第二十一章免疫學方法技術(shù)

第21章免疫學方法技術(shù)第一節(jié)

基于Ag-Ab反應(yīng)的檢測方法抗原-抗體反應(yīng)：指抗原與相應(yīng)抗體在體內(nèi)、外發(fā)生高度特異性結(jié)合反應(yīng)。由于實驗所用的抗體存在于血清中，故又稱血清學反應(yīng)（serologicalreaction)用于：抗原（微生物、細胞、激素、細胞因子、腫瘤標志物等）、抗體的檢測。特異性抗原抗體反應(yīng)的可見性適當?shù)谋壤蜐舛瓤赡嫘钥乖贵w反應(yīng)的特點應(yīng)用1、利用已知抗原檢測未知抗體（1）檢測病原微生物的相應(yīng)抗體以輔助診斷疾?。簜?、流行性乙型腦炎、AIDS病等。（2）檢測自身抗體—診斷自身免疫?。篠LE、類風濕性關(guān)節(jié)炎等。2、利用已知抗體檢測未知抗原（1）鑒定病原菌：診斷疾?。?）檢測腫瘤相關(guān)抗原：檢測甲胎蛋白以診斷肝癌（3）檢測血型抗原、HLA抗原：鑒定血型，親子鑒定（4）檢測藥物半抗原：確認運動員是否服用興奮劑沉淀反應(yīng)補體參與反應(yīng)中和反應(yīng)2341免疫標記凝集反應(yīng)2435Ag-Ab

反應(yīng)的基本類型一、凝集反應(yīng)（agglutinationreaction）概念：細菌、細胞等顆粒性抗原或包被有抗原的顆粒狀物質(zhì)（如聚苯乙烯乳膠等）與相應(yīng)的抗體結(jié)合，出現(xiàn)肉眼可見的凝集團，稱為凝集反應(yīng)。1、直接凝集：將細菌或紅細胞與相應(yīng)的抗體直接反應(yīng)，出現(xiàn)細菌凝集或紅細胞凝集現(xiàn)象。又分為玻片法和試管法。2、間接凝集：將可溶性抗原包被在紅細胞或乳膠顆粒表面，與相應(yīng)抗體反應(yīng)出現(xiàn)顆粒凝集現(xiàn)象。細菌的鑒定和血型的檢查檢測病原體可溶性抗原，病原體感染后產(chǎn)生的抗體二、沉淀反應(yīng)（precipitation）概念：可溶性抗原（免疫球蛋白、細胞裂解物、組織浸液等）與相應(yīng)抗體結(jié)合，形成不溶性免疫復(fù)合物，出現(xiàn)不透明的沉淀物。在液體中進行出現(xiàn)絮狀沉淀，在半固體瓊脂凝膠上進行，形成白色的沉淀。1．單向免疫擴散(singleimmunodiffusion)2．雙向免疫擴散(doubleimmunodiffusion)3．免疫電泳(immunoelectrophoresis)4．免疫比濁(immunonephelometry)

1、單向免疫擴散（singleimmunodiffusion）：可溶性抗原在含相應(yīng)抗體的瓊脂凝膠中進行的擴散，為一種半定量試驗。環(huán)的直徑與抗原含量成正相關(guān)2、雙向免疫擴散（doule

immunodiffusion）：抗原與抗體在瓊脂板中相互擴散而形成一定類型的沉淀線的方法。常用于抗原或抗體的定性檢測、組成和兩種抗原相關(guān)性分析。3、免疫電泳（immunoelectrophoresis）常用于血清蛋白種類分析，以觀察Ig的異常增多或缺失。

1）簡易免疫電泳先將抗原樣品在瓊脂中進行電泳分離，可將蛋白質(zhì)抗原分子分成不同的區(qū)帶，然后將抗血清加入瓊脂板橫槽中，使二者進行雙向擴散，當比例合適時即形成特異性的沉淀線，2）對流免疫電泳(counterimmunoelectrophoresis,CIEP)是將雙向免疫擴散與電泳相結(jié)合的一種技術(shù)3）火箭免疫電泳(rocketimmunoelectrophoresis)，抗原在電場下通過含有一定量抗體的瓊脂凝膠，并于抗體發(fā)生反應(yīng)，形成沉淀帶?？啥糠治?。4、免疫比濁在一定量抗體中分別加入遞增量的抗原，經(jīng)一定時間形成免疫復(fù)合物，液體混濁。用濁度計測量反應(yīng)體系的濁度，可繪制標準曲線并依據(jù)濁度推算樣品中抗原含量。三、補體參與的反應(yīng)溶菌反應(yīng)細菌與相應(yīng)Ab結(jié)合，可激活補體，使細菌溶解。主要發(fā)生于霍亂弧菌等G+菌，可用于細菌鑒定。溶血反應(yīng)紅細胞與相應(yīng)抗體結(jié)合，通過激活補體使紅細胞溶解，可作為補體結(jié)合試驗的指示系統(tǒng)。補體結(jié)合反應(yīng)是一種在補體參與的條件下，以綿羊紅細胞和溶血素作為指示系統(tǒng)來測定有無相應(yīng)抗原或抗體的血清學試驗。第二節(jié)免疫標記技術(shù)免疫標記技術(shù)（Immunolabellingtechnique）概念：用熒光素、同位素或酶等示蹤物質(zhì)標記抗體（或抗原）進行抗原-抗體反應(yīng)。標記物質(zhì)未改變抗原抗體的免疫學特性，同時標記物極大的提高了反應(yīng)的靈敏度，可以對微量物質(zhì)進行定量、定性或定位檢測。免疫標記技術(shù)主要有三種基本類型：免疫熒光技術(shù)、免疫酶技術(shù)和同位素標記技術(shù)。熒光素：異硫氰酸熒光素（黃綠色熒光）、藻紅蛋白、羅丹明（紅色熒光）放射性同位素：125I、131I酶：辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶免疫熒光檢測法（IFA）放射免疫檢測法（RIA）酶免疫檢測法（EIA）1．抗體制備。多克隆抗體單克隆抗體，2．標記物與標記方法。放射性同位素、酶、熒光分子、化學和生物發(fā)光系統(tǒng)。免疫分析基本環(huán)節(jié)3．分析方式設(shè)計：

非競爭方式、競爭方式；

直接法、間接法；

標記抗原、標記抗體；

均相、非均相

4.信號檢測。

與相應(yīng)的標記物對應(yīng)。主要為分光光度法、

熒光光度法、化學發(fā)光檢測法。

一、免疫熒光法

(immunofluorescence,IF)概念：熒光素標記的抗體（抗原）與組織或細胞中的相應(yīng)抗原（抗體）結(jié)合，借助于熒光顯微鏡或流式細胞儀對抗原（抗體）進行鑒定或定位。（1）直接熒光法：熒光素直接標記抗體，對標本進行檢測。該法優(yōu)點是特異性高，缺點是檢查任一抗原均須制備相應(yīng)熒光抗體。（2）間接熒光法：用一抗與標本中抗原結(jié)合，再用熒光素標記的二抗進行檢測。該法優(yōu)點是敏感度比直接法高，制備一種熒光素標記的二抗即可用于多種抗原的檢測,但非特異性反應(yīng)亦增強。免疫熒光法分類免疫熒光法圖示MousekidneysectionLaminin-green-fluorescentQdot?565IgG

CD31-red-fluorescentQdot?655IgG

Nuclei-blue-fluorescentHoechst33342ControlTSLPTSLP-AlexaFluor?488

Nuclei-propidiumiodide

HASMC

流式細胞術(shù)（FlowCytometry,FCM)概念：FCM是將免疫熒光技術(shù)應(yīng)用于流式細胞儀，對單個細胞的表面標志（抗原或受體）進行快速、精確的分析和自動檢測，并將不同類型的細胞分選收集。FCM還可對同一細胞的多種參數(shù)（如DNA、RNA、蛋白質(zhì)和細胞體積等）進行多信息分析，為當代生命科學研究領(lǐng)域中廣泛使用的一項新技術(shù)。流式細胞儀的細胞分析原理待測細胞被制成單細胞懸液，經(jīng)特異性熒光染料染色后加入樣品管中，在氣體壓力推動下進入流動室。流動室內(nèi)充滿鞘液，在鞘液的約束下，細胞排成單列出流動室噴嘴口，并被鞘液包繞形成細胞液柱，進入流動室。被熒光染料染色的細胞受到強烈的激光照時后發(fā)出熒光，被熒光光電倍增管接收，實現(xiàn)了細胞的定量分析。再通過流束形成含有細胞的帶電液滴而實現(xiàn)了細胞的分選。流式細胞儀工作原理二、酶免疫測定

(enzymeimmunoassay,EIA)概念：是用酶標記的抗體進行的抗原抗體反應(yīng)。將抗原-抗體反應(yīng)的特異性與酶催化作用的高效性相結(jié)合，借助酶作用于底物的顯色反應(yīng)判定結(jié)果。常用的酶為：辣根過氧化物酶（HRP）、堿性磷酸酯酶（AP）酶底物顯色反應(yīng)測定波長辣根過氧化物酶鄰苯二胺（OPD）

3、3‘二氨基聯(lián)苯胺（DAB）

氨基水楊酸

鄰聯(lián)苯甲胺

2,2‘-連胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)銨鹽橘紅色

黃色

棕色

蘭色

藍綠色492460449

425

642

堿性磷酸酯酶4-硝基酚磷酸鹽(PNP)

萘酚-AS-Mx磷酸鹽+重氮鹽黃色

紅色400

500葡萄糖氧化酶ABTS+HRP+葡萄糖

葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑蘭黃色

深藍色405420β-Ｄ-半乳糖苷酶甲基傘酮基半乳糖苷(4MuG)

硝基酚半乳糖苷(ONPG)熒光

黃色360,450

420常用的方法如下：（1）酶聯(lián)免疫吸附試驗測定可溶性抗原或抗體（2）免疫細胞或組織化學測定組織中或細胞表面的抗原1.免疫細胞或免疫組化技術(shù)概念：應(yīng)用酶標記的抗體與組織或細胞抗原發(fā)生反應(yīng)，結(jié)合形態(tài)學觀察，對組織或細胞表面抗原進行定性、定量、定位。ICCIHC2.酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA)

基本原理：是將過量抗體（抗原）包被于載體（聚苯乙烯微量反應(yīng)板）上，通過抗原抗體反應(yīng)使酶標記抗體（抗原）也結(jié)合在載體上，經(jīng)洗滌去除游離的酶標記抗體（抗原）后，加入底物顯色，定性或定量分析有色產(chǎn)物確定待測物的存在與含量的檢測技術(shù)。是酶免疫測定中應(yīng)用最廣的技術(shù)，用于測定可溶性抗原或抗體。ELISA試劑盒1.雙抗體夾心法用于檢測特異性抗原。方法：將已知抗體吸附于固相載體．加入待檢標本(含相應(yīng)抗原)與之結(jié)合。溫育后洗滌，加入酶標抗體和底物進行測定。該試驗所用的包被抗體與酶標抗體應(yīng)分別針對不同抗原決定基，或其中之一用多克隆抗體，且相互間應(yīng)無交叉反應(yīng)。2.間接法用于檢測特異性抗體。方法：將已知抗原吸附于固相載體，加入待檢標本(含相應(yīng)抗體)與之結(jié)合。洗滌后，加入酶標抗球蛋白抗體(酶標抗抗體)和底物進行測定?？乖豢苟股锼豀RP親合素＋3.競爭法用于抗原和半抗原（抗原決定簇少）的定量測定，也可用于測定抗體。方法：以測定抗原為例．將持異性抗體吸附于固相載體；加入待測抗原和一定量的酶標已知抗原，使二者競爭與固相抗體結(jié)合；經(jīng)過洗滌分離，最后結(jié)合于固相的酶標抗原與待測抗原含量呈負相關(guān)。

ELISA反應(yīng)過程動畫演示A.用已知抗原檢測分泌性特異性抗體的B細胞B.用抗細胞因子抗體檢測細胞分泌的細胞因子

4.酶聯(lián)免疫斑點試驗ELlSA方法的技術(shù)要點I與固相載體結(jié)合的抗原或抗體稱為免疫吸附劑。將抗原或抗體固相化的過程稱為包被(coating)，由于載體不同，包被的方法也不同。使用聚苯乙烯制品為載體一般多采用物理吸附法。除載體的理化性質(zhì)外，受緩沖液的離子強度、pH值、包被時的溫度和時間等多種因素的影響。用抗原或抗體包被后。固相載體表面往往尚殘留少量未飽和的吸附位點，產(chǎn)生非特異吸附，導(dǎo)致本底偏高。為此．常用1％—5％BSA，或含5％—20％小牛血清的PH9.6碳酸鹽緩沖液注滿凹孔，37℃作用1h，可以消除此種干擾。這一過程稱為封閉(blocking)。固相載體和免疫吸附劑的制備

ELlSA方法的技術(shù)要點II抗原和抗體用于制備酶標記物和包被固相載體的抗原要求純度高，抗原性完整；抗體需特異、效價高、親和力強，并具有較高的比活性。如將抗體IgG用木瓜蛋白酶水解為Fab片段，再與酶連接，可以減少非特異性吸附，檢測效果更佳。McAb的應(yīng)用，進一步提高ELISA法的特異性和靈敏度。使用針對抗原分子中不同決定簇的兩種McAb分別作為固相抗體和酶標抗體用于雙位點夾心法，簡化了操作程序。通常采用特異性較高的McAb作為固相包被抗體，與酶標記的多克隆抗體相結(jié)合進行檢測，結(jié)果更為滿意。在ELISA法中，用于標記抗體或抗原的酶與免疫酶組織化學技術(shù)基本上相同。但所用底物被酶裂解后，應(yīng)能生成可溶性有色產(chǎn)物，適合用分光光度計(酶標儀)測量光密度值，籍以定量測定樣品中待撿抗原或抗體的含量。ELlSA方法的技術(shù)要點III常用的酶及其底物

辣根過氧化物酶 (HRP)

OPD,TMB堿性磷酸酶 (AP)

PNP半乳糖苷酶 (Gal)

NPG葡萄糖氧化酶 (GOP) PAP三、放射免疫測定法

(Radioimmunoassay,RIA)概念：是用放射性核素標記抗原進行的免疫學檢測技術(shù)。它將放射性核素顯示的高靈敏性和抗原抗體反應(yīng)的特異性結(jié)合，使檢測的敏感性達pg水平。常用于標記的放射性核素有I125和I131。常用于胰島素、生長激素、藥物等微量物質(zhì)的測定。結(jié)合相游離相基本原理：RIA是標記抗原和未標記抗原對有限量抗體的競爭性結(jié)合。

Ag*AbAg

標記抗原特異性抗體待測抗原(Ag*-Ab)+(Ag-Ab)抗原抗體復(fù)合物分離Ag*-Ab

和游離Ag*從標準曲線上讀知含量測定Ag*-Ab和/或游離Ag*放射性示意圖RIA法原理及標準曲線

7550301001101001000未標記抗原濃度（ng/ml)結(jié)合/未結(jié)合的放射活性（%）四、化學發(fā)光免疫分析概念：將發(fā)光物質(zhì)（如吖啶酯、魯米諾等）標記抗原或抗體，發(fā)光物質(zhì)在反應(yīng)劑（如過氧化陰離子）激發(fā)下發(fā)射光子，通過自動發(fā)光分析儀測定光子產(chǎn)量，可反映待檢樣品中抗體或抗原含量。該法靈敏度高，常用于檢測血清超微量活性物質(zhì)（甲狀腺素等激素）。靈敏，無污染，可用于替代放射免疫。五、免疫膠體金標記技術(shù)(immunogoldlabelingtechnique)

概念：是以膠體金作為示蹤標記物，應(yīng)用于抗原抗體反應(yīng)的一種免疫標記技術(shù)；膠體金是由氯金酸在還原劑如白磷、抗壞血酸、枸櫞酸鈉和鞣酸等作用下，聚合成特定大小的金顆粒，并由于靜電作用成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，故稱為膠體金。電鏡：高電子密度試紙：膠體金的光散射性與溶膠顆粒的大小密切相關(guān)，顆粒大小發(fā)生變化，光散射也隨之發(fā)生變異，產(chǎn)生肉眼可見的顯著的顏色變化。膠體金是氯金酸(HAuCl4)的水溶膠顆粒，具有高電子密度，在電鏡中顆粒致密，易于辨認，定位比酶反應(yīng)物精確。膠體金標記舉例：膠體金試紙檢測尿HCG早孕尿試紙條：兩條杠，檢測迅速，靈敏度高1）干燥試紙條膠體金免疫快速檢測HCG原理2）加樣1.雙抗體夾心法-大分子抗原3）反應(yīng)和遷徙4）陽性結(jié)果：兩條紅線5）陰性結(jié)果：一條紅線膠體金免疫試紙構(gòu)造六、免疫印跡技術(shù)免疫印跡(immunoblotting)又稱蛋白質(zhì)印跡(Westernblotting)，是一種借助特異性抗體鑒定抗原的有效方法。凝膠電泳和固相免疫測定技術(shù)將含有目標蛋白(抗原)的樣品首先用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS)或非變性電泳(Native)等分離后，通過轉(zhuǎn)移電泳原位轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜或其它膜的表面，然后將膜表面的蛋白質(zhì)再用抗原抗體反應(yīng)進行特異性檢測。Westernblotmethod包括5個步驟：1)固定：蛋白質(zhì)進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)并從膠上轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。2)封閉：保持膜上沒有特殊抗體結(jié)合的場所，使場所處于飽和狀態(tài)，用以保護特異性抗體結(jié)合到膜上,并與蛋白質(zhì)反應(yīng)。3)初級抗體(第一抗體)是特異性的。4)第二抗體或配體試劑對于初級抗體是特異性結(jié)合并作為指示物。5)適當保溫后的酶標記蛋白質(zhì)區(qū)帶，產(chǎn)生可見的、不溶解狀態(tài)的顏色反應(yīng)。第三節(jié)

檢測淋巴細胞及其功能的體外試驗單個核細胞的分離

淋巴細胞亞群的分離T細胞功能檢測B細胞功能檢測種類免疫細胞及其亞類分離、鑒定和檢測淋巴細胞功能測定

T細胞的鑒定和檢測B細胞的鑒定和檢測一、免疫細胞及亞類分離、鑒定和檢測（一）外周血單個核細胞的分離葡聚糖-泛影葡胺（又稱淋巴細胞分離液）：密度梯度離心法淋巴細胞分離液血小板淋巴細胞分離液淋巴細胞和單核細胞紅細胞和粒細胞1.0301.0751.075-1.0901.090-1.092各細胞與分離液的密度進一步純化淋巴細胞，鋪于培養(yǎng)皿上，由于單核細胞易與玻璃黏附而滯留于平皿表面，未吸附的細胞即主要是淋巴細胞。（二）淋巴細胞亞群的分離尼龍棉分離法E花結(jié)分離法洗淘法流式細胞術(shù)混合單個核細胞懸液在通過尼龍毛柱時，B細胞、漿細胞、單核細胞被選擇性粘附于尼龍毛上，多數(shù)T細胞則通過尼龍毛柱人T細胞與SRBC結(jié)合形成E花結(jié)，經(jīng)密度梯度離心，花結(jié)形成細胞沉于管底；用低滲裂解花結(jié)中的SRBC即獲得T細胞。將已知抗特定標志的抗體包被培養(yǎng)板，加入淋巴細胞懸液，相應(yīng)的細胞即結(jié)合于培養(yǎng)板表面，與懸液中的其他細胞分離。借助熒光活化細胞分類儀對細胞快速鑒定和分類、并進行多參數(shù)定量測定和綜合分析的技術(shù)。磁分離技術(shù)將特異性抗體與磁性微粒交聯(lián)，與表達相應(yīng)膜抗原的細胞結(jié)合，應(yīng)用強磁場分離所吸附的細胞，從而對特定的細胞進行分選1、E玫瑰花環(huán)形成試驗（三）T細胞及其亞群的鑒定和檢測可用于T細胞的鑒定和檢測。綿羊紅細胞+人外周血淋巴細胞

4℃1~2h花環(huán)樣細胞集團正常人外周血中E玫瑰花環(huán)形成細胞占淋巴細胞總數(shù)的60~80%。T細胞CD2/E受體SRBC/綿羊紅細胞（三）T細胞及其亞群的鑒定和檢測2、T細胞單克隆抗體對T細胞及其亞群的鑒定和檢測所用的Ab主要有：CD3McAb、CD4McAb和CD8McAb。方法：免疫熒光間接法。外周血淋巴細胞+分別用小鼠抗人CD3、CD4、CD8McAb（第一Ab）+熒光素標記的兔抗小鼠IgG抗體（第二Ab）→熒光顯微鏡觀察。小鼠抗人McAb熒光標記的兔抗小鼠IgG抗體（三）T細胞及其亞群的鑒定和檢測2、T細胞單克隆抗體對T細胞及其亞群的鑒定和檢測結(jié)果：（1）被CD3McAb著染熒光的細胞是總T細胞。包括：TH、TH1、TH2、TC、TS細胞。（2）被CD4McAb著染熒光的細胞是TH、TH1、TH2

（3）被CD8McAb著染熒光的細胞是TC、TS細胞。計數(shù)：

100～200個淋巴細胞，計算出染陽性細胞百分率：

CD3T細胞占65～80%。CD4T細胞占50~60%。

CD8T細胞占20~30%，

CD4T細胞與CD8T細胞比值約2：1。

SmIgM/D是B細胞表面特有的標志。通過對該種標志的檢測，可對B細胞進行鑒定和檢測。方法：免疫熒光直接法。熒光素標記的兔抗人IgM/D抗體+外周血淋巴細胞→直接免疫熒光染色。著染熒光的細胞B細胞。占淋巴細胞總數(shù)的8~12%。（四）B細胞鑒定和檢測兔抗人IgM/D抗體二、淋巴細胞功能測定1、淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗2、細胞毒性試驗（LMC-T）T細胞功能檢測1、溶血空斑試驗2、定量溶血分光光度測定法B細胞功能檢測1、淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗原理：T細胞特異性Ag或有絲分裂原淋巴母細胞（體積更大、代謝旺盛）根據(jù)其轉(zhuǎn)化程度和轉(zhuǎn)化率，測定機體細胞免疫功能狀態(tài)（1）非特異性轉(zhuǎn)化試驗（2）特異性轉(zhuǎn)化試驗（一）T細胞功能檢測

T細胞

植物血凝素（PHA）或刀豆蛋白A（ConA）淋巴母細胞。

（有絲分裂原）正常人T細胞轉(zhuǎn)化率約為70%。（1）非特異性轉(zhuǎn)化試驗