生物學(xué)基本技能 教案ⅩⅢ 離心操作

基本技能ⅩⅢ離心操作一、目標(biāo)與任務(wù)本次教學(xué)主題基本技能ⅩⅢ離心操作學(xué)時(shí)授課班級(jí)授課日期授課地點(diǎn)主講教師實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.了解離心機(jī)的類型、結(jié)構(gòu)原理及使用注意事項(xiàng)。2.掌握各種離心機(jī)的操作技術(shù)和技能。3.掌握離心機(jī)的一般維護(hù)和維修技能技能分解常用離心機(jī)類型常用離心管類型離心原理和技術(shù)參數(shù)離心機(jī)操作技術(shù)離心機(jī)的日常維護(hù)、常見故障及排除實(shí)驗(yàn)操作實(shí)訓(xùn)思政元素增強(qiáng)責(zé)任意識(shí)；培養(yǎng)實(shí)事求是的精神；理論與實(shí)踐相結(jié)合教學(xué)方法講授法、演示法、討論法、案例分析法、課堂觀摩法、實(shí)訓(xùn)法教學(xué)媒體教材、課件、教案、多媒體、投影儀二、教學(xué)進(jìn)度教學(xué)過程教學(xué)內(nèi)容教學(xué)活動(dòng)教學(xué)時(shí)間（分鐘）教師活動(dòng)學(xué)生活動(dòng)理論知識(shí)講授一、常用離心機(jī)類型二、常用離心管類型（一）按離心管材質(zhì)分類·塑料離心管。塑料離心管常用的材料有聚乙烯（PE）、聚碳酸酯（PC）、聚丙烯（PP）等，其中聚丙烯管性能相對(duì)較好。塑料離心管的優(yōu)點(diǎn)是硬度小，可用穿刺法取出樣本；缺點(diǎn)是易變形、抗有機(jī)溶劑腐蝕性差、使用壽命短。·玻璃離心管。使用玻璃離心管時(shí)離心力不宜過大，需要墊橡膠墊，防止管子破碎。高速離心機(jī)一般不選用玻璃離心管。玻璃離心管蓋封閉性不夠好，液體不能加滿(針對(duì)高速離心機(jī)且使用角轉(zhuǎn)子)，否則會(huì)使液體外溢，失去平衡。外溢后果是液體污染轉(zhuǎn)子和離心腔，影響感應(yīng)器正常工作。超速離心時(shí)，液體一定要加滿離心管，因?yàn)槌匐x心需要抽高真空，只有加滿才能避免離心管變形?！そ饘匐x心管。金屬離心管一般采用不銹鋼材質(zhì)。不銹鋼離心管具有強(qiáng)度大、不變形、抗熱、抗凍、抗化學(xué)腐蝕等優(yōu)點(diǎn)。其主要用于工業(yè)生產(chǎn)，但同時(shí)要注意避免接觸如強(qiáng)酸等腐蝕性的化學(xué)物質(zhì)。（二）按離心管底部形狀分類·錐形離心管。也稱為尖底離心管，底部為錐形。當(dāng)樣品量少而需收集沉淀時(shí)，用錐形離心管更容易分離，上層液更容易用吸管吸取，是使用最多的離心管。·平底離心管。用途和錐形離心管相同，但平底離心管可以立放，實(shí)驗(yàn)中更方便放取?！A底離心管。當(dāng)進(jìn)行密度梯度離心時(shí)，最佳選擇是圓底離心管，圓底底面積大，較錐形底能承受更大的離心力。（三）按離心管容量分類·微量離心管。微量離心管是一種小型的離心管，又稱EP（eppendorf）管，常與微型離心機(jī)配套使用，用于微量試劑的分離。其常見容量規(guī)格有0.2mL、0.65mL、1.5mL、2mL。·普通離心管。普通離心管是實(shí)驗(yàn)室最常見的離心管，常見的容量規(guī)格為15mL、30mL、50mL?！ご笕萘侩x心管。大容量離心管又稱為離心瓶或離心杯，是大容量細(xì)胞收獲、切粒和蛋白純化的離心選擇，常用于工業(yè)化生產(chǎn)。其常見的容量規(guī)格為250mL、500mL、600mL。（四）按離心管蓋閉合方式分類·壓蓋離心管。以按壓方式密封的離心管，常見于微型離心管，都屬于壓蓋離心管。·螺旋蓋離心管。容量50mL以上的離心管以螺旋蓋離心管為主。螺旋蓋離心管又可分為平蓋（蓋子頂部是平的）和塞蓋（蓋子頂部有塞子形狀）。三、離心原理和技術(shù)參數(shù)（一）基本概念·離心力（centrifugalforce,Fc）。離心力是指由于物體旋轉(zhuǎn)而產(chǎn)生脫離旋轉(zhuǎn)中心的力，也指物體做圓周運(yùn)動(dòng)所產(chǎn)生的向心力的反作用力。當(dāng)物體所受外力小于運(yùn)動(dòng)所需要的向心力時(shí)，物體將向遠(yuǎn)離圓心的方向運(yùn)動(dòng)，這種運(yùn)動(dòng)稱為離心運(yùn)動(dòng)，也叫離心現(xiàn)象?！は鄬?duì)離心力（relativecentrifugalforce,RCF）。通常顆粒在離心過程中的離心力是相對(duì)于顆粒本身所受的重力而言，因此把這種離心力稱為相對(duì)離心力，其單位是重力加速度“g”。由于各種離心機(jī)轉(zhuǎn)子的半徑或離心管至旋轉(zhuǎn)軸中心的距離不同，離心力也不同。·沉降速度（sedimentationvelocity)。沉降速度是指在強(qiáng)大離心力作用下，單位時(shí)間內(nèi)物質(zhì)運(yùn)動(dòng)的距離。·沉降時(shí)間。在實(shí)際工作中，常常遇到在已有的離心機(jī)上把某一種溶質(zhì)從溶液中全部沉降分離出來需要多大轉(zhuǎn)速與多長(zhǎng)時(shí)間的問題。如果轉(zhuǎn)速已知，則需確定分離某粒子所需要的時(shí)間，即沉降時(shí)間?！系數(shù)。用來描述在一個(gè)轉(zhuǎn)子中將粒子沉降下來的效率。K系數(shù)與離心轉(zhuǎn)速及粒子沉降的路徑有關(guān)，所以K系數(shù)是一個(gè)變數(shù)?！こ两迪禂?shù)。沉降系數(shù)是指顆粒在單位離心場(chǎng)作用下的沉降速度，其單位為秒。各種生物樣品的沉降系數(shù)差別很大，利用沉降系數(shù)的差異，可以應(yīng)用離心技術(shù)來定性和定量地分析及分離制備。（二）離心技術(shù)原理離心技術(shù)是指利用旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)的離心力以及物質(zhì)的沉降系數(shù)或懸浮密度的差異進(jìn)行分離、濃縮和提純生物樣品的一種方法?！げ钏匐x心技術(shù)原理。差速離心技術(shù)又稱為分步離心技術(shù)，是利用不同顆粒在離心場(chǎng)中沉降系數(shù)的差異，在同一離心條件下，通過不斷增加相對(duì)離心力，使不同沉降系數(shù)的粒子分離的離心方法。·速率區(qū)帶離心技術(shù)原理。速率區(qū)帶離心技術(shù)是根據(jù)分離粒子的沉降系數(shù)不同，在某一離心力的作用下，使具有不同沉降速度的粒子在梯度液中處于不同的密度梯度層內(nèi)，形成幾條分開的樣品區(qū)帶，達(dá)到彼此分離的技術(shù)?！さ让芏葏^(qū)帶離心技術(shù)。采用等密度區(qū)帶離心技術(shù)離心時(shí)，需要在離心前預(yù)先制備密度梯度液，包括被分離樣品中所有粒子的密度。待分離的樣品與梯度液先混合，離心開始后，梯度液由于離心力的作用逐漸形成一個(gè)從離心管底部到液面密度逐漸遞減的連續(xù)密度梯度，與此同時(shí)原來分布均勻的粒子也重新分布。當(dāng)管底介質(zhì)的密度大于粒子的密度，粒子上??；當(dāng)液面處粒子密度大于介質(zhì)密度時(shí)，粒子沉降，最后粒子進(jìn)入一個(gè)它本身的密度位置，即粒子密度等于介質(zhì)密度，粒子形成純組分區(qū)帶。（三）技術(shù)參數(shù)1.離心機(jī)的主要技術(shù)參數(shù)（1）最大轉(zhuǎn)速：最大轉(zhuǎn)速指離心機(jī)轉(zhuǎn)頭可達(dá)到的最大轉(zhuǎn)速，單位是rpm或r/min。（2）最大離心力：最大離心力指離心機(jī)可產(chǎn)生的最大相對(duì)離心力，單位是g。（3）最大容量：最大容量指離心機(jī)一次可分離樣品的最大體積，通常表示為m×n，m為一次可容納的最多離心管數(shù)，n為一個(gè)離心管可容納分離樣品的最大體積，單位是mL或L。（4）調(diào)速范圍（轉(zhuǎn)速設(shè)置范圍）：調(diào)速范圍指離心機(jī)轉(zhuǎn)頭轉(zhuǎn)速可調(diào)整的范圍。（5）溫度控制范圍：溫度控制范圍指離心機(jī)工作時(shí)可控制的樣品溫度范圍。（6）工作電壓：工作電壓一般指離心機(jī)電機(jī)工作所需要的電壓。（7）電源功率：電源功率通常指離心機(jī)電機(jī)的額定功率。2.離心機(jī)轉(zhuǎn)頭的主要技術(shù)參數(shù)轉(zhuǎn)頭（rotor）是離心機(jī)分離樣品的核心部件，它的轉(zhuǎn)速與轉(zhuǎn)子的材料及強(qiáng)度有關(guān)。低速離心機(jī)一般采用超硬鋁合金；超速離心機(jī)采用鈦合金。一般來說，同一類型離心機(jī)，重量輕、容量小的轉(zhuǎn)頭轉(zhuǎn)速要高；反之，轉(zhuǎn)速要低。離心機(jī)常有多種不同形狀的轉(zhuǎn)頭，其各自所反映的離心力場(chǎng)的大小和沉降距離也不一樣，在實(shí)際工作中應(yīng)根據(jù)分離要求正確選擇使用。四、離心機(jī)操作技術(shù)（一）低速離心機(jī)（lowspeedcentrifuge）1.結(jié)構(gòu)低速離心機(jī)的結(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單，由電動(dòng)機(jī)、離心轉(zhuǎn)盤（轉(zhuǎn)頭）、調(diào)速裝置、定時(shí)器、離心套管與底座等主要部件構(gòu)成。電動(dòng)機(jī)是離心機(jī)的主要工作部件，一般多為串激式電動(dòng)機(jī)，包括定子和轉(zhuǎn)子兩部分。離心轉(zhuǎn)盤（轉(zhuǎn)頭）常用鑄鋁制成，是平頂錐形。電動(dòng)機(jī)的調(diào)速裝置有多種，如多抽頭變阻器、瓷盤可變電阻器等形式。離心套管主要用塑料或不銹鋼材料制成。2.適用范圍主要用于分離細(xì)胞、細(xì)胞碎片及培養(yǎng)基殘?jiān)阮w粒物，臨床上主要用于血漿、血清的分離及腦脊液、胸腹水、尿液等有效成分的分離。3.操作步驟（1）離心前準(zhǔn)備（2）運(yùn)轉(zhuǎn)前檢查（3）離心操作4.操作注意事項(xiàng)（二）高速離心機(jī)（highspeedcentrifuge）1.結(jié)構(gòu)高速離心機(jī)通常有轉(zhuǎn)動(dòng)裝置、速度控制系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、溫度控制系統(tǒng)、離心室、離心轉(zhuǎn)頭及安全保護(hù)裝置等。2.適用范圍主要用于細(xì)菌的蛋白沉淀、核酸提取，細(xì)胞或亞細(xì)胞組分分離，動(dòng)、植物病毒分離，血液血清提取及溶液中大小顆粒不同組分的分離等。3.操作步驟（1）離心前準(zhǔn)備（2）運(yùn)轉(zhuǎn)前檢查（3）離心操作4.操作注意事項(xiàng)（三）超速離心機(jī)（ultracentrifuge）1.結(jié)構(gòu)超速離心機(jī)主要由驅(qū)動(dòng)裝置、速度控制系統(tǒng)、溫度控制系統(tǒng)（由安裝在轉(zhuǎn)頭下面的紅外線測(cè)量感受器直接并連續(xù)檢測(cè)離心腔的溫度，以保證更準(zhǔn)確更靈敏的溫度調(diào)控）、真空系統(tǒng)、轉(zhuǎn)頭及安全保護(hù)裝置組成。2.適用范圍超速離心機(jī)按用途分為制備型、分析型及分析制備型三種。制備型超速離心機(jī)主要用于生物大分子、細(xì)胞器和病毒的分離純化，能使亞細(xì)胞分級(jí)分離，并可用于測(cè)定蛋白質(zhì)及核酸的分子量。分析型超速離心機(jī)裝有光學(xué)系統(tǒng)，可拍照、測(cè)量、數(shù)字輸出，有自動(dòng)打印系統(tǒng)等，可通過光學(xué)系統(tǒng)對(duì)測(cè)試樣品的沉降過程及純度進(jìn)行觀察。分析制備型超速離心機(jī)將分析型和制備型超速離心機(jī)的優(yōu)點(diǎn)結(jié)合在一起，使得設(shè)備更完美。3.操作步驟4.操作注意事項(xiàng)（四）管式離心機(jī)（tubularcentrifuge）1.外形結(jié)構(gòu)為了減小離心機(jī)轉(zhuǎn)鼓所承受的應(yīng)力，使物質(zhì)有足夠的沉降時(shí)間，把離心機(jī)的轉(zhuǎn)鼓（相當(dāng)于離心管）直徑變小，長(zhǎng)度加長(zhǎng)，類似一根長(zhǎng)管子，故稱管式離心機(jī)。結(jié)構(gòu)包括主軸、壓緊輪、電機(jī)、機(jī)身、進(jìn)液部分、轉(zhuǎn)鼓和集液盤等。2.適用范圍管式離心機(jī)是利用離心力來達(dá)到液體與固體顆粒、液體與液體的混合物中各組分分離的機(jī)械設(shè)備。管式分離機(jī)是目前使用離心法進(jìn)行分離的理想設(shè)備，主要用于液-固、液-液或液-液-固三相分離，其最小分離顆粒為1μm。特別是對(duì)一些液固相比重差異小，固體粒徑細(xì)、含量低，介質(zhì)腐蝕性強(qiáng)等物料的提取、濃縮、澄清較為適用。3.操作步驟（五）三足離心機(jī)（threecolumncentrifuge）1.結(jié)構(gòu)又稱為三足式離心機(jī)，因底部支撐為三個(gè)柱腳，以等分三角形的方式排列而得名，是一種固液分離設(shè)備。2.適用范圍主要分為過濾式和沉降式兩種分離形式。（1）過濾式：轉(zhuǎn)鼓開孔，附加過濾介質(zhì)通過攔截的方式做到固液二相分離的離心機(jī)統(tǒng)稱為過濾式離心機(jī)。過濾式離心機(jī)適用于物料黏度小、固相顆粒不易變形（如結(jié)晶體）且較大的小批量生產(chǎn)，多用于工業(yè)脫水。（2）沉降式：沉降式離心機(jī)設(shè)備轉(zhuǎn)鼓為密閉桶狀，該設(shè)備工作原理是通過離心力做到固液二相分離，這種形式的離心機(jī)統(tǒng)稱為沉降式離心機(jī)。沉降式離心機(jī)適用物料廣泛，黏度大，固相顆粒小的物料都能通過提高離心力的方式來達(dá)到固液二相分離的要求。3.操作步驟五、離心機(jī)的日常維護(hù)、常見故障及排除（一）離心機(jī)的日常維護(hù)（1）離心機(jī)的安放必須選擇堅(jiān)固的水平臺(tái)面，放置平穩(wěn)，底座橡皮四角要緊貼臺(tái)面，防止工作時(shí)發(fā)生震動(dòng)。（2）對(duì)離心機(jī)套管要定期檢查，以便及時(shí)發(fā)現(xiàn)套管內(nèi)是否有異物或污垢，發(fā)現(xiàn)橡膠墊脫落要立即處理，以保持離心機(jī)的平衡。（3）離心機(jī)轉(zhuǎn)子、套管要保持清潔，每周要用2%戊二醛消毒一次，最后用蒸餾水沖洗，軟布擦干裝好備用。（4）當(dāng)天使用離心機(jī)后，要打開門蓋，使潮氣去掉，避免長(zhǎng)期使用造成部件腐蝕。（5）較長(zhǎng)時(shí)間不用時(shí)要將離心機(jī)轉(zhuǎn)子取出，用干凈的紗布擦干。在離心室內(nèi)放入干燥劑，防止驅(qū)動(dòng)軸生銹。（6）大容量冷凍離心機(jī)的轉(zhuǎn)子座不能磕碰，不能損傷錐面。要定期用軟布將轉(zhuǎn)子座及轉(zhuǎn)子錐孔擦干凈，并涂少許凡士林，避免摩擦造成損壞。（7）離心機(jī)臺(tái)面禁止放其他物品，以防板面劃傷。離心機(jī)部件（轉(zhuǎn)子、離心套管等）定期消毒時(shí)禁止使用腐蝕性強(qiáng)的次氯酸鈉溶液（84消毒液），最好用2%戊二醛消毒液。（二）離心機(jī)常見故障及排除1.電機(jī)不轉(zhuǎn)（1）主電源指示燈不亮：檢查保險(xiǎn)絲是否熔斷，電源線、插頭、插座是否接觸良好。（2）主電源指示燈亮而電機(jī)不能啟動(dòng)：檢查波段開關(guān)、瓷盤變阻器是否損壞或連接線是否斷脫，檢查磁場(chǎng)線圈的連接線是否斷脫或線圈內(nèi)部是否短路。2.轉(zhuǎn)頭損壞轉(zhuǎn)頭因金屬疲勞、超速、過應(yīng)力、化學(xué)腐蝕、選擇不當(dāng)、使用轉(zhuǎn)頭不平衡及溫度失控等導(dǎo)致離心管破裂，從而造成樣品滲漏而損壞轉(zhuǎn)頭。電機(jī)上