一項研究，他應用致點突變技術(shù)造成編碼rpoB基因531號氨基酸（參考大腸桿菌基因位點）堿基突變并將其導入利福平靈敏的恥垢分支桿菌株LRZZZ中，使之發(fā)生了表型改變，即由原先的利福平靈敏株轉(zhuǎn)為利福平耐藥，也證明rpoB基因突變是致使利福平耐藥的唯一緣故。Williams[4]對一患者感染的結(jié)核桿菌株發(fā)生利福平耐藥表型轉(zhuǎn)換前后做了rpoB基因序列分析研究，證明表型發(fā)生改變后其耐藥基因發(fā)生了改變。但ropB基因突變致利福平耐藥詳細機制目前還未十分明了。2分子生物學檢測方式上述對結(jié)核桿菌利福平耐藥機制研究取得的重要功效為運用分子生物學方式進行耐藥性評估提供了堅實的理論依據(jù)，其技術(shù)線路大體上是在用PCR方式對rpoB基因突變集中區(qū)域擴增基礎(chǔ)上，對擴增產(chǎn)物進行突變鑒定，歸納如下：直接順序法對突變多發(fā)區(qū)城序列分析是鑒定突變的最直觀靠得住的方式，能夠準確判定突變的有無及突變性質(zhì)，也是其它快速間接辨別方式的金標準。應用放射性同位素或熒光標記測序法，已發(fā)覺許多突變位點及不同的氨基酸置換。突變在511-533這一區(qū)域內(nèi)發(fā)生率達95％以上，其中以531，526，533，516四個位點最為常見[1～5]。Williams研究了流行病學特點和結(jié)核桿菌利福平耐藥突變性質(zhì)之間的內(nèi)在聯(lián)系，以為突變位點及性質(zhì)與耐藥模式及程度，IS6110圖譜及地位來源等無明顯相關(guān)關(guān)系。但Taniguechi[5]有不同意見，他研究結(jié)果說明513，526，531位點的突變致使對利福平高度耐藥而其他位點那么明顯低度耐藥或全然無耐藥性?？傊苯訙y序能夠取得突變詳細資料，還能夠?qū)π掳l(fā)覺突變進行鑒定，不足的地方是儀器試劑昂貴，操作復雜，本錢高，有放射性污染，不適于普遍推行應用。多聚酶鏈式反映-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析法（PCR-SSCP）其原理為依照在非變性聚丙烯酰胺凝膠中相同長度單鏈DNA片段泳動距離的改變判定單個堿基變異。由于利福平耐藥突變只在特定區(qū)域內(nèi)發(fā)生，而通過PCR方式擴增這段基因，直接電泳判定突變有無，大大簡化了突變分析操作。Telenti[1]最先評估了放射性同位素標記PCR-SSCP方式的結(jié)核桿菌rpoB突變中的應用價值。所有利福平耐藥菌株均成功地被檢測出來，證明此方式特異準確。它能夠同時進行大量臨床標本挑選，使結(jié)果回報時刻縮至48～72小時。目前國內(nèi)外本方式的研究較多，并已有成功用于臨床痰標本及腦脊液標本檢測的報導[2,7,8]。SSCP方式為臨床快速簡便鑒定結(jié)核桿菌ropB基因突變開辟了新領(lǐng)域，盡管存在必然不足，如每次電泳均需有標準結(jié)核桿菌株對照及有時不同不易區(qū)分、不能辨別沉默突變[9]等，但仍不失為一種有普遍應用前景的方式。雙脫氧指紋圖法（dideoxyfingerprinting,ddF）在對PCR產(chǎn)和的進行ropB基因突變檢測方式的研究中，F(xiàn)elmee應用了ddF法[9]，這種方式結(jié)合運用了雙脫氧結(jié)尾終止法及SSCP法的原理，它將ropB基因片段復制產(chǎn)物做模板直接加入用于產(chǎn)生類似DNA測序產(chǎn)物的有放射性標記的不同長度的雙脫氧結(jié)尾片段，再行SSCP，經(jīng)放射自顯影后得出針對不同突變的特異的ddF。如此，若是有ropB基因突變，在SSCP電泳中不僅能夠從因單鏈構(gòu)象改變產(chǎn)生的泳動距離不同在SSCP中得以辨別，同時由于其雙脫氧結(jié)尾終止位點不同于標準株，雙脫氧末段片段數(shù)量也不同而得以區(qū)分。Felmee檢測出了有不同突變（其中包括了80％已報導的ropB突變）的所有多耐藥菌株，每一突變均有特異的ddF。在與SSCP分析法的對照研究中，以為ddF方式能夠克服SSCP結(jié)果受電泳條件、電泳時刻阻礙大，受突變性質(zhì)（位點及突變堿基）阻礙大及不能區(qū)分出，在時刻和本錢上都有優(yōu)越性，但未見有進一步臨床應用情形的報導。異源雙鏈形成法（heteroduplexformation,HDF）HDF可用于檢測DNA單個堿基突變或缺失，原理為突變基因與無突變基因PCR擴增產(chǎn)物混合，變性后使其溫度緩慢下降，部份可形成別離來源于突變與靈敏株基因的異源雙鏈，同時有部份形成同源雙鏈，電泳后可將二者區(qū)分開來，而且突變不同（如單堿基突變，插入、或缺失），形成的異源雙鏈遷移距離也不同。Williams[4]用HDF法進行了結(jié)核桿菌利福平ropB突變檢測的嘗試，110株RFP耐藥株經(jīng)HDF檢測取得多條帶形，證明有異源雙鏈形成，而靈敏株那么只形成一條同源雙鏈，HDF法與DNA測序法符合率達100％。這種方式操作簡便，判定容易，不需放射性標記，適合應用于臨床，但有關(guān)報導較少。反向系列探針雜交法（Innolineprobeassay,LiPA）LiPA方式基于探針雜交原理，先設計合成一系列探針，覆蓋整個ropB突變多發(fā)區(qū)，其中S系列探針針對野毒株序列，R系列探針含數(shù)個有常見突變序列的探針，還能夠設計一個有種屬特異性的探針，將這一系列探針按序固定于同一雜交膜上，在嚴格條件下與親和素標記的PCR產(chǎn)物雜交，檢測雜交信號，依照不同雜交帶譜判定出突變有無及大致位置。這種雜交方式能夠同時進行種屬鑒定，檢測試劑盒已有廠家生產(chǎn)，結(jié)果判定容易，特異性高，易于標準化。如Beenhouwer[10]應用此法對臨床痰標本的檢測中與藥敏結(jié)果對照有97％（65/67）的符合率。最近有學者[11]應用此法同時對結(jié)核分支桿菌進行種屬鑒定及PCR靈敏性測定，特異性達100％，對107株已知序列的結(jié)核桿菌臨床分離株測定中，61株靈敏株全數(shù)顯示靈敏型雜交帶譜，203株耐藥株除4株外均檢測到突變帶譜，誤診率下降到％。不足的地方是操作復雜，本錢較高。以上分子生物學方式對結(jié)核桿菌RFP耐藥性檢測應用中均有快速、準確，特異等優(yōu)勢，可在72h內(nèi)報告結(jié)果，能夠知足初期臨床診治需要，是結(jié)核桿菌RFP耐藥性測定進展必然趨勢。下一步研究重點是提高臨床標本ropB基因擴增特異性（因其單拷貝存在于基因組中），技術(shù)條件標準化、標準化，和將耐藥性診斷及種屬鑒定同時進行的方式，使其能夠成為直接應用于臨床的有效方式。參考文獻1Telenti,ImbodenP,MarchesiF,etal.Lancet,1993；341:647-6502TeletiA,ImbodenP,MarchesiF,etal.AntimicroAgentsChemother,1993；37:2045-20583KapurV,LiLL,IordanescuS,etal.JClinMicrobiol,1994；32:1095-10984WilliamsDL,WaguespackC,EisenachK,etal.1994；35:2380-23865TaniguichiH,AramakiH,NikadoY,etal.FEBS-microbiolLett,1996；144:103-1086MillerLP,CrawfordJJ,ShinnickTM.AntimicroAgentsChemother,1994；38:805-8117ScarpelliniP,BragliaS,BrambillaAM,etal.JClinMicrobiol,1997；5:2802-28068程紹基，嚴碧涯，馬嶼，等。中華結(jié)核和呼吸雜志，1996；19：333-3379FelmeeTA,LiuQ,Wh