第二章 菌種的來(lái)源課件

第二章：菌種的來(lái)源微生物的特性及工業(yè)微生物的要求一些工業(yè)化產(chǎn)品生產(chǎn)菌種的特點(diǎn)自然界中有目的微生物分離的原則菌種選育、分子育種第二章菌種的來(lái)源第一節(jié)微生物的特性及工業(yè)微生物的要求一、微生物的特性

有些微生物能在厭氧的條件下生長(zhǎng)

有些微生物能夠利用簡(jiǎn)單的有機(jī)物和無(wú)機(jī)物滿(mǎn)足自身的生長(zhǎng)

有些微生物能進(jìn)行復(fù)雜的代謝

有些微生物能利用較復(fù)雜的化合物

有些微生物能在極端的環(huán)境下生長(zhǎng)第二章菌種的來(lái)源二：工業(yè)化菌種的要求

能夠利用廉價(jià)的原料，簡(jiǎn)單的培養(yǎng)基，大量高效地合成產(chǎn)物

有關(guān)合成產(chǎn)物的途徑盡可能地簡(jiǎn)單，或者說(shuō)菌種改造的可操作性要強(qiáng)

遺傳性能要相對(duì)穩(wěn)定

不易感染它種微生物或噬菌體

產(chǎn)生菌及其產(chǎn)物的毒性必須考慮（在分類(lèi)學(xué)上最好與致病菌無(wú)關(guān)）

生產(chǎn)特性要符合工藝要求第二章菌種的來(lái)源放線菌（鏈霉素四環(huán)素；紅霉素等）真菌（青霉素、頭孢等）一些產(chǎn)芽孢的細(xì)菌植物或動(dòng)物來(lái)源一、抗生素生產(chǎn)有關(guān)的微生物抗生素是次級(jí)代謝產(chǎn)物，需要生物體進(jìn)行復(fù)雜的代謝，目前發(fā)現(xiàn)的生物來(lái)源如下：第二節(jié)已工業(yè)化產(chǎn)品生產(chǎn)菌的介紹第二章菌種的來(lái)源二、氨基酸生產(chǎn)有關(guān)的微生物代謝控制發(fā)酵：用人工誘變的方法，有意識(shí)地改變微生物的代謝途徑，最大限度地積累產(chǎn)物，這種發(fā)酵形象地稱(chēng)為代謝控制發(fā)酵，最早在氨基酸發(fā)酵中得到成功應(yīng)用。50,60年代以氨基酸發(fā)酵為代表的代謝控制發(fā)酵，是發(fā)酵工業(yè)發(fā)展歷史上的一個(gè)轉(zhuǎn)折點(diǎn)：第二章菌種的來(lái)源HD:高絲氨酸脫氫酶黃色短桿菌中賴(lài)氨酸、蘇氨酸、蛋氨酸和異亮氨酸的合成調(diào)節(jié)機(jī)制

HT:高絲氨酸轉(zhuǎn)乙酰酶AK:天冬氨酸激酶第二章菌種的來(lái)源氨基酸生產(chǎn)菌的要求：代謝途徑比較清楚，代謝途徑比較簡(jiǎn)單谷氨酸發(fā)酵的菌種：其它氨基酸生產(chǎn)菌：棒桿菌屬，短桿菌屬、節(jié)桿菌屬或小桿菌屬的棒型細(xì)菌常規(guī)菌種一般也是以谷氨酸生產(chǎn)菌選育而成；工程菌，大腸桿菌，枯草芽孢桿菌第二章菌種的來(lái)源三、食品酶制劑生產(chǎn)有關(guān)的微生物開(kāi)發(fā)一個(gè)新酶，都要經(jīng)過(guò)一系列研究的毒理試驗(yàn)。關(guān)于食品用酶，美國(guó)需要得到FDA的批準(zhǔn)。目前已同意使用的僅僅少數(shù)微生物能用于生產(chǎn)食品用酶。α—淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草牙孢桿菌和地衣牙孢桿菌第二章菌種的來(lái)源三、常用的基因表達(dá)系統(tǒng)(一)原核生物：大腸桿菌(1977年Boyer)、枯草牙胞桿菌沙門(mén)氏菌

生長(zhǎng)迅速、蛋白產(chǎn)量高;

表達(dá)蛋白的純化、分離及分析快速；

外源基因的導(dǎo)入相對(duì)容易；

已建立了整套表達(dá)理論及技術(shù).第二章菌種的來(lái)源(二)真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)

酵母(既是微生物又是真核細(xì)胞)

生長(zhǎng)迅速，營(yíng)養(yǎng)要求不高，易培養(yǎng)；

安全性好；

比哺乳動(dòng)物細(xì)胞操作簡(jiǎn)單；

具有一定的修飾蛋白的能力。第二章菌種的來(lái)源

中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞（CHO細(xì)胞）表達(dá)系統(tǒng)

具有準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)錄后修飾功能；

具有產(chǎn)物胞外分越功能，便于下游產(chǎn)物分離純化；

具有重組基因的高效擴(kuò)增和表達(dá)能力；

具有貼壁生長(zhǎng)特性，也可進(jìn)行懸浮生長(zhǎng)；

CHO很少分泌自身的內(nèi)源蛋白。第二章菌種的來(lái)源微生物（包括動(dòng)、植物細(xì)胞）幾乎可以生產(chǎn)我們所需的一切產(chǎn)品，但是涉及到工業(yè)化生產(chǎn)對(duì)于某一種特定的產(chǎn)品，只有特定的微生物才具有大量表達(dá)的潛力。問(wèn)題：生產(chǎn)抗生素的微生物能不能用于生產(chǎn)氨基酸？禮來(lái)(Elililly),花了10年的時(shí)間從40萬(wàn)株微生物中，發(fā)現(xiàn)了三種有潛力的新抗生素。例：第二章菌種的來(lái)源第三節(jié)自然界中有目的微生物分離的原則一、菌種分離的一般過(guò)程土樣的采取→預(yù)處理→培養(yǎng)→菌落的選擇→產(chǎn)品的鑒定如何使樣品中所含微生物的可能性大如何在后續(xù)的操作中使這種可能性實(shí)現(xiàn)目的：高效地獲取一株高產(chǎn)目的產(chǎn)物的微生物問(wèn)題：第二章菌種的來(lái)源二、采樣時(shí)要注意的問(wèn)題

氣候、水分、空氣

來(lái)源要廣

結(jié)合產(chǎn)品的特點(diǎn)

標(biāo)簽：地點(diǎn)、時(shí)間、氣候等第二章菌種的來(lái)源富集的三種方案：

定向培養(yǎng):采用特定的有利于目的微生物富集的條件，進(jìn)行培養(yǎng)。三、目的微生物富集的一些基本方法富集的目的：讓目的微生物在種群中占優(yōu)勢(shì)，使篩選變得可能。

當(dāng)不可能采用定向培養(yǎng)時(shí)，則可設(shè)計(jì)在一個(gè)分類(lèi)學(xué)中考慮，

不能提供任何有助于篩選產(chǎn)生菌的信息，這時(shí)只能通過(guò)隨機(jī)分離的辦法第二章菌種的來(lái)源定向培養(yǎng)的方法物理方法：加熱、膜過(guò)濾等，表2-2（P31）但主要是通過(guò)培養(yǎng)的方法第二章菌種的來(lái)源定向培養(yǎng)的富集方法1、底物2、pH條件3、培養(yǎng)時(shí)間4、培養(yǎng)溫度等一切能提高目的微生物相對(duì)生長(zhǎng)速度的手段，培養(yǎng)（固體、液體；分批連續(xù)）后使目的微生物在種群中占優(yōu)勢(shì)。第二章菌種的來(lái)源四、菌落的選出

從產(chǎn)物角度出發(fā)在培養(yǎng)時(shí)以產(chǎn)物的形成有目的的設(shè)計(jì)培養(yǎng)基利用簡(jiǎn)單、快速的鑒定方法，如抗生素（P35）

從形態(tài)的角度

菌落的外觀形態(tài)，是微生物的一個(gè)重要表征。如多糖產(chǎn)生菌在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基上生長(zhǎng)，從具有粘液性的菌落外觀上就可以初步識(shí)別。第二章菌種的來(lái)源實(shí)例：堿性纖維素酶產(chǎn)生菌的篩選（國(guó)家七五攻關(guān)項(xiàng)目）采樣（造紙廠）→80度30分鐘處理文獻(xiàn):產(chǎn)生菌為中性牙孢桿菌，嗜堿牙孢桿菌、放線菌及霉菌0.0075%曲利本藍(lán)＋1%CMC（羧甲基纖維素），pH10.5培養(yǎng)3～4天，選擇有凹陷圈的菌落從285個(gè)土樣中獲得62株26株為組成型36株為誘導(dǎo)型↓第二章菌種的來(lái)源例：醛肟水解酶的篩選

--Journalofbiotechnology94(2002),65-72培養(yǎng)基中含0.05%ofZ-PAOx

每隔2-3天移去一半培養(yǎng)物，補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)基不斷分析樣品，2-3個(gè)月后Z-PAOx降低后，稀釋分離條菌落第二章菌種的來(lái)源五、目的微生物富集方法的研究進(jìn)展

分子生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)手段，在微生物鑒別及特定目標(biāo)產(chǎn)物的篩選方面發(fā)揮了著越來(lái)越重要的作用。如:16SRNA同源性分析，基因序列分析及DNA/DNA雜交技術(shù)等

目前土壤中能夠培養(yǎng)的微生物不到總數(shù)的1%。微生物的多樣性及資源的開(kāi)發(fā)仍然是今后若干年的研究重點(diǎn)。

2002,陳文新（科學(xué)院院士）

Incontrasttothistraditionalapproach,modernmolecularbiologytechniquesallowforDNAlibraryexpressionscreening,whichalsoenablesaccesstoenzymesof`nonculturable'organisms.Bythisstrategy,forinstance,thecompanyDiversa(SanDiego,CA,USA)identised120uniqueesterases/lipasesfromonly16%ofthetotalDNAobtainedfromanalkalinesoilsample.FEMSMicrobiologyReviews26(2002)73～81第二章菌種的來(lái)源第四節(jié)菌株選育、分子改造目的

提高生產(chǎn)能力

提高產(chǎn)品質(zhì)量

開(kāi)發(fā)新產(chǎn)品

解決生產(chǎn)實(shí)際問(wèn)題

防止菌種退化第二章菌種的來(lái)源方法基因突變：自然選育、誘變育種基因重組：雜交、原生質(zhì)體融合、基因工程基因的直接進(jìn)化：點(diǎn)突變、易錯(cuò)PCR、同序法DNAShuffling等第二章菌種的來(lái)源自然狀態(tài)下，堿基對(duì)發(fā)生自然突變的機(jī)率為10-8～10-9自然突變有兩種情況：一種是我們生產(chǎn)上所不希望看到的，表現(xiàn)為菌株的衰退和生產(chǎn)質(zhì)量的下降，這種突變成為負(fù)突變。另一種是我們生產(chǎn)上希望看到的，對(duì)生產(chǎn)有利，這種突變成為正突變。一、自然選育第二章菌種的來(lái)源自然選育在工業(yè)生產(chǎn)上的意義自然選育雖然突變率很低，但卻是工廠保證穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)的重要措施。回復(fù)突變：高產(chǎn)菌株在傳代的過(guò)程中，由于自然突變導(dǎo)致高產(chǎn)性狀的丟失，生產(chǎn)性能下降，這種情況我們稱(chēng)為回復(fù)突變問(wèn)題：高產(chǎn)菌株是正突變高，還是負(fù)突變高？第二章菌種的來(lái)源自然選育操作步驟：一般習(xí)慣上將自然選育稱(chēng)為菌種的分離純化。單細(xì)胞(孢子)懸液的制備平板分離挑選單菌落(注意形態(tài)的觀察)發(fā)酵試驗(yàn)第二章菌種的來(lái)源二、誘變育種用各種物理、化學(xué)的因素人工誘發(fā)基因突變進(jìn)行的篩選，稱(chēng)為誘變育種誘變劑：能夠提高生物體突變頻率的物質(zhì)稱(chēng)為誘變劑誘變劑物理在：紫外，快中子化學(xué)：硫酸二乙酯，亞硝基胍{第二章菌種的來(lái)源（二）、誘變劑處理過(guò)程中幾個(gè)有關(guān)的問(wèn)題

化學(xué)誘變劑使用過(guò)程的安全性誘變劑量的選擇誘變劑的選擇出發(fā)菌株的選擇（一）、誘變劑的作用原理（略）壓硝酸：0.07MNa2HPO4亞硝基胍：1MNaOH第二章菌種的來(lái)源（三）、誘變育種的一般步驟(p83)（四）、篩選的方法

隨機(jī)篩選

形態(tài)

理性化篩選從產(chǎn)物形成的生理生化途徑著手，進(jìn)行有的放矢的篩選。如結(jié)構(gòu)類(lèi)似物抗性、營(yíng)養(yǎng)缺陷型等，篩選而產(chǎn)生的這些特性，稱(chēng)為遺傳標(biāo)記。結(jié)構(gòu)類(lèi)似物：在化學(xué)和空間結(jié)構(gòu)上和代謝的中間物（終產(chǎn)物）相似，因而在代謝調(diào)節(jié)方面可以代替代謝中間物（終產(chǎn)物）的功能，但細(xì)胞不能以其作為自身的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。第二章菌種的來(lái)源HD:高絲氨酸脫氫酶黃色短桿菌中賴(lài)氨酸的合成調(diào)節(jié)機(jī)制

HT:高絲氨酸轉(zhuǎn)乙酰酶AK:天冬氨酸激酶結(jié)構(gòu)類(lèi)似物抗性：Lys的類(lèi)似物AEC,Thr的類(lèi)似物AHV營(yíng)養(yǎng)缺陷型：如Thr缺陷型第二章菌種的來(lái)源黃色短桿菌F9-50的誘變譜系BervibacteriumflavumAs1.495(leu-)lys.HCl2.1g/lF6-16(leu-,Thr-)20.8g/lF9-50(leu-,Thr-,AECr)33.5g/l第二章菌種的來(lái)源三、基因的直接進(jìn)化(directedevolution)

突變基因突變庫(kù)的建立篩選基因突變庫(kù)的篩選基因復(fù)制與遺傳步驟：

在分子水平上，對(duì)目標(biāo)基因直接處理，然后通過(guò)高通量的篩選方法，提高目標(biāo)蛋白的性能。第二章菌種的來(lái)源主要應(yīng)用：酶學(xué)性能的提高:pH

溫度

有機(jī)溶劑生理環(huán)境→工業(yè)催化環(huán)境

底物專(zhuān)一性第二章菌種的來(lái)源脂酶拆分2-甲基癸酸硝基苯酯例：PLAPLA光學(xué)拆分選擇性(%)231577581905次錯(cuò)位PCR2次定點(diǎn)突變Reetz(1997)Liebeton(2000)第二章菌種的來(lái)源第二章菌種的來(lái)源定點(diǎn)突變第二章菌種的來(lái)源錯(cuò)位PCR第二章菌種的來(lái)源DNAShuffling:指DNA分子的體外重組，是基因在分子水平上進(jìn)行有性重組(SexualRecombination)。第二章菌種的來(lái)源XXXX

XXXX

XXX

XXXX

XXXXXXX

XXX

XXXX

XXXXXXXX

XXX

XXXX

XXXXXXX

XXXXXXXXXXXXXXXX

FragmentReassembleSelectbestwithDNAseIfragmentsrecombinantsRepeatformultiplecyclesDNAshuffling第二章菌種的來(lái)源項(xiàng)目進(jìn)化速度進(jìn)化對(duì)象進(jìn)化周期影響對(duì)象