DB12-T 1271-2023 有機肥中活性大腸桿菌快速測定PMA-qPCR法

12法RapiddetectionofliveEscherichiacoliinorganicfertilizerbyPMA-qPCRmethodI本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導(dǎo)則第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定本文件起草單位：天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所、農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護科研監(jiān)測1有機肥中活性大腸桿菌快速測定PMA-qPCR法本文件規(guī)定了有機肥中活性大腸桿菌PMA-GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和GB/T19438.1禽流感病毒通用熒光RT-PCR檢在一定條件下可以引起人和多種動物發(fā)生胃腸道感染或尿道等多種局部組織器官感染的致病菌。4縮略語PMA：疊氮溴化丙錠（propidiummonoazPCR：聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerasechainreactqPCR：實時熒光定量PCR（quantitativeSYBRGreenI：核酸凝膠染料(SYROX:參比染料（ROXreference2可以進入死亡細菌受損細胞膜，并永久修飾其DNA，阻斷DNA的PCR擴增。在強光照射下，游離在溶液中未與核酸交聯(lián)的剩余PMA可與水分子反應(yīng)，生成沒有活性的羥胺。羥胺不會對后續(xù)從活細菌提取的DNA）：6.1.7SYBRPremixExTaq染料法實時熒光定6.1.8qPCR標準品：含有目的基因的克隆質(zhì)表1大腸桿菌uidA基因qPCR擴增引物5’-ATGGAATTTCGCCGATTTTGC-3’5’-ATTGTTTGCCTCCCTGCTGC-3’超凈工作臺、冰箱（0℃~4℃)、分析天平（精度0.01g）、恒溫震蕩培養(yǎng)箱、LED光解儀（波長465nm～475nm、溫度低于37℃)、低溫離心機（最大離心力≥器、核酸自動提取儀、qPCR儀、超微量將采集的樣品混勻，用四分法將樣品縮分至53應(yīng)將樣品放入0℃~4℃冰箱保存，放置時間不應(yīng)超過24h。9檢測步驟9.1樣品制備將樣品進一步縮分后研磨至全部通過?1mm尼龍篩，混勻。無菌操作下稱取樣品10.0g，加入到帶玻取1mL上清液至離心管中，加入0.2mLPMA工作液，PMA終濃度約為8可選用等效的商品化核酸提取試劑盒，或選用核酸自動提取儀及配套試劑，參考附9.5標準曲線ccopies=×NA…………（1）NA——阿伏伽德羅常數(shù)，取6.02×1023。45A.1試劑盒洗液去除雜質(zhì)，最終由洗脫液將核酸從磁珠上洗脫下來。試劑盒內(nèi)包含的試劑規(guī)格和數(shù)量見表A.11瓶1瓶2瓶2瓶1瓶A.2耗材A.3儀器及設(shè)備A.4操作步驟A.4.1試劑添加A.4.2加樣取200μL樣品上清液，加入到萃取樣品盤的1#列/6A.4.3啟動推入底部。關(guān)閉自動核酸萃取儀進樣門，按下“開始”按鈕。萃取反應(yīng)將在1小時內(nèi)7[10]於穎.PMA-qPCR定量檢測畜禽肉類中食源性[11]蓋冬雪,任洪林,盧士英,等.乳品中大腸桿