高中生物 1 .2 基因工程的基本操作程序

1.2基因工程的基本操作程序

學(xué)習(xí)目標(biāo)：1.掌握目的基因獲取的常見方法。(難點(diǎn))2.學(xué)會(huì)基因表達(dá)載體構(gòu)建的方法

和要求。(重點(diǎn))3.理解目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法。(重點(diǎn))4.掌握目的基因檢測(cè)與鑒

定的具體操作。(重、難點(diǎn))

自主預(yù)習(xí)。擢新Ml

NINHUYUXI丁AZXIZNHI

匚基礎(chǔ)知識(shí)填充工

一、目的基因的獲取

1.目的基因

(1)主要是指編碼蛋白質(zhì)的基因。

(2)一些具有調(diào)控作用的因子。

2.獲取方法

(1)從基因文庫(kù)中獲取

①基因組文庫(kù)：含有一種生物所有的基因。

②部分基因文庫(kù)：含有一種生物的一部分基因,如cDNA文庫(kù)。

⑵利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因

①含義：是一項(xiàng)在生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)。

②原理：DNA雙鏈復(fù)制。

③條件：引物、DNA模板、窗。酶、四種脫氧核甘酸。

④過(guò)程。

a.目的基因DNA受熱變性后解鏈為單鏈(90?95°C)。

b.引物與單鏈相應(yīng)互補(bǔ)序列結(jié)合(55?60℃)0

c.在DNA聚合酶作用下進(jìn)行延伸(70?75℃)。

d.重復(fù)循環(huán)多次。

⑤結(jié)果：每次循環(huán)后目的基因的量增加一倍，即成指教形式擴(kuò)增(約為2")。

(3)人工合成法

①條件：基因比較小，核昔酸序列已知。

②方法：通過(guò)DNA合成儀用化學(xué)方法直接人工合成。

二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建一一核心

1.基因表達(dá)載

.目的基因

啟(位置:基因的直遍

同功能:是世世迷合酶識(shí)別和結(jié)合的

子(部位，驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出迎擔(dān)

.位置:基因的尾端

終好?功能:終止砰

標(biāo)記基因:鑒別受體細(xì)胞中是否含有

.目的基因

2.基因表達(dá)載體的功能

(1)使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代。

(2)使目的基因表達(dá)和發(fā)揮作用。

三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞

1.轉(zhuǎn)化的含義：目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi),并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過(guò)程。

掃

碼

看

做

課

2.轉(zhuǎn)化的方法

(1)導(dǎo)入植物細(xì)胞

①最常用方法

農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法:雙子葉植物或裸子植物。

②其他方法

a.基因槍法：?jiǎn)巫尤~植物。

b.花粉管通道法。

(2)導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞

①常用方法：顯微注射技術(shù)。

②常用受體細(xì)胞：受精卵。

(3)導(dǎo)入微生物細(xì)胞

①方法

a.用Ca=處理細(xì)胞,使細(xì)胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)(這種細(xì)胞

稱為感受態(tài)細(xì)胞)o

b.感受態(tài)細(xì)胞吸收重組表達(dá)載體DNA分子。

②受體細(xì)胞：原核細(xì)胞(使用最廣泛的是大腸桿菌)。

③原核生物的特點(diǎn)：繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對(duì)較少等。

四、目的基因的檢測(cè)與鑒定

1.分子水平檢測(cè)

(1)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物DNA上是否插入了目的基因。

方法：DNA分子雜交技術(shù)。

(2)檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNAo

方法：分子雜交技術(shù)。

(3)檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)。

方法：抗原一抗體雜交技術(shù)。

2.個(gè)體水平鑒定

包括抗蟲、抗病的接種實(shí)驗(yàn),以確定是否有抗性及抗性程度。基因工程產(chǎn)品需要與天然

產(chǎn)品活性進(jìn)行比較等。

F預(yù)習(xí)效果驗(yàn)收「

1.判斷對(duì)錯(cuò)(正確的打“，錯(cuò)誤的打“X”)

(1)如果某種生物的cDNA文庫(kù)中的某個(gè)基因與該生物的基因組文庫(kù)中的某個(gè)基因控制的

性狀相同，則這兩個(gè)基因的結(jié)構(gòu)也完全相同。()

(2)7ag酶是用PCR儀對(duì)DNA分子擴(kuò)增過(guò)程中常用的一種耐高溫的DNA連接酶。

()

(3)啟動(dòng)子和終止密碼子均在胰島素基因的轉(zhuǎn)錄中起作用。

()

(4)利用DNA分子雜交鑒定目的基因是否已導(dǎo)入受體細(xì)胞。

()

(5)轉(zhuǎn)基因抗蟲棉植株抗蟲效果的鑒定必須通過(guò)分子檢測(cè)才能達(dá)到目的。()

(6)表達(dá)載體中的胰島素基因可通過(guò)人肝細(xì)胞mRNA反轉(zhuǎn)錄獲得。()

(7)將重組表達(dá)載體導(dǎo)入動(dòng)物受精卵常用顯微注射法。()

(8)從大腸桿菌細(xì)胞中獲得人胰島素基因的mRNA,說(shuō)明目的基因完成了表達(dá)。

()

提示：(l)XcDNA文庫(kù)中的基因一般沒有啟動(dòng)子和內(nèi)含子序列，而基因組文庫(kù)含有。

(2)X看。酶是熱穩(wěn)定DNA聚合酶。

(3)X終止密碼子位于mRNA上，在翻譯過(guò)程中起作用。

(4)X利用DNA分子雜交的目的是檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物的DNA上是否插入了目的基因。

(5)X抗蟲效果的鑒定要在個(gè)體生物學(xué)水平上做抗蟲接種實(shí)驗(yàn)來(lái)鑒定。

(6)X人肝細(xì)胞中不含胰島素基因的mRNAo

(7)V

(8)X獲得人胰島素基因的mRNA,只能說(shuō)明目的基因完成了轉(zhuǎn)錄。

2.下列不屬于獲取目的基因的方法是()

A.利用DNA連接酶復(fù)制目的基因

B.反轉(zhuǎn)錄法

C.從基因文庫(kù)中獲取目的基因

D.利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因

A［本題考查目的基因的獲取方法及DNA聚合酶和DNA連接酶的區(qū)別。對(duì)目的基因（DNA

片段）進(jìn)行復(fù)制需利用DNA聚合酶而不是DNA連接酶。］

3.下列關(guān)于基因表達(dá)載體的構(gòu)建的描述，錯(cuò)誤的是（）

A.基因表達(dá)載體的構(gòu)建是基因工程的核心

B.基因表達(dá)載體包括目的基因、啟動(dòng)子、終止子、標(biāo)記基因等部分

C.目的基因主要是指編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因

D.構(gòu)建的基因表達(dá)載體都是相同的

D［基因表達(dá)載體的構(gòu)建是基因工程的第二步，也是基因工程的核心；一個(gè)基因表達(dá)載體

的組成除目的基因外還必須具有啟動(dòng)子、終止子、標(biāo)記基因等部分；目的基因主要是指編碼

蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因；由于受體細(xì)胞不同，基因表達(dá)載體的構(gòu)建也會(huì)有差別，不可能都是相同

的。］

合作探究。及重旅

HEZUOTANJIUGONGZHONGNAN

援究點(diǎn)）目的基因的獲取

背景材料

1.原核細(xì)胞和真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)

非編碼區(qū)-編碼區(qū)一?;一非編碼區(qū)一

與RNA聚合酶

結(jié)合的位點(diǎn)

一個(gè)典型的原核細(xì)胞基因結(jié)構(gòu)示意圖

I一非編碼區(qū)------編碼區(qū)------＜一非編碼區(qū)一|

■■■■■二

骼與R的NA位聚點(diǎn)合屏酶：顯I子內(nèi)I含子:1

一個(gè)典型的真核細(xì)胞基因結(jié)構(gòu)示意圖

一個(gè)基因包含編碼區(qū)和非編碼區(qū)兩部分，而真核細(xì)胞基因的編碼區(qū)又包含內(nèi)含子和外顯

子?；虮磉_(dá)時(shí)只有編碼區(qū)轉(zhuǎn)錄形成mRNA,但是真核生物基因中的內(nèi)含子部分并不表達(dá)，內(nèi)

含子轉(zhuǎn)錄形成的mRNA中的部分要切除，只有外顯子部分才能控制翻譯出蛋白質(zhì)。具有翻譯功

能的mRNA叫成熟的mRNAo

2.真核生物的基因轉(zhuǎn)移到原核生物體內(nèi)后不能翻譯出蛋白質(zhì)

從真核生物體內(nèi)提取的目的基因在原核生物體內(nèi)轉(zhuǎn)錄后，不能切除內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄的部分，

無(wú)法加工形成成熟的mRNA。因此，真核生物的目的基因通常采用反轉(zhuǎn)錄法合成。

［思考交流］

1.基因組文庫(kù)和cDNA文庫(kù)有什么區(qū)另IJ?

提示：

文庫(kù)類型基因組文庫(kù)cDNA文庫(kù)

文庫(kù)大小大小

基因中的啟動(dòng)子(具有啟動(dòng)作用的DNA片

有無(wú)

段)

基因中的內(nèi)含子(位于編碼蛋白質(zhì)序列內(nèi)

有無(wú)

的非編碼DNA片段)

某種生物的全部基

基因多少某種生物的部分基因

因

部分基因

物種間的基因交流可以

可以

2.為什么cDNA文庫(kù)中沒有啟動(dòng)子和內(nèi)含子？

提示：由于細(xì)胞中成熟的mRNA已不含有內(nèi)含子等部分轉(zhuǎn)錄形成的序列，所以利用細(xì)胞中

成熟的mRNA反轉(zhuǎn)錄合成的目的基因(cDNA)中沒有內(nèi)含子，也沒有非編碼區(qū)，也就沒有啟動(dòng)子。

3.PCR過(guò)程中需要解旋酶嗎？所需要的DNA聚合酶應(yīng)具有什么特點(diǎn)？

提示：PCR過(guò)程中，DNA雙鏈解開是在高溫下完成的，不需要解旋酶；由于PCR過(guò)程溫度

較高，所以需要能耐高溫的DNA聚合酶。

4.PCR過(guò)程中為什么需要引物？

提示：引物是一小段單鏈DNA或RNA,作為DNA復(fù)制的起始序列，它能與DNA母鏈的一段

堿基序列互補(bǔ)配對(duì)。存在于自然界中生物的DNA復(fù)制和人工合成中的多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)之

所以需要引物，是因?yàn)樵贒NA合成時(shí)DNA聚合酶只能從5,到3,合成子鏈。

［歸納總結(jié)］

1.從基因文庫(kù)中獲取目的基因

(1)基因文庫(kù)的含義：將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導(dǎo)入受體菌的群體中儲(chǔ)

存，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同的基因，稱為基因文庫(kù)。

(2)基因文庫(kù)的種類

①基因組文庫(kù)：包含一種生物所有的基因。

②部分基因文庫(kù)：只包含一種生物的一部分基因，如cDNA文庫(kù)。

說(shuō)明：用某種生物發(fā)育的某個(gè)時(shí)期的mRNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的多種互補(bǔ)DNA(也叫cDNA)片段，

與載體連接后儲(chǔ)存在一個(gè)受體菌群中，那么，這個(gè)受體菌群就叫做這種生物的cDNA文庫(kù)。

(3)基因組文庫(kù)的構(gòu)建

提取某種生物的全部DNA

用適當(dāng)?shù)南拗泼盖懈?/p>

多個(gè)一定大小的DNA片段

將DNA片段與載體連接，導(dǎo)入受體菌中儲(chǔ)存

構(gòu)建

基因組文庫(kù)

(4)cDNA文庫(kù)的構(gòu)建

某種生物的單鏈mRNA反轉(zhuǎn)錄酶催化單鏈互補(bǔ)DNADNA聚合酶催化雙鏈cDNA片段

-------------?--------------->-

與載體連接導(dǎo)入受體菌中儲(chǔ)存構(gòu)建,cDNA文庫(kù)

----------->■?

(5)從基因文庫(kù)中獲取目的基因的方法

根據(jù)目的基因的有關(guān)信息，例如，根據(jù)基因的核甘酸序列、基因的功能、基因在染色體

上的位置、基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA,以及基因的表達(dá)產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性來(lái)獲取目的基因。

2.利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因

(DPCR技術(shù)：PCR是多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的縮寫，它是一項(xiàng)在生物體外復(fù)制特定DNA片段的

核酸合成技術(shù)。

(2)PCR原理：DNA雙鏈復(fù)制。

(3)前提條件：有一段已知目的基因的核甘酸序列(以便根據(jù)這一序列合成引物)。

(4)擴(kuò)增過(guò)程：目的基因DNA受熱變性后解鏈為單鏈，引物與單鏈相應(yīng)互補(bǔ)序列結(jié)合，然

后在DNA聚合酶作用下進(jìn)行延伸，如此重復(fù)循環(huán)多次。如圖所示。

，右目的基因

\90-95℃：變性。使DNA片段雙鏈解開

I55-60%：：復(fù)性，使解開的DNA的兩條單

……”鏈分別與相應(yīng)的引物結(jié)合

苫丁，力(o引物)

170-75t:Taq酶從引物起始進(jìn)行互補(bǔ)鏈的合成

-IIIIIIl'T-IIII11|

i，I，，iI

注意：利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因可以在PCR擴(kuò)增儀中自動(dòng)完成。

3.用化學(xué)方法人工合成目的基因

(1)條件：基因比較小，且核甘酸序列已知。

(2)儀器：DNA合成儀。

點(diǎn)!練目.

1.下列獲取目的基因的方法中需要模板鏈的是（）

①?gòu)幕蛭膸?kù)中獲取目的基因

②利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因

③反轉(zhuǎn)錄法獲得cDNA

④通過(guò)DNA合成儀利用化學(xué)方法人工合成目的基因

A.①②③④B.①②③

C.②③④D.②③

D［可依據(jù)基因的核甘酸序列、基因的功能、基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA以及基因的表達(dá)產(chǎn)物

蛋白質(zhì)等從基因文庫(kù)中獲取目的基因，故①不需要模板；利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因需要DNA

的兩條鏈作為模板；反轉(zhuǎn)錄法獲得cDNA需要mRNA作為模板；通過(guò)DNA合成儀利用化學(xué)方法

人工合成目的基因時(shí)，不需要模板。］

2.（2019?全國(guó)卷I）基因工程中可以通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因?；卮鹣铝袉?wèn)題。

（1）基因工程中所用的目的基因可以人工合成，也可以從基因文庫(kù)中獲得。基因文庫(kù)包括

和O

（2）生物體細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制開始時(shí)，解開DNA雙鏈的酶是。在體外利用PCR技

術(shù)擴(kuò)增目的基因時(shí)，使反應(yīng)體系中的模板DNA解鏈為單鏈的條件是o上述

兩個(gè)解鏈過(guò)程的共同點(diǎn)是破壞了DNA雙鏈分子中的0

（3）目前在PCR反應(yīng)中使用Tag酶而不使用大腸桿菌DNA聚合酶的主要原因是

［答案］⑴基因組文庫(kù)cDNA文庫(kù)

⑵解旋酶加熱至90?95℃氫鍵

（3）Taq酶熱穩(wěn)定性高，而大腸桿菌DNA聚合酶在高溫下會(huì)失活

［題后反思］

項(xiàng)目DNA復(fù)制PCR技術(shù)

解旋方式解旋酶催化DNA在高溫作用下變性解旋

場(chǎng)所細(xì)胞內(nèi)（主要在細(xì)胞核內(nèi)）細(xì)胞外（主要在PCR擴(kuò)增儀內(nèi)）

DNA解旋酶、普通的DNA聚

區(qū)別酶耐熱的DNA聚合酶（窗g酶）

合酶等

溫度條件細(xì)胞內(nèi)的溫度條件需控制溫度，在較高溫度下進(jìn)行

合成的對(duì)象DNA分子DNA片段或基因

①模板：均需要脫氧核甘酸鏈作為模板進(jìn)行物質(zhì)合成；

②原料：均為四種脫氧核甘酸；

聯(lián)系③酶：均需要DNA聚合酶進(jìn)行催化；

④引物：均需要引物，使DNA聚合酶從引物的3,端開始連接脫氧

核昔酸

逑究點(diǎn)2基因表達(dá)載體的構(gòu)建

背景材料

1.基因表達(dá)載體的組成及作用

___________________啟動(dòng)子：轉(zhuǎn)錄的起點(diǎn)，在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中起

_----------------調(diào)控作用

FI的基因：能夠控制生物的特定性狀

11表達(dá)載體n

H%產(chǎn)廣制原點(diǎn)H，+終止子：轉(zhuǎn)作錄用的終點(diǎn)，在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中起調(diào)控

一士2—標(biāo)記基因:鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因

2.基因表達(dá)載體的構(gòu)建步驟

目的基因與載體的結(jié)合過(guò)程，實(shí)際上是不同來(lái)源的基因重組的過(guò)程。其過(guò)程大體為：用

一定的限制酶切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個(gè)切口，露出黏性末端。用同一種限制酶切割目的基因，

使其產(chǎn)生相同的黏性末端。將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的切口處，再加入適量DNA連接

酶，形成了一個(gè)重組DNA分子(重組質(zhì)粒)(如圖)。

(1)目的基因是指編碼蛋白質(zhì)的基因，其沒有啟動(dòng)子，若只將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞中將

無(wú)法進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。

(2)目的基因的表達(dá)需要調(diào)控序列，因而用作載體的質(zhì)粒的插入基因部位之前需要有啟動(dòng)

子，之后需要有終止子。

(3)鑒別目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞中需要有篩選標(biāo)記一一標(biāo)記基因。

因此，一個(gè)基因表達(dá)載體的組成應(yīng)該包括：?jiǎn)?dòng)子、終止子、目的基因、標(biāo)記基因等。

特別提醒：(1)由于受體細(xì)胞有動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、微生物細(xì)胞之分，以及目的基因?qū)?/p>

入受體細(xì)胞的方法不同，所以基因表達(dá)載體在構(gòu)建上也會(huì)有所差別，不可能是千篇一律的。

(2)基因表達(dá)載體的構(gòu)建過(guò)程中，最好用同種限制酶切割目的基因和載體，以獲得相同的

黏性末端，便于二者進(jìn)行連接。但有時(shí)可用兩種限制酶分別切割載體和目的基因，這樣可避

免載體與載體之間、目的基因與目的基因之間的自身連接，還可以確保目的基因和載體的正

向連接。

點(diǎn)!練回.

1.下列有關(guān)基因表達(dá)載體構(gòu)建的說(shuō)法，錯(cuò)誤的是()

A.基因表達(dá)載體的構(gòu)建是實(shí)施基因工程的核心

B.構(gòu)建基因表達(dá)載體是為了使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，可以遺傳給下一代，并

且使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用

C.啟動(dòng)子存在于基因的編碼區(qū)，是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，能驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄

D.標(biāo)記基因的作用是鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因

C［基因表達(dá)載體的構(gòu)建是實(shí)施基因工程的第二步，也是基因工程的核心。構(gòu)建基因表

達(dá)載體是為了使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，可以遺傳給下一代，同時(shí)，使目的基因能

夠表達(dá)和發(fā)揮作用。啟動(dòng)子存在于基因的非編碼區(qū)，是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，有了

它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄，最終翻譯出蛋白質(zhì)。載體上標(biāo)記基因的作用是鑒別受體細(xì)胞中是否含

有目的基因。所以只有C項(xiàng)是錯(cuò)誤的。］

2.請(qǐng)據(jù)圖回答下列問(wèn)題：

(1)基因工程的核心步驟是o

(2)利用技術(shù)可以獲得大量的目的基因。該技術(shù)利用的原理，將基因的

核甘酸序列不斷加以復(fù)制，使其數(shù)量呈指數(shù)增長(zhǎng)。

(3)圖中________位于基因的首端，是識(shí)別和結(jié)合的部位?？股乜剐曰?/p>

的作用是作為,用于鑒別受體細(xì)胞中是否導(dǎo)入了目的基因。

［解析］本題考查基因表達(dá)載體的組成及其構(gòu)建?；蚬こ痰暮诵牟襟E是基因表達(dá)載體

的構(gòu)建；獲取目的基因的方法有很多，其中PCR技術(shù)能迅速獲得大量的目的基因，依據(jù)的原

理是DNA復(fù)制；基因表達(dá)載體必須包含目的基因、啟動(dòng)子、標(biāo)記基因、終止子等，其中啟動(dòng)

子位于目的基因的首端，是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，可驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA,抗生素

抗性基因作為標(biāo)記基因，用于鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因。

［答案］（1）基因表達(dá)載體的構(gòu)建（2）PCRDNA復(fù)制（3）啟動(dòng)子RNA聚合酶標(biāo)記基

因

理究點(diǎn)0，^__________________WS的基吧人受體細(xì)胞

背景材料

1.轉(zhuǎn)化

目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過(guò)程。

名師提醒:

⑴此處的“轉(zhuǎn)化”與肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中的“轉(zhuǎn)化”含義相同。

（2）導(dǎo)入的目的基因，可能存在于細(xì)胞質(zhì)中，也可能整合到染色體DNA上。

2.基因工程中常用的受體細(xì)胞

微生物細(xì)胞（大腸桿菌、酵母菌等）和動(dòng)植物細(xì)胞。

原核生物作為受體細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)：繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對(duì)較少等。

3.常用的轉(zhuǎn)化方法

受體

細(xì)胞方法說(shuō)明特點(diǎn)

類型

經(jīng)濟(jì)、有效，適用于雙

農(nóng)桿將目的基因插入到農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的T-DNA上一轉(zhuǎn)入

子葉植物和裸子植物，

菌轉(zhuǎn)農(nóng)桿菌f用農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞一將目的基因整合

尤其適用于雙子葉植

化法到植物細(xì)胞染色體的DNA上一目的基因表達(dá)

物

植物

基因?qū)诮饘兕w粒表面的表達(dá)載體DNA打入受體細(xì)胞成本較高，常用于單子

細(xì)胞

槍法中一目的基因整合并表達(dá)葉植物

花粉在植物受粉后，花粉形成的花粉管還未愈合前，剪去

簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)，我國(guó)科學(xué)

管通柱頭一滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉

家獨(dú)創(chuàng)的一種方法

道法管通道進(jìn)入受體細(xì)胞一目的基因表達(dá)

將含有目的基因的表達(dá)載體提純一取卵（受精卵）一

顯微

動(dòng)物顯微注射一注射了目的基因的受精卵，經(jīng)胚胎早期培將目的基因?qū)雱?dòng)物

注射

細(xì)胞養(yǎng)后，移植到雌性動(dòng)物的輸卵管或子宮內(nèi)一獲得具有細(xì)胞最為有效的方法

技術(shù)

新性狀的動(dòng)物

Ca2+

微生用cl+處理微生物細(xì)胞一感受態(tài)細(xì)胞一將基因表達(dá)

處理

物細(xì)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合一在一定溫度下促進(jìn)感受態(tài)簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、有效

法

胞細(xì)胞吸收DNA分子

（感

受態(tài)

細(xì)胞

法)

特別提醒：(1)將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞培育轉(zhuǎn)基因植物時(shí)，受體細(xì)胞可以是體細(xì)胞和受

精卵，因?yàn)橹参矬w細(xì)胞具有全能性。

(2)將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞培育轉(zhuǎn)基因動(dòng)物時(shí)，受體細(xì)胞是受精卵，不能用體細(xì)胞，因

為高度分化的動(dòng)物體細(xì)胞的全能性受到限制。

(3)微生物細(xì)胞作為受體細(xì)胞具有繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對(duì)較少等優(yōu)點(diǎn)。

(4)將基因表達(dá)載體(重組質(zhì)粒)導(dǎo)入微生物細(xì)胞的常用方法是Ca"處理法(感受態(tài)細(xì)胞法)。

函對(duì)底練珈

1.科學(xué)家采用基因工程技術(shù)將矮牽牛中控制藍(lán)色色素合成的基因G轉(zhuǎn)移到玫瑰中，以培

育藍(lán)玫瑰。下列操作正確的是()

A.將基因G直接導(dǎo)入土壤農(nóng)桿菌，然后感染并轉(zhuǎn)入玫瑰細(xì)胞

B.將基因G導(dǎo)入玫瑰細(xì)胞后，即可通過(guò)植物組織培養(yǎng)培育出藍(lán)玫瑰

C.提取矮牽牛藍(lán)色花的mRNA,經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄獲得DNA,再擴(kuò)增基因G

D.將基因G導(dǎo)入玫瑰細(xì)胞液泡中，防止其經(jīng)花粉進(jìn)入野玫瑰

C［目的基因需要和載體連接形成重組質(zhì)粒后再導(dǎo)入農(nóng)桿菌，然后感染并轉(zhuǎn)入玫瑰細(xì)胞,

A錯(cuò)誤；將基因G導(dǎo)入玫瑰細(xì)胞后，還要檢測(cè)和篩選出含有目的基因的受體細(xì)胞，然后再通過(guò)

植物組織培養(yǎng)培育出藍(lán)玫瑰，B錯(cuò)誤；提取矮牽牛藍(lán)色花的mRNA,經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄得到DNA,然后擴(kuò)

增，可獲得大量的基因B,方法為逆轉(zhuǎn)錄法，C正確；細(xì)胞液泡中不含基因，因此不能將基因

G導(dǎo)入液泡中，可將基因G導(dǎo)入葉綠體或線粒體中，這樣可防止其經(jīng)花粉進(jìn)入野玫瑰，D錯(cuò)誤。］

2.基因工程中，受體細(xì)胞的不同，導(dǎo)入目的基因的方法也不同。請(qǐng)回答下列問(wèn)題：

(1)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法常用來(lái)將外源基因轉(zhuǎn)入細(xì)胞，具體操作時(shí)，先要將目的基因插

入農(nóng)桿菌質(zhì)粒的T-DNA中，然后用該農(nóng)桿菌感染植物細(xì)胞。農(nóng)桿菌在自然條件下，

不容易感染________植物。農(nóng)桿菌侵染植物，能夠?qū)⒛康幕虿迦胫参锛?xì)胞的_______上。

(2)將重組質(zhì)粒導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞，常采用的方法。若用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，一

般情況下，不能直接用未處理的大腸桿菌作為受體細(xì)胞，原因是未處理的大腸桿菌吸收質(zhì)粒

(外源DNA)的能力極弱。所以，用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌時(shí)，常先用處理大腸桿菌，

使較多的細(xì)胞成為細(xì)胞以利于表達(dá)載體的進(jìn)入。

(3)目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞引起生物性狀的改變，屬于可遺傳變異中的(變異類

型)。

［解析］(1)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法常用來(lái)將外源基因轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞，具體操作時(shí)，先要將目的基

因插入農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的T-DNA中，然后用該農(nóng)桿菌感染植物細(xì)胞。農(nóng)桿菌在自然條件下，不

容易感染單子葉植物。農(nóng)桿菌侵染植物后，能夠?qū)i質(zhì)粒上的T-DNA攜帶的目的基因插入到

植物細(xì)胞的染色體DNA上。

(2)將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞最常用的方法是顯微注射法。若用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，

一般情況下，不能直接用未處理的大腸桿菌作為受體細(xì)胞，原因是未處理的大腸桿菌吸收質(zhì)

粒(外源DNA)的能力極弱。所以，用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌時(shí)，常先用Ca?+處理大腸桿菌，使

較多的細(xì)胞成為感受態(tài)細(xì)胞以利于表達(dá)載體的進(jìn)入。

(3)基因工程的原理為基因重組。

［答案］(1)植物Ti單子葉染色體DNA

(2)顯微注射Ca2+感受態(tài)

(3)基因重組

埒究點(diǎn)中目的基因的檢測(cè)與鑒定

背景材料

目的基因在受體細(xì)胞內(nèi)能夠維持穩(wěn)定和表達(dá)其遺傳特性，需要逐步進(jìn)行檢測(cè)。示意圖如

下：

目的基因片段

*\/\/\AACGGTCATGTCGCATGCTAGX/\f、r

*C^^yyyATGCCAGTACAGCGTACGATCVyvy',''

“基因探針

非目的基因片段GTACAGCGTA

八，、八ZGACATAGCTACAx八/、

"\>\^CTCTAyCGATGTvxZ'：/ifcWttfete

R的基因片段，\,，\/\/TACCC?陰甯:CCTA八八/、/

城W\J\J基因探針，

目的基因的檢測(cè)示意圖

［思考交流］

1.上圖采用技術(shù)，目的是要檢測(cè)什么？

提示：DNA分子雜交檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物的染色體DNA上是否插入了目的基因。

2.什么是基因探針？

提示：一段用放射性同位素標(biāo)記，且與目的基因或特定的靶分子序列互補(bǔ)的核酸序列。

如果出現(xiàn)雜交帶，就表明目的基因已插入染色體DNA中或已經(jīng)轉(zhuǎn)錄出了mRNAo

3.如果要檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA,需要采用技術(shù)，與基因探針雜交的

是什么物質(zhì)？

提示：分子雜交從受體植物中提取的mRNA。

4.檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)，采用法。具體做法又如何？

提示：抗原一抗體雜交從轉(zhuǎn)基因生物中提取蛋白質(zhì)，用相應(yīng)的抗體進(jìn)行抗原一抗體雜

交，若有雜交帶出現(xiàn)，表明目的基因已形成蛋白質(zhì)產(chǎn)品。

［歸納總結(jié)］

1.操作目的

目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞后，是否可以穩(wěn)定維持和表達(dá)其遺傳特性，只有通過(guò)檢測(cè)與鑒定

才能知道。這是基因工程的第四步工作，也是檢查基因工程是否做成功的一步。

2.目的基因的檢測(cè)與鑒定的方法比較

類型檢測(cè)內(nèi)容方法結(jié)果顯示

目的基因是否插入轉(zhuǎn)基

DNA分子雜交技術(shù)（DNA和DNA之間）

因生物的DNA上

分子水目的基因是否轉(zhuǎn)錄出是否成功顯示

核酸分子雜交技術(shù)（DNA和mRNA之間）

平檢測(cè)mRNA出雜交帶

目的基因是否翻譯成蛋抗原一抗體雜交（蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)之

白質(zhì)間）

是否具有抗性及抗性程

個(gè)體生對(duì)轉(zhuǎn)基因生物進(jìn)行抗性的接種實(shí)驗(yàn)是否賦予了

度

物學(xué)水預(yù)期抗性或

基因工程產(chǎn)品與天然產(chǎn)比較基因工程產(chǎn)品與天然產(chǎn)品的功能

平鑒定蛋白質(zhì)活性

品的功能活性是否相同活性

注意：①DNA分子雜交和核酸分子雜交（DNA和mRNA之間）的依據(jù)均是堿基互補(bǔ)配對(duì)原則。

②探針就是用放射性同位素或熒光分子標(biāo)記的含目的基因的單鏈DNA片段。

點(diǎn)!練回.

1.下列關(guān)于目的基因表達(dá)情況檢測(cè)與鑒定方法中錯(cuò)誤的是（）

A.用顯微鏡觀察染色體的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，從而檢測(cè)受體細(xì)胞是否導(dǎo)入了目的基因

B.采用分子雜交技術(shù)檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA

C.用相應(yīng)的抗體進(jìn)行抗原一抗體雜交檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)

D.做抗蟲或抗病的接種實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物是否具有抗性以及抗性的程度

A［檢測(cè)受體細(xì)胞是否導(dǎo)入了目的基因，用顯微鏡觀察不到，但可以利用DNA分子雜交

技術(shù)檢測(cè)，A錯(cuò)誤；采用分子雜交技術(shù)檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA,B正確；通過(guò)抗原一抗

體雜交檢測(cè)目的基因是否翻譯成了蛋白質(zhì)，C正確；做抗蟲或抗病的接種實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物

是否具有抗性以及抗性的程度，D正確。］

2.下圖是利用基因工程培育抗蟲植物的示意圖，以下相關(guān)敘述，正確的是（）

、導(dǎo)人植

構(gòu)建表達(dá)載體物細(xì)胞

含重組Ti質(zhì)粒

Ti質(zhì)粒含抗蟲基因重組Ti質(zhì)粒的農(nóng)桿菌植物細(xì)胞植株

的DNA

①③④⑤

A.①一②過(guò)程中使用了限制酶和DNA聚合酶

B.③一④過(guò)程利用了細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)特性，在光學(xué)顯微鏡下觀察③細(xì)胞中的重組Ti質(zhì)粒

是篩選標(biāo)志之一

C.應(yīng)用DNA探針技術(shù)，可檢測(cè)④細(xì)胞中目的基因是否表達(dá)

D.一般情況下，⑤只要表現(xiàn)出抗蟲性狀，就表明植株發(fā)生了可遺傳變異

D［①一②過(guò)程表示基因表達(dá)載體的構(gòu)建，該過(guò)程中使用了限制酶和DNA連接酶,A錯(cuò)誤;

光學(xué)顯微鏡下無(wú)法觀察到重組Ti質(zhì)粒，該基因工程可以從個(gè)體生物學(xué)水平上進(jìn)行鑒定，即檢

測(cè)植株的葉片是否具有抗蟲效果，B錯(cuò)誤；檢測(cè)④細(xì)胞中目的基因是否表達(dá)需要利用抗原一抗

體雜交技術(shù)，C錯(cuò)誤；一般情況下，⑤只要表現(xiàn)出抗蟲性狀，就表明植株發(fā)生了可遺傳變異，

D正確。］

［課堂小結(jié)］

知識(shí)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建核心語(yǔ)句歸納

1.基因工程的基本操作程序有：（1）目的

基因的獲??；（2）基因表達(dá)載體的構(gòu)建；

（3）將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞；（4）目的基

因的檢測(cè)與鑒定。

2.目的基因是指編碼蛋白質(zhì)的基因和具

有調(diào)控作用的因子。其獲取方法有：（1）

從基因文庫(kù)中獲??；（2）利用PCR技術(shù)獲

??；（3）人工合成。

3.基因表達(dá)載體由目的基因、啟動(dòng)子、終

止子和標(biāo)記基因組成。

4.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法有：

（1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法；（2）基因槍法；（3）花

粉管通道法。

5.將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞常用的方法

是顯微注射法。

6.目的基因的檢測(cè)方法有DNA分子雜交技

術(shù)、分子雜交技術(shù)和抗原一抗體雜交技

術(shù)。有時(shí)還需進(jìn)行個(gè)體生物學(xué)水平的鑒

定。

當(dāng)堂達(dá)標(biāo)。國(guó)以基

DANGTANGDABIAQGUSHUANGJI

1.下圖表示基因工程中獲取水稻某目的基因的不同方法。下列相關(guān)敘述中正確的是

方法aDZ,方法卜方法。

mRNA

皿，，，，，，，，.核甘酸、酶等

.i1T

-TTT-rTTT+TTTTT—DNA___"+11⑨..+...公

I..I.I..r.I.IIIIIIIIIIII1I1IiIiI1I1I1I111—vAz11.1..1.1.1.1.1?1i1i11i—??

A.三種方法都需要酶并均在體外進(jìn)行

B.①②③堿基對(duì)的排列順序均相同

C.三種方法均屬于人工合成法

D.方法a不遵循中心法則

A［這三種方法都是在體外進(jìn)行的，且都用到酶（方法a需要逆轉(zhuǎn)錄酶和DNA聚合酶，方

法b需要限制酶，方法c需要DNA聚合酶），A正確；通過(guò)方法a得到的目的基因不含有內(nèi)含

子，通過(guò)方法c得到的目的基因的堿基序列可能有多種，因此①②③堿基對(duì)的排列順序不都

相同，B錯(cuò)誤；圖示a和c屬于人工合成法，而b是從供體細(xì)胞的DNA中直接分離目的基因的

方法，C錯(cuò)誤；方法a遵循中心法則，D錯(cuò)誤。］

2.農(nóng)桿菌中含有一個(gè)大型的Ti質(zhì)粒（如圖所示），在侵染植物細(xì)胞的過(guò)程中，其中的T-DNA

片段轉(zhuǎn)入植物的基因組。若想用基因工程并通過(guò)農(nóng)桿菌向某種植物中導(dǎo)入抗旱基因，以下分

析不合理的是（）

用

于

轉(zhuǎn)T

的復(fù)制方向I

移

基D

TN

因—A

D

N

A