DB35T 1995-2021 禽心包積液-肝炎綜合征熒光定量 PCR 診斷技術(shù)　

35FluorescencequantitativePCRdiagnosisoffowlhydropercardium-hepatitisI 2 2 3 3 3 4 5 6本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定本文件起草單位：福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所、福州海關(guān)1禽心包積液-肝炎綜合征熒光定量PCR診斷技術(shù)本文件適用于禽心包積液-肝炎綜合征的分子生物學(xué)診斷及流禽心包積液-肝炎綜合征fowlhydropercardium-hepatitissyndr禽腺病毒4型fowladenov熒光定量PCR反應(yīng)中每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的4疫病概述有很強(qiáng)的致病性。2010年以來(lái)，我國(guó)多地發(fā)生了HHS，并從發(fā)病雞群中分離到FAdV-4。該病主要臨床特蛋雞偶有發(fā)生，有報(bào)道鴨、鵝、鴿及野鳥(niǎo)也可發(fā)生該病。發(fā)病雞在4d后開(kāi)始死亡，死亡期可持續(xù)7d~25.1.1臺(tái)式冷凍高速離心機(jī)（轉(zhuǎn)速5.1.3微量可調(diào)移液器（量程分別為100μL～1000μL、20μL～200μL、2μL～20μL、0.5μL~5.2材料和試劑）：5.2.7蛋白酶K、Tris飽和苯酚、酚:氯仿:異戊醇（25:24:1）、無(wú)水乙醇5.2.11陰性對(duì)照：Nuclease-freeWate樣品采集后應(yīng)保存在2℃~8℃條件下，24h內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室。超過(guò)24h的應(yīng)保存在-20℃條件下，且時(shí)間不應(yīng)超過(guò)7d。如需長(zhǎng)期保存，須保存在-70℃~-80℃條件下。取出棉拭子樣品，于旋渦混合儀上振蕩15s，4℃、5000r/min離心10min，取3取組織樣品，按質(zhì)量體積比（1:5）加入組織稀釋液進(jìn)行勻漿，轉(zhuǎn)入1.5mL無(wú)菌離心管中，反復(fù)凍7.1.3離心后吸取上清液轉(zhuǎn)移至1.5mL無(wú)菌離心管（注意不要吸出），），在PCR反應(yīng)管中分別加入以下試劑：ProbeqPCRmix10μL，引物FAdV-4-F、FAdV-4-R各0.4μL，40個(gè)循環(huán)；最后保存于4℃。同時(shí)，設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照各至少一9結(jié)果判定待檢樣品Ct值＞35時(shí)，或無(wú)典型的擴(kuò)增曲線，判為FAdV-4核酸檢測(cè)陰性，見(jiàn)4必要時(shí)可對(duì)定量PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，參考序列5A.1棉拭子稀釋液和制霉菌素（5000IU/mL調(diào)節(jié)pH至7.2～7.4。A.2組織稀釋液和制霉菌素（1000IU/mL調(diào)節(jié)pH至7.2～7.4。稱量10g十二烷基硫酸鈉，加入90mL滅菌雙蒸水，小心攪拌A.575%乙醇量取750mL的無(wú)水乙醇加入250mL的a)正向引物FAdV-4-F：5′-CCCGATCTCAGTCAAATT-b)反向引物FAdV-4-R：5′-TGCTAAACTTGTAACGGTC-3′；c)探針引物FAdV-4-P：5′-FAM-AACGACAAAAACACCGC熒光定量PCR擴(kuò)增片段為196bp，引物和探針用雙蒸水溶解至10μmol/L6(資料性)熒光定量PCR擴(kuò)增曲線圖和擴(kuò)增產(chǎn)物參考基因序列B.1熒光定量PCR擴(kuò)增曲線圖以建立的熒光定量PCR診斷技術(shù)對(duì)2份陽(yáng)性樣品和2份陰性樣品進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)B.2擴(kuò)增產(chǎn)物參考基因序列cccgatctcagtcaaattaaactctacaccaacaacaccgccgcgaacga