第八章色譜分離技術(shù)

第八章

色譜分離技術(shù)

第一節(jié)色譜分離技術(shù)概要色譜技術(shù)的起源:葉綠素的石油醚溶液通過碳酸鈣管柱,并繼續(xù)以石油醚淋洗,由于碳酸鈣對葉綠素中各種色素的吸附能力不同,色素被逐漸分離,在管柱中出現(xiàn)了不同顏色的譜帶。色譜系統(tǒng)由固相定相、流動相、泵系統(tǒng)和在線檢測系統(tǒng)組成。特點是分離效率高，能分離性質(zhì)極性類似的物質(zhì)，能用于少量物質(zhì)的分析鑒定，也可用于大量物質(zhì)的分離純化制備。一、色譜技術(shù)的基本概念利用物質(zhì)在溶解度、吸附能力、立體化學特性、分子大小、帶電情況、離子交換、親和力的大小及特異的生物學反應等方面的差異，使其在流動相與固定相之間的分配系數(shù)不同，達到彼此分離的目的。圖例P175加入洗脫劑使各組分分層的操作稱為展開。洗脫時從柱中流出的液體稱為洗脫液。展開后各組分的分布情況稱為色譜圖。將樣品加到柱上的操作稱為上樣或加樣。（一）固定相可以是固體物質(zhì)，也可以是液體物質(zhì)組成：空間結(jié)構(gòu)部分，決定固定相尺寸與孔隙率；化學和生物大分子功能性成分，決定介質(zhì)與目標溶質(zhì)特異性相互作用的能力。（二）流動相推動固定相上待分離的物質(zhì)朝著一個方向移動的液體、氣體或超臨界流體。柱色譜中稱為洗脫劑，薄層色譜中稱為展開劑。（三）分配系數(shù)定義：在一定條件下，某種組分在固定相和流動相中含量（濃度）的比值。它是色譜中分離純化物質(zhì)的主要依據(jù)。待測組分在固定相和流動相之間發(fā)生的吸附，脫附或溶解，揮發(fā)的過程叫做分配過程。不同物質(zhì)的分配系數(shù)不同，分配系數(shù)的差異程度是決定幾種物質(zhì)采用色譜方法能否分離的先決條件。差異越大，分離效果越理相。（四）阻滯因素阻滯因素又稱遷移率，指在一定條件下，在相同的時間內(nèi)某一組分在固定相移動的距離與流動相本身移動的距離之比值。相對遷移率：指在一定條件下，在相同時間內(nèi)，某一組分在固定相中移動的距離與某一標準物質(zhì)在固定相中移動的距離之比值。（五）分辨率分辨率也稱分離度，一般指相鄰兩峰分開程度。用Rs表示，Rs越大，兩組分分離得越好。當Rs=1時，兩組分具有較好的分離，分離純度為98%。當Rs=1.5時，兩組分基本完全分開，每種組分純可達99.8%。（六）解離常數(shù)Kp和分離因素

(P178圖8-10)用解離常數(shù)討論分子間的相互作用。分離因素

定義為某一瞬間被吸附的溶質(zhì)占總量的分數(shù)。對于一個有效的柱色譜分離，通常要求≥0.8，Kp一般要求≤0.1mol/l。（七）色帶變形和“拖尾”現(xiàn)象原因：固定相在色譜柱中橫向填充的不均勻，在固定相顆粒粗的地方，溶劑和溶質(zhì)流速快，就會形成斜歪、不規(guī)則的色帶；由于平衡關系偏離線性所引起的，當柱中目標物質(zhì)的色帶移動時，分子由于縱向擴散或不均勻流動超出了色帶前緣，相對于后面的主色帶被阻滯，結(jié)果在主色帶前緣產(chǎn)生一個自動削尖效應。方法：使用細長的色譜柱；使用不同梯度的緩沖液；選擇合適的展層劑。（八）正相色譜與反相色譜正相色譜是指固定相的極性高于流動相的極性。非極性分子或極性小的分子比極性大的分子移動速度快，先從柱中流出來。反相色譜是指固定相的極性低于流動相的極性，在這種色譜過程中，極性大的分子比極性小的分子移動速度快而先從柱中流出。分離純化極性大的分子，采用正相色譜；分離純化極性小的有機分子，采用反相色譜。（九）操作容量操作容量是指在一定條件下，某種組分與固定相反應達到平衡時，存在于固定相上的飽和容量。數(shù)值越大，固定相對該物質(zhì)的親和力越強。（十）洗脫體積使溶質(zhì)從柱中流出時所通過的流動相的體積，稱為洗脫體積。不同的溶質(zhì)有不同的洗脫體積（十一）色譜法的塔板理論可以給出在不同瞬間，溶質(zhì)在柱中的分布和各組分的分離程度與柱高之間的關系。要點：柱子可以分成多層，每一層為一理論塔板，且有一定高度；在色譜柱中，物質(zhì)只有橫向擴散，無縱向擴散，兩相瞬間達到分配平衡；體系中其他物質(zhì)的存在不影響待分離物質(zhì)的分配。（十二）檢測方法吸光度、化學發(fā)光、電化學、電導率、熒光、紅外吸收光譜、折射率、質(zhì)譜等。二、色譜法的分類（一）根據(jù)固定相基質(zhì)的形式紙色譜：以濾紙作為基質(zhì)薄層色譜：將基質(zhì)在玻璃或塑料等光滑表面鋪成一薄層，在薄層上進行色譜過程。柱色譜：將基質(zhì)填裝在管中形成柱形，在柱中進行色譜分離。（二）根據(jù)兩相所處的狀態(tài)流動相為氣體的稱為氣相色譜流動相為液體的稱為液相色譜（三）根據(jù)分離原理的不同吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜、凝膠過濾色譜、親和色譜等。1、吸附色譜以吸附劑為固定相，根據(jù)待分離物與吸附劑之間吸附力不同而達到分離的目的。2、分配色譜在一個有兩相同時存在的溶劑系統(tǒng)中，不同物質(zhì)的分配系數(shù)不同而達到分離的目的。相當于連續(xù)性的溶劑抽提方法。3、離子交換色譜以離子交換劑為固定相，根據(jù)物質(zhì)的帶電性質(zhì)不同而進行分離的技術(shù)。固定相為離子交換劑，流動相為電解質(zhì)溶液。4、凝膠過濾色譜以具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠顆粒作為固定相，根據(jù)物質(zhì)的分子大小進行分離的技術(shù)。分子篩原理。小分子物質(zhì)易進入凝膠顆粒內(nèi)部，流出柱子時間長，大分子不易進入凝膠內(nèi)部，先流出色譜柱。5、親和色譜根據(jù)生物大分子和配體之間的特異性親和力，將某種配體連接在載體上作為固定相，而對能與配體特異性結(jié)合的生物大分子進行分離的一種技術(shù)。親和色譜是分離生物大分子最為有效的色譜技術(shù)。三、色譜系統(tǒng)的操作方法（一）裝柱P183裝柱是成功得到分離物質(zhì)最關鍵的一步。一般實驗室采用重力沉降法和加壓法進行裝柱。（二）平衡色譜柱填裝好后，必須用起始緩沖液平衡到與之pH和離子強度相同時才可使用。裝好的柱子要求均勻，無紋路，無氣泡，柱頂部平整。用藍色葡聚糖-2000在恒壓下走柱，若色帶均勻下降，則柱填裝均勻。（三）上樣量和上樣體積上樣體積越小，量越少，分離效果越好。對于分析型色譜，加樣量一般不超過柱床體積的0.5%-1%，制備型色譜加樣量一般不超過柱床體積的1%-3%。分子篩加樣量要遠小于離子交換色譜。（四）洗脫改變洗脫液的pH,使大分子的電荷減少，從被吸附狀態(tài)變?yōu)榻怆x狀態(tài)。改變離子強度，增加洗脫液的離子強度，將被分離物從交換劑上換下來。同時改變pH及離子強度。洗脫方式有三種：一步洗脫、階段洗脫、梯度洗脫梯度洗脫洗脫液中含有兩種或以上不同極性的溶劑，在分離過程中按一定的程序連續(xù)改變洗脫液中溶劑的配比和極性，通過洗脫液中極性的變化來改變被分離組分的分離因素，以提高分離效果。它可使分離時間縮短，分辨能力增加，提高最小檢出量和精度。與氣相色譜是的程序升溫作用相似。（五）流速及控制洗脫液的流速會影響色譜的分辨率，在整個分離過程中，要保持一個穩(wěn)定的流速。此流速要經(jīng)過反復實驗來確定。流速過高，使色譜峰加寬，降低分辨率。流速可通過調(diào)節(jié)操作壓力來調(diào)節(jié)。（六）分部收集要將各組分分離，必須將溶液在洗脫液中已經(jīng)分離的各組分分部收集。每管收集的體積越小，越容易得到純的組分。分部收集可以人工操作，也可通過自動部分收集器實現(xiàn)。（七）檢測和合并收集洗脫液按一定體積分別收集于試管中，為測定各部分中各種成分的分布，要用能特異性檢測被分離化合物的方法來進行分析。比如吸光度。洗脫液的合并：根據(jù)洗脫峰的位置合并較窄的部分，純度較高；合并較寬的部分，含量較多。（八）洗脫峰純度鑒定檢測系統(tǒng)分辨率有限，一個對稱洗脫峰不一定代表一個純凈的組分。可進一步采用電泳法、高效液相色譜法進行鑒定。（九）脫鹽和濃縮純度檢測完畢后，可將同一組分合并。但要得到產(chǎn)品，必須進行濃縮?？刹捎贸瑸V法、透析法、冷凍干燥法或鹽析、有機溶劑沉淀法?？蒲杏玫母呒兌葮悠?，需將已濃縮的樣品再一次上柱檢測。第二節(jié)吸附色譜法一、吸附色譜基本原理固體物質(zhì)具有吸附性能力，可將物質(zhì)從溶液中吸附到它的表面上。吸附劑從溶液中吸附物質(zhì)的同時，也有部分被吸附的該物質(zhì)從吸附劑上脫離（解吸）。被解吸下來的物質(zhì)向前移動時，遇到前面新的吸附劑會被重新吸附，然后又被后來的洗脫液再次解吸，繼續(xù)向前移動。經(jīng)這樣反復地吸附-解吸-再吸附-再解吸的過程。物質(zhì)沿洗脫液的前進方向移動，移動速度取決于吸附劑對該物質(zhì)的吸附能力。吸附能力強，則向前移動速度慢，反之則快，不同組分便會逐漸分離開。二、吸附薄層色譜法將吸附劑均勻地鋪在一塊玻璃上，形成薄薄的平面涂層，干燥后在涂層的一端點樣，豎直放入一個盛有少量展開劑的有蓋容器中，展開劑接觸到吸附劑涂層，借毛細作用向上移動形成薄層色譜，使混合物得以分離。（一）基本原理吸附劑對樣品中各成分吸附能力不同，以及展開劑對它們的解吸附能力的不同，使各成分達到分離。經(jīng)過在吸附劑與展開劑之間多次吸附-溶解作用，將混合物中各組分分離成孤立的樣點，實現(xiàn)混合物分離。（二）吸附薄層色譜條件1、固定相選擇常用吸附劑（固定相）有硅膠、氧化鋁和聚酰胺等。固定相顆粒的大小對展開速度、遷移率、分離效果有顯著影響。2、展開劑選擇主要根據(jù)樣品中各組分的極性、溶劑對于樣品中各組分溶解度等因素來考慮。先用一種極性較小的溶劑為基礎，若展開不好，則用極性較大的溶劑與前一溶劑混合，調(diào)整極性，再次實驗，直到先出適合的展開劑。3、相對移動值從點樣開始到展開后的溶劑前沿?；旌衔镏懈鹘M分的移動距離不同。4、顯色分離化合物若有顏色，可易識別，無需顯色?；衔餂]有顏色時，要識別點樣，使之顯色。主要有碘蒸氣顯色、紫外線顯色、噴霧顯色。（三）薄層色譜操作1、制板玻璃板洗凈，硅膠調(diào)成糊，均勻攤在玻璃上，晾干。用前烘干。2、點樣微量進樣器在距底邊1.5-2.0cm處點樣，直徑小于3mm。3、展開吹干樣點，豎直放入層析缸中。展開劑要接觸到吸附劑下沿，但不接觸樣點。蓋上蓋子，展開。待展開劑上行到一定高度，取出板，畫出展開劑前沿線。4、顯色、計算遷移率吹干展開劑，合適方法顯色，測量移動距離，計算相對移動值。三、吸附柱色譜法（一）基本原理在一定條件下，吸附劑與被分離物質(zhì)之間產(chǎn)生作用，這種作用主要是物理和化學作用。物理作用來自于分子間的范德華力，化學作用主要是氫鍵作用。

（二）吸附柱色譜條件1、色譜柱選擇通常使用玻璃柱，可直接觀察色帶移動情況。工業(yè)大型色譜柱可用金屬制造，在柱壁嵌一條有機玻璃帶。2、吸附劑的選擇所選吸附劑應有最大的比表面積和足夠的吸附能力，對欲分離的不同物質(zhì)應有不同的溶解和解吸能力。與洗脫劑、溶劑及樣品組分不發(fā)生化學變化顆粒均勻，操作過程中不破裂。3、洗脫劑的選擇洗脫劑純度較高，不與樣品和吸附劑起化學反應。對樣品溶解度大，黏度小，易流動，容易與洗脫劑組分分開。（三）吸附色譜應用主要體現(xiàn)在對生物小分子物質(zhì)的分離，在生物化學和藥學領域有比較廣泛的應用。第三節(jié)分配色譜法一、基本原理分配色譜法是利用被分離物質(zhì)中各成分在兩種不相混溶的液體之間分布情況不同而使混合物得到分離。相當于一種連續(xù)性的溶劑提取方法。是把其中一種溶劑固定，用另一種溶劑沖洗。這種分離不經(jīng)過吸附程序，僅由溶劑提取而完成，因此叫分配色譜法。固定在柱內(nèi)的液體稱固定相，需一種固體吸附它，此固體只起支撐作用，而不起分離作用。用作沖洗的液體稱流動相。流動相與固定相發(fā)生接觸，樣品中各成分在兩相間的分布不同，因此移動速度不同。易溶于流動相的成分移動快，而在固定相中溶解度大的成分移動慢，依此得到分離。二、分配色譜條件1、載體的選擇惰性的，沒有吸附能力的，能容留較大量固定相的物質(zhì)。主要有硅膠、硅藻土、纖維素等。2、固定相的選擇常用的固定相有水、緩沖溶液、酸的水溶液、甲酚胺、丙二醇、有機溶劑等。3、流動相選擇一般選用為水所飽和的有機溶劑或水-有機溶劑互溶的混合液。如石油醚、醇類、酮類、苯類等。三、分配色譜基本操作1、裝柱固定相與載體混合后裝柱。2、加樣被分離物配成濃溶液，加到固定相載體上端；被分離物溶液用含固定相載體吸收，溶劑揮發(fā)后，加在載體上端；濾紙吸附被分離物，溶劑揮發(fā)后，放在載體上。3、洗脫四、分配色譜法應用適用于分離極性大，在有機溶劑中溶解度小的成分，或極性很相似的成分。第四節(jié)離子交換色譜法一、基本原理通過分子中的活性離子將溶液中帶相反電荷的物質(zhì)吸附在離子交換劑上，然后用適當?shù)南疵撊軇⑽轿镔|(zhì)再從離子交換劑上洗脫下來，達到分離的目的。離子交換樹脂是生產(chǎn)中常用的一種離子交換劑。利用離子交換樹脂作為吸附劑，將溶液中的待分離組分，依據(jù)其電荷差異，依靠庫侖力吸附在樹脂上，然后利用合適的洗脫劑將吸附質(zhì)從樹脂上洗脫下來，達到分離的目的。二、離子交換劑的類型與結(jié)構(gòu)（一）離子交換樹脂1、陽離子交換樹脂強酸性陽離子交換樹脂：活性基團是-SO3H（磺酸基）和-CH2SO3H（次甲基磺酸基）弱酸性陽離子交換樹脂：活性基團有-COOH,

-OCH2COOH,C6H5OH等弱酸性基團2、陰離子交換樹脂強堿性陰離子交換樹脂：活性基團為季銨基團，如三甲胺基或二甲基-?-羥基乙基胺基弱堿性陰離子交換樹脂：活性基團為伯胺或仲胺，堿性較弱（二）多糖基離子交換劑固相載體為多糖類物質(zhì)，親水性強、交換空間大、對生物大分子物質(zhì)致變性作用。1、離子交換纖維素 樹脂骨架為纖維素，根據(jù)活性基團的性質(zhì)可分為陽離子交換纖維素和陰離子交換纖維素兩類 特點：骨架松散、親水性強、表面積大、交換容量大、吸附力弱、交換和洗脫條件溫和、分辨率高2、離子交換葡聚糖和離子交換瓊脂糖凝膠骨架為葡聚糖凝膠:根據(jù)功能基團的不同，亦可分為陽離子交換和陰離子交換樹脂特點：除了具有離子交換功能以外，兼有分子篩的功能，提高了分離的效率三、離子交換劑的理化性能（一）離子交換樹脂的理化性能1、物理性質(zhì)外觀：球形、淺色為宜，粒度大小為16-60目;孔度、孔徑、比表面積機械強度：>90%；含水量：0.3-0.7g/g樹脂；穩(wěn)定性：熱穩(wěn)定性；膨脹度：交聯(lián)度、活性基團的性質(zhì)與數(shù)量、活性離子的性質(zhì)、介質(zhì)的性質(zhì)和濃度、骨架結(jié)構(gòu)；濕真密度：單位體積濕樹脂的重量；2、交換容量總交換量：每單位數(shù)量樹脂能進行離子交換反應的化學基團的總量。工作交換容量：樹脂在某一條件下的離子交換能力。再生交換容量：一定的再生劑量條件下所取得的再生樹脂的交換容量。再生交換容量為總交換容量的50-90%，工作交換容量為再生交換容量的30-90%。3、吸附選擇性對陽離子的吸附對陰離子的吸附對有色物的吸附（二）多糖基離子交換劑的理化性能極大的表面積和多孔結(jié)構(gòu)良好的化學、物理穩(wěn)定性離子交換纖維素適于易變性的生化產(chǎn)品的純化分離能力強，能將一組復雜的混合物逐一分開能分離純化毫克量的純品四、離子交換色譜基本操作（一）離子交換樹脂的操作1、離子交換樹脂的選擇對陰陽離子交換樹脂，一般根據(jù)被分離物質(zhì)所帶的電荷來決定選用哪種樹脂。被分離物質(zhì)帶正電荷，則采用陽離子交換樹脂，被分離物質(zhì)帶負電荷，則采用陰離子交換樹脂。2、對離子交換樹脂強弱的選擇目標產(chǎn)物具有較強的堿性和酸性時，宜選用弱酸或弱堿性的樹脂，以提高選擇性，并便于洗脫。目標產(chǎn)物是弱酸或弱堿物質(zhì)時，宜選用強堿或強酸性樹脂，保證有足夠的結(jié)合力。3、對離子交換樹脂離子型的選擇主要根據(jù)分離目的進行選擇。如將肝素鈉轉(zhuǎn)換成肝素鈣時，需將所用的陽離子交換樹脂轉(zhuǎn)換成鈣離子型，然后與肝素鈉進行交換。制備無離子水時，用H型的陽離子交換樹脂和OH型的陰離子交換樹脂。2、操作條件的選擇交換時選擇合適的pH值溶液中產(chǎn)物的濃度：低價離子增加濃度有利于交換上樹脂，高價離子在稀釋時容易被吸附。洗脫條件應盡量使溶液中被洗脫離子的濃度降低3、離子交換樹脂的預處理、轉(zhuǎn)型、再生與保存（1）預處理和轉(zhuǎn)型預處理：清洗轉(zhuǎn)型：預處理后，用酸或堿處理使之變?yōu)闅湫突蜮c型樹脂的操作。（2）再生用大量水沖洗使用后的樹脂，除去樹脂表面和空隙內(nèi)部吸附的各種雜質(zhì)然后用轉(zhuǎn)型的方法處理。（3）保存樹脂暫不使用時，以下述離子型保存：陽離子交換樹脂為鈉型；陰離子交換樹脂為氯型；弱堿陰離子交換樹脂為游離胺型。4、離子交換基本操作靜態(tài)交換是將樹脂與交換溶液混合置一定的容器中攪拌進行。也稱靜態(tài)洗脫。動態(tài)交換是先將樹脂裝柱，交換溶液以平流方式通過床進行交換。也稱動態(tài)洗脫。離子交換完成后將樹脂所吸附的物質(zhì)釋放出來重新轉(zhuǎn)入溶液的過程稱為洗脫。（二）離子交換纖維素的操作在介質(zhì)中帶正電的物質(zhì)用陽離子交換劑，帶負電的物質(zhì)用陰離子交換劑。在高于其等電點條件下，分子帶負電而采用陰離子交換纖維素，低于等電點則采用陽離子交換纖維素。離子交換纖維素顆粒較大易引起區(qū)帶擴散，使分辨率降低。通常采用100-230目大小的顆粒。五、離子交換色譜的應用可溶性的有機或無機離子化合物均可進行離子交換色譜操作?；蟽r越高，被結(jié)合的生物物質(zhì)越強，相同化合價和條件下，結(jié)合的親和力隨原子數(shù)的增加而增加。應用方式：反離子交換、物質(zhì)的濃縮、相似物質(zhì)的分離、離子排出、在離子交換葡萄糖和離子交換瓊脂糖上進行分配色譜第五節(jié)親和色譜一、親和色譜概述親和色譜是利用親和作用分離純化生物物質(zhì)的液相色譜法，它根據(jù)生物分子與特定的固定配基之間的親和力不同而使生物分子得以分離。二、親和色譜原理1、原理主要應用生物高分子與配基可逆結(jié)合的原理，將配基通過共價鍵牢固結(jié)合于載體上而制得的層析系統(tǒng)。這種可逆結(jié)合的作用主要是靠生物高分子對它的配基的空間結(jié)構(gòu)的識別。2、親和色譜優(yōu)點高選擇性，待分離物質(zhì)與配基專一性結(jié)合，分辨率高。具有濃縮作用，可純化幾千倍，適用于含量極少的活性物質(zhì)分離操作條件溫和，有效保持樣品原有的生物學活性，適用于不穩(wěn)定的活性物質(zhì)的分離。三、親和色譜介質(zhì)（一）親和配基1、配基應具備的條件必須具有適當?shù)幕瘜W基團以利于固定在載體上配基的分子大小合適，以減小分離過程中的空間位阻效應配基與被分離物質(zhì)之間有足夠大的親和力，復合物能穩(wěn)定一定時間配基與被分離物質(zhì)之間具有合適的特異性（專一性配基與特異性配基）。配基與待分離物之間的結(jié)合具有可逆性2、親和配基的分類按照配基的特性可分為有機小分子類、生物大分子類和染料化合物三類。按照配基的選擇性，親和色譜為配基又可分為專一性配基（僅對某種生物物質(zhì)具有特別強的親和性）和基團特異性配基（對某類化學基團或某一類生物分子具有結(jié)合作用）兩類。3、幾類常用的親和配基（1）抗體與抗原之間具有高度特異性結(jié)合能力，因此可利用抗體或抗原為配基分離純化相應的抗原或抗體，此種親和色譜法又稱免疫親和色譜。利用免疫親和色譜法，特別是以單抗為配基的免疫親和色譜法是高度純化蛋白質(zhì)類生物大分子的有效手段。（2）蛋白質(zhì)A和蛋白質(zhì)G，它們與抗體的結(jié)構(gòu)非常相似，可做為各種抗體的親和配基。蛋白質(zhì)A來源于金黃色葡萄球菌，蛋白質(zhì)G分離自G群鏈球菌，與許多動物的免疫球蛋白的Fc片段具有很強的親和結(jié)合作用。它們與抗體的結(jié)合并不影響抗體與抗原的結(jié)合，因此它們也可用于分離抗原-抗體的免疫復合體。蛋白質(zhì)A和蛋白質(zhì)G與不同種屬來源的各種免疫球蛋白的親和性不一。A蛋白與抗體、抗原結(jié)合的示意圖（3）凝集素外源凝集素是一種天然蛋白質(zhì)，含有糖結(jié)合部位，與一些糖的殘基或鏈段具有高度親和力，可結(jié)合糖基。不同凝集素與糖結(jié)合的特異性不同。伴刀豆球蛋白A是常用的親和配基，可用作糖蛋白、多糖、糖脂、各種含糖配基的生物大分子物質(zhì)以及整個細胞、細胞表面受體蛋白和細胞膜片段的分離純化。（4）酶抑制劑：蛋白酶均存在抑制其活性的物質(zhì)稱酶抑制劑。具有特殊的結(jié)構(gòu)，能夠與酶的活性中心結(jié)合，從而抑制酶的活性。酶的抑制劑可以作為配基用于酶的分離純化。（5）輔酶和磷酸腺苷某些酶需要在輔酶存在的情況下才能表現(xiàn)出催化活性，即輔酶能與脫氫酶和激酶之間通過親和作用相互結(jié)合，因此這些輔酶可用作脫氫酶和激酶的親和配基。主要的輔酶有NAD、NADP、ATP（6）過度金屬離子銅、鎳、鋅等可與氮、硫、氧等供電原子產(chǎn)生配位鍵，因此可與蛋白質(zhì)表面的組氨酸的咪唑基、半胱氨酸的巰基和色氨酸吲哚基發(fā)生親和結(jié)合作用。許多蛋白質(zhì)和肽類分子表面都不同程度地含有暴露的組氨酸、半胱氨酸和色氨酸，這些氨基酸能與二價金屬離子發(fā)生螯合作用。因此可利用金屬螯合色譜得以分離純化。（7）組氨酸具有比較獨特的性質(zhì)，可與蛋白質(zhì)發(fā)生親和結(jié)合作用。在低鹽和pH約等于目標蛋白質(zhì)等電點的溶液中，固定化組氨酸的親和吸附最強，隨鹽濃度的增大，親和吸附作用降低。根據(jù)此特性，利用組氨酸為配基可親和分離等電點相差較大的蛋白質(zhì)。（8）色素配基三嗪類色素是一類分子內(nèi)含有三嗪環(huán)的合成活性染料，與各種需要在NAD的存在下表現(xiàn)其生物活性的脫氫酶和激酶具有結(jié)合作用。這類色素與NAD的結(jié)合部位相同，具有抑制酶活性的作用。利用色素為配基的親和色譜法一般稱作色素親和色譜。（9）其它配基肝素：為酸性多糖，具有抗凝血作用。與脂蛋白、脂肪酶、限制性內(nèi)切酶、甾體受體、抗凝血酶、凝血蛋白質(zhì)等具有親和作用，可用作這些物質(zhì)的親和配基。多聚腺苷酸：用于信使RNA的結(jié)合蛋白、病毒RNA、與DNA有關的NRA酶、核酸抗體等生物活性物質(zhì)的色譜分離。（二）載體1、載體應具備的條件不溶于水，但具有高度親水性化學惰性，沒有或極少的物理吸附或離子交換等非特異性結(jié)合作用。具有多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，有利于溶液的流動和滲透。必須具有足夠的可同配基結(jié)合的化學基團具有良好的化學穩(wěn)定性具有良好的物理穩(wěn)定性均勻性好，最好是均勻的球形結(jié)構(gòu)，對不同分離產(chǎn)物具有不同的分離效果2、常用載體瓊脂糖凝膠、交聯(lián)瓊脂糖、葡聚糖凝膠、纖維素、聚丙烯酰胺凝膠、多孔玻璃除此之外，還有一些合成的高分子材料，具有剛性良好，粒度均勻，孔徑較大，pH適用范圍廣等優(yōu)點。（三）活化劑載體上的化學基團是不活潑的，不能與配基直接偶聯(lián)，通過化學反應介質(zhì)上化學基團處于活化狀態(tài)。能使載體發(fā)生產(chǎn)生自由基與配基結(jié)合的化學物質(zhì)稱為活化劑。四、親和色譜制備選擇合適的配基、載體和間隔臂選擇合適的活化劑和活化方法活化載體配基偶聯(lián)封閉未偶聯(lián)配基的活化基團（一）配基的選擇目標產(chǎn)物與配基之間的親和力的大小和專一性。它們之間的結(jié)合常數(shù)應在104-108mol/l之間.如果配基與生物分子之間的結(jié)合作用過強，需要強烈的洗脫條件才能將給合物洗脫，容易導致蛋白質(zhì)變性。（二）載體的選擇應具有高的比表面積，親水凝膠較為適合做親和色譜的載體。不同的載體適合分離不同的生物分子。（三）載體偶聯(lián)1、偶聯(lián)條件的選擇pH緩沖液溫度和時間配基濃度2、偶聯(lián)反應（1）

溴化腈法用于多糖凝膠的活化，固定活性基團為氨基的配基（R-NH2）。溴化腈（CNBr）對多糖類載體的活化在堿性（pH＞10）條件下數(shù)分鐘即可完成，之后的配基修飾亦需在堿性條件進行，一般使用碳酸鹽緩沖液。反應過程為：

（2）

環(huán)氧基活化法可用于固定分子結(jié)構(gòu)為R-NH2、R-OH和R-SH的配基。常用的活化試劑為1,4-丁二醇-二縮水甘油醚（BGE）和環(huán)氧氯丙烷。以活化羥基為例：或引入活性基團環(huán)氧基后，可采用直接法或間接法（氧化法、碳二亞胺法、戊二醛法）固定配基。

（3）硅膠的活化活化硅膠常采用硅烷化試劑，如γ-氨丙基三甲（乙）氧硅烷和環(huán)氧丙基三甲基硅烷等，反應為：引入活性氨基或環(huán)氧基后，在酸性溶液中環(huán)氧基可發(fā)生二醇化反應：（4）碳二亞胺交聯(lián)法（P217圖8-15）將氨基類配基偶聯(lián)到具有羧基末端的間隔臂或載體上，或?qū)Ⅳ然惻浠悸?lián)到具有氨基端的間隔臂或載體上。（5）有機磺酰氯法（P217圖8-16）將含氨基和巰基的配基偶聯(lián)到瓊脂糖上。（四）間隔臂當配基較小時，將其直接固定在載體上，會由于載體的空間位阻，配基大分子不能發(fā)生有效的親和吸附作用。這時，需要在配基與載體之間連接一個“間隔臂”，使其發(fā)生有效的親和結(jié)合。間隔臂的作用間隔臂應滿足以下條件：發(fā)生作用的活性位點必須位于配基分子的內(nèi)部，并且不能影響配基與目標產(chǎn)物結(jié)合；長度適當，不能過短，否則難以和配基有效結(jié)合，不能太長，以免自身某些基團發(fā)生相互作用，同時結(jié)合能力下降；必須在某種特定的分離條件下能被洗脫（五）封閉活化結(jié)束后有少部分活化基團未被配基偶聯(lián)，需要將其封閉?？杉尤脒^量的能與活化劑反應的試劑封閉多余的活化基團，或水解活化基團。（六）親和色譜介質(zhì)的技術(shù)指標配基偶聯(lián)量：適于小分子質(zhì)量配基樣品吸附量：適用于大分子質(zhì)量配基化學穩(wěn)定性：抗氧化能力，配基不降解程度耐酸堿：穩(wěn)定的pH值應用范圍五、親和色譜法的操作過程1.配基固相化（樣品制備、裝柱、平衡）2.親和吸附3.解吸附4.色譜柱再生1.配基固定化。將與純化對象有專一結(jié)合作用的物質(zhì)，連接在水不溶性載體上，制成親和吸附劑后裝柱（稱親和柱）。2.親和吸附（進料和雜質(zhì)清洗）。將含有純化對象的混合物通過親和柱，純化對象吸附在柱上，其他物質(zhì)流出色譜柱。3.解吸附（目標產(chǎn)物洗脫）。用某種緩沖液或溶液通過親和柱，把吸附在親和柱上的欲純化物質(zhì)洗脫出來。4.色譜柱再生。清洗液清洗。（一）樣品制備（二）裝柱與平衡（三）吸附：被分離的目標產(chǎn)物與親和吸附介質(zhì)緊密結(jié)合的過程（四）清洗：洗去色譜柱中和吸附劑內(nèi)部未被吸附的雜質(zhì)，盡可能留下專一性吸附的結(jié)合物。（五）洗脫1、洗脫方法特異性洗脫：用能與配基可待分離物質(zhì)發(fā)生更強特異性親和作用的小分子化合物作為洗脫劑，通