VEGF的生物學(xué)基礎(chǔ)與朗沐藥學(xué)

VEGF生物學(xué)基礎(chǔ)(jīchǔ)與朗沐藥學(xué)基礎(chǔ)(jīchǔ)知識(shí)陶杉aoshanshan@共四十六頁(yè)目錄(mùlù)VEGF的生物學(xué)基礎(chǔ)康柏西普的藥學(xué)基礎(chǔ)共四十六頁(yè)VEGF的定義(dìngyì)VEGF：VascularEndothelialGrowthFactor，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，是一類多功能的細(xì)胞因子，在血管生成和淋巴管生成中具有直接和間接的調(diào)控作用。VEGF主要有7種亞型：VEGF-A，VEGF-B，VEGF-C，VEGF-D，VEGF-E，VEGF-F和PlGF（PlacentaGrowthFactor）。其中(qízhōng)只有VEGF-A，VEGF-B和PlGF與血管新生相關(guān)。共四十六頁(yè)VEGF的分子結(jié)構(gòu)(fēnzǐjiéɡòu)VEGF-A的基因經(jīng)過(guò)剪切拼接后可形成不同單體，如121,165,183等。數(shù)字代表相應(yīng)的氨基酸殘基數(shù)量(shùliàng)。其中VEGF165是眼部新生血管的主要誘因。VEGF通常以同源二聚體的形式存在，2個(gè)亞基的分子質(zhì)量（MW）為17－23kDa，通過(guò)兩對(duì)二硫鍵共價(jià)連接。kDa:kiloDalton，千道爾頓，也寫作kD。共四十六頁(yè)VEGF的合成(héchéng)和靶細(xì)胞所有(suǒyǒu)眼部分布血管的組織都可合成表達(dá)VEGF，相關(guān)細(xì)胞包括：視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞（retinalpigmentepithelium，RPE），周皮細(xì)胞（也稱周細(xì)胞），內(nèi)皮細(xì)胞，穆勒細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞等。VEGF的主要靶向細(xì)胞為血管內(nèi)皮細(xì)胞RPE視網(wǎng)膜外層穆勒細(xì)胞視網(wǎng)膜中層視網(wǎng)膜內(nèi)層視網(wǎng)膜感覺(jué)神經(jīng)細(xì)胞共四十六頁(yè)VEGF的作用(zuòyòng)1.VEGF可以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和存活；2.VEGF可以增加(zēngjiā)血管通透性，擴(kuò)張血管；3.VEGF可以聚集血管前體細(xì)胞和單核細(xì)胞。共四十六頁(yè)VEGFR的定義(dìngyì)VEGFR：VascularEndothelialGrowthFactorRceptor，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體，是一類受體酪氨酸激酶跨膜糖蛋白，與VEGF結(jié)合后通過(guò)構(gòu)象變化和磷酸化傳遞相應(yīng)信號(hào)(xìnhào)。VEGFR主要有3種亞型：VEGFR-1，VEGFR-2和VEGFR-3。VEGF刺激內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、增加血管的通透性和新血管的生成作用主要是通過(guò)結(jié)合和激活VEGFR-2來(lái)實(shí)現(xiàn)的。VEGFR-3不參與血管新生信號(hào)通路中。共四十六頁(yè)VEGF受體的分子結(jié)構(gòu)(fēnzǐjiéɡòu)VEGFR平時(shí)以單體形式存在。分為胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)三大部分。胞外區(qū)部分由7個(gè)與免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig)結(jié)構(gòu)相似的結(jié)構(gòu)域組成(zǔchénɡ)。胞內(nèi)區(qū)部分屬于酪氨酸激酶區(qū)，可以發(fā)生自磷酸化來(lái)向下游傳遞信號(hào)。共四十六頁(yè)VEGF受體的分子結(jié)構(gòu)(fēnzǐjiéɡòu)VEGFR的胞外區(qū)的7個(gè)免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)從N端開始依次命名為D1-D7。VEGFR-1（Flt-1）可以結(jié)合(jiéhé)VEGF-A、VEGF-B和PlGF，其D2區(qū)就是與配體結(jié)合的位點(diǎn)。VEGFR-2（KDR，F(xiàn)lk-1）只能結(jié)合VEGF-A，其D2和D3區(qū)是配體結(jié)合位點(diǎn)，D3區(qū)對(duì)于配體結(jié)合的專一性起作用。D4區(qū)對(duì)受體的二聚體化很關(guān)鍵，并可增強(qiáng)VEGF與VEGFR的結(jié)合速率。D1D7共四十六頁(yè)VEGF與眼部新生血管疾病(jíbìng)有關(guān)證據(jù)：①脈絡(luò)膜新生血管膜中檢測(cè)到VEGF165，VEGF-B和PlGF；②PDR（增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變）患者的玻璃體腔中PlGF的濃度明顯升高；③眼內(nèi)注射VEGF會(huì)引起和DR相同的表現(xiàn)，如微動(dòng)脈瘤、出血、視網(wǎng)膜和虹膜(hóngmó)新生血管。以上說(shuō)明，VEGF與眼部新生血管疾病有關(guān)：1.從通透性到新生血管構(gòu)建，視網(wǎng)膜脈管系統(tǒng)的病態(tài)改變都與VEGF表達(dá)量增加有關(guān)。2.僅需VEGF就可觸發(fā)眼內(nèi)新生血管形成。3.抑制VEGF可改善眼部功能和結(jié)構(gòu)。共四十六頁(yè)VEGF表達(dá)增加(zēngjiā)的誘因缺氧、炎癥和機(jī)械力會(huì)上調(diào)細(xì)胞(xìbāo)合成VEGF。共四十六頁(yè)VEGF的作用(zuòyòng)機(jī)制VEGF結(jié)合(jiéhé)到VEGFR，通過(guò)D4區(qū)使其發(fā)生二聚體化現(xiàn)象，VEGF則橋接在受體的D2區(qū)或者D2和D3區(qū)之間。共四十六頁(yè)VEGF的作用(zuòyòng)機(jī)制VEGF與VEGFR的結(jié)合會(huì)引發(fā)受體構(gòu)象變化和自磷酸化，并使下游蛋白發(fā)生磷酸化，傳遞血管新生(xīnshēng)和血管滲漏的信號(hào)。PP共四十六頁(yè)眼部新生(xīnshēng)血管類疾病種類VEGF誘發(fā)的病態(tài)性血管新生疾病主要分為兩種：腫瘤和眼部新生血管失調(diào)(shītiáo)。眼部新生血管疾病根據(jù)臨床表現(xiàn)又可分為三種：增殖型（Proliferation），滲漏型（leakage）和增殖滲漏型（Proliferationandleakage）。增殖型眼病：增殖型糖尿病視網(wǎng)膜病變（PDR），早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變（ROP），新生血管性青光眼（NVG）滲漏型眼?。阂暰W(wǎng)膜靜脈阻塞（RVO），糖尿病黃斑水腫（DME），中心性漿液性脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜病變（CSC）增殖滲漏型眼病：濕性年齡相關(guān)性黃斑變性（wAMD），視網(wǎng)膜血管瘤增殖（RAP），病理性近視CNV（pmCNV）共四十六頁(yè)眼部新生血管(xuèguǎn)類疾病的拮抗途徑1.移除誘導(dǎo)VEGF表達(dá)量增加(zēngjiā)的條件：全視網(wǎng)膜激光光凝術(shù)，玻璃體切割術(shù)——改善視網(wǎng)膜內(nèi)氧環(huán)境，降低低氧誘導(dǎo)的VEGF表達(dá)；2.下調(diào)VEGF和VEGFR的表達(dá)：眼內(nèi)注射曲安奈德，地塞米松3.阻斷VEGF與VEGFR的結(jié)合：哌加他尼鈉——特異性結(jié)合VEGF-A165；貝伐單抗，雷尼單抗——結(jié)合所有VEGF-A；阿柏西普，康柏西普——結(jié)合所有VEGF-A、VEGF-B和PlGF。共四十六頁(yè)康柏西普的生物學(xué)與藥學(xué)(yàoxué)基礎(chǔ)共四十六頁(yè)康柏西普的來(lái)歷(láilì)抗VEGF藥物的阻斷途徑(tújìng)：1.通過(guò)結(jié)合VEGF使之不能再與VEGFR結(jié)合2.通過(guò)結(jié)合VEGFR使VEGF不能再與受體結(jié)合單抗類藥物均采用了阻斷途徑1通過(guò)雜交瘤細(xì)胞技術(shù)獲得。VEGF-AVEGF-AVEGF-A貝伐單抗，Avastin雷珠單抗，Ranibizumab共四十六頁(yè)雷珠單抗生產(chǎn)工藝?yán)字閱慰购拓惙慰棺铋_始是以單克隆抗體技術(shù)制備篩選的。單克隆抗體技術(shù)又叫雜交瘤細(xì)胞技術(shù)，是融合了小鼠脾細(xì)胞和小鼠骨髓瘤細(xì)胞來(lái)生產(chǎn)抗體的技術(shù)。因?yàn)樾∈笃⒓?xì)胞經(jīng)過(guò)特定抗原（VEGF）刺激后會(huì)產(chǎn)生分泌相應(yīng)抗體（抗VEGF抗體，如貝伐單抗），但是小鼠脾細(xì)胞不能繁殖，如果需要較多量的穩(wěn)定單抗，就要把脾細(xì)胞與可以(kěyǐ)無(wú)限繁殖的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，這樣既可以(kěyǐ)分泌抗體又能保持細(xì)胞永生。由于VEGF刺激的是小鼠脾細(xì)胞，因此產(chǎn)生的抗體無(wú)可避免都會(huì)有鼠源性的氨基酸序列。而且由于抗體的可變性，不同次的刺激可能產(chǎn)生不同的抗體，因此最后是在多種抗體中篩選出貝伐單抗和雷珠單抗的全體。然后對(duì)這兩個(gè)單抗的氨基酸序列（雷珠是Fab片段的序列）進(jìn)行鑒定后即可根據(jù)基因密碼子表獲得相應(yīng)的DNA，然后將DNA序列轉(zhuǎn)入大腸桿菌中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，就能大批量培養(yǎng)獲得穩(wěn)定的雷珠單抗了。因?yàn)橛么竽c桿菌表達(dá)蛋白一般來(lái)說(shuō)快速方便穩(wěn)定又便宜。共四十六頁(yè)康柏西普的來(lái)歷(láilì)抗體存在兩個(gè)問(wèn)題：1.抗體的高度特異性使其只能與VEGF的一個(gè)亞型VEGF-A結(jié)合(jiéhé)，而不表現(xiàn)出對(duì)VEGF-B和胎盤生長(zhǎng)因子（PlGF）的親和力；2.雜交瘤細(xì)胞技術(shù)生產(chǎn)的抗體部分氨基酸組成和序列是鼠源性的，而非全人源化蛋白。共四十六頁(yè)康柏西普的來(lái)歷(láilì)VEGF的各亞型都通過(guò)結(jié)合VEGFR-1和2來(lái)發(fā)揮作用。模擬受體與VEGF結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)，可降低免疫原性，并能與所有VEGF亞型結(jié)合。VEGFR-1和2的胞外域是與VEGF上的不同位點(diǎn)結(jié)合，因此這種模擬受體需要融合VEGFR-1和2兩種蛋白的配體結(jié)合位點(diǎn)才能(cáinéng)完全抑制VEGF與受體的結(jié)合。共四十六頁(yè)康柏西普的來(lái)歷(láilì)FP3表現(xiàn)出最高的VEGF的親和力，最強(qiáng)的抑制人臍靜脈(jìngmài)內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）增殖的能力。VEGFR-1VEGFR-2共四十六頁(yè)康柏西普的分子量約為143kD,其受體樣區(qū)域是同源二聚體樣結(jié)構(gòu)，很好地模擬了VEGFR與VEGF結(jié)合的活性形態(tài)康柏西普的7個(gè)糖基化位點(diǎn)均發(fā)生糖基化，使得(shǐde)康柏西普的pI值在5.68-7.47之間，對(duì)眼部刺激性小D4區(qū)使得二聚體樣結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定更方便VEGF的橋接，也具有更快的VEGF結(jié)合速度?？蛋匚髌盏慕Y(jié)構(gòu)(jiégòu)共四十六頁(yè)康柏西普生產(chǎn)工藝康柏西普最開始是從人VEGF受體1和受體2的胞外免疫球蛋白樣區(qū)域分別隨機(jī)融合并連上人IgG的Fc片段形成的融合蛋白中篩選出來(lái)的，這種融合就是將表達(dá)這些蛋白區(qū)域的DNA序列通過(guò)連接酶有序地連接在一起，再轉(zhuǎn)入CHO細(xì)胞中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)即可獲得。由于DNA對(duì)應(yīng)的蛋白均為人源化蛋白，因此康柏西普是100%全人源化的蛋白。之所以選用CHO細(xì)胞，一是因?yàn)榇竽c桿菌中沒(méi)有輔助真核蛋白正確折疊形成活性狀態(tài)的酶，因此表達(dá)出的分子不可溶、無(wú)活性，而CHO作為真核細(xì)胞，這些酶是有的；二是因?yàn)榭蛋匚髌盏鞍咨嫌卸鄠€(gè)糖基化位點(diǎn)，而大腸桿菌不能對(duì)人源化的糖基化位點(diǎn)進(jìn)行糖基化，也會(huì)影響蛋白的狀態(tài)和活性；第三(dìsān)是因?yàn)镃HO細(xì)胞表達(dá)技術(shù)是現(xiàn)在真核表達(dá)細(xì)胞中相對(duì)成熟穩(wěn)定的技術(shù)，已經(jīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。共四十六頁(yè)康柏西普的活性研究(yánjiū)康柏西普的體外活性研究(yánjiū)康柏西普的體內(nèi)活性研究

共四十六頁(yè)康柏西普的體外活性研究(yánjiū)ELISA檢測(cè)(jiǎncè)FP1、FP3和貝伐單抗對(duì)VEGF的親和力

FP1：阿柏西普；FP3：康柏西普康柏西普顯示出更高的VEGF親和力。貝伐單抗的特異性使其不能與VEGF-B和VEGF-C以及PlGF結(jié)合。共四十六頁(yè)康柏西普：EC50=28pM

雷珠單抗：EC50=50pMEC50：半數(shù)有效濃度，即能引起50%最大效應(yīng)(xiàoyìng)的藥物濃度。EC50值越大，說(shuō)明藥物的作用越低。康柏西普和雷珠單抗對(duì)VEGF誘導(dǎo)(yòudǎo)的HUVEC增殖活性的影響康柏西普的體外活性研究共四十六頁(yè)康柏西普對(duì)HUVEC遷移的抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴性，其IC50為7nM。IC50：半數(shù)(bànshù)抑制濃度，

即能引起50%抑制效應(yīng)的藥物濃度。IC50值越大，說(shuō)明藥物的作用越低?？蛋匚髌諏?duì)VEGF誘導(dǎo)(yòudǎo)的HUVEC細(xì)胞遷移過(guò)程的影響康柏西普的體外活性研究共四十六頁(yè)康柏西普可顯著抑制VEGF誘導(dǎo)的微血管萌芽和毛細(xì)血管(máoxìxuèɡuǎn)樣網(wǎng)絡(luò)形成。康柏西普對(duì)VEGF誘導(dǎo)的微血管萌芽和毛細(xì)血管(máoxìxuèɡuǎn)樣網(wǎng)絡(luò)形成的影響康柏西普的體外活性研究共四十六頁(yè)500ng/mL的康柏西普即可達(dá)到最大結(jié)合(jiéhé)人視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞（HREC）分泌的VEGF165的作用，也可顯著降低游離的PlGF濃度?？蛋匚髌諏?duì)高糖誘導(dǎo)的HREC分泌(fēnmì)VEGF-165和PlGF的影響康柏西普的體外活性研究共四十六頁(yè)500ng/mL的康柏西普可有效抑制(yìzhì)高糖誘導(dǎo)的HREC的遷移?？蛋匚髌諏?duì)高糖誘導(dǎo)的HREC遷移(qiānyí)的影響康柏西普的體外活性研究共四十六頁(yè)500ng/mL的康柏西普可有效(yǒuxiào)抑制高糖誘導(dǎo)HREC形成毛細(xì)血管樣網(wǎng)絡(luò)?？蛋匚髌諏?duì)高糖誘導(dǎo)的HREC成網(wǎng)過(guò)程(guòchéng)的影響康柏西普的體外活性研究共四十六頁(yè)康柏西普治療組的滲漏明顯比未治療組少，說(shuō)明康柏西普可抑制新生血管(xuèguǎn)生成。

低氧誘導(dǎo)小鼠缺血性視網(wǎng)膜病變抑制(yìzhì)實(shí)驗(yàn)的眼底造影康柏西普的體內(nèi)活性研究共四十六頁(yè)激光(jīguāng)后立刻注射康柏西普，之后B組每周注射一次，C組兩周注射一次。B組和C組的滲漏明顯比未治療組少，說(shuō)明康柏西普可預(yù)防新生血管生成。

康柏西普預(yù)防(yùfáng)恒河猴激光灼傷CNV實(shí)驗(yàn)的眼底造影康柏西普的體內(nèi)活性研究共四十六頁(yè)康柏西普抑制恒河猴激光(jīguāng)灼傷CNV實(shí)驗(yàn)的OCT結(jié)果激光(jīguāng)灼傷恒河猴后20天，治療組分別注射康柏西普500、300和100μg，并在注射8天后觀察。相比對(duì)照組，8天后治療組均未觀察到高反射回聲區(qū)，RPE恢復(fù)連續(xù)性，黃斑水腫消除，說(shuō)明康柏西普可有效抑制CNV?？蛋匚髌盏捏w內(nèi)活性研究共四十六頁(yè)康柏西普抑制恒河猴激光(jīguāng)灼傷CNV實(shí)驗(yàn)的FFA結(jié)果-500μg組激光灼傷20天后(tiānhòu)，注射0天注射14天后注射28天后康柏西普的體內(nèi)活性研究共四十六頁(yè)ZhangMing,etal.Ophthalmology.2011Apr;118(4):672-8.康柏西普治療后42天，患者BCVA平均提高了19.61個(gè)字母。中央視網(wǎng)膜厚度(hòudù)平均降低了77.19μm。康柏西普的體內(nèi)(tǐnèi)活性研究共四十六頁(yè)康柏西普3.0mg組的患者基線和治療(zhìliáo)42天后OCT與FFA結(jié)果ZhangMing,etal.Ophthalmology.2011Apr;118(4):672-8.康柏西普的體內(nèi)(tǐnèi)活性研究共四十六頁(yè)康柏西普的藥物代謝(dàixiè)動(dòng)力學(xué)研究康柏西普的兔眼藥代動(dòng)力學(xué)研究(yánjiū)康柏西普的恒河猴藥代動(dòng)力學(xué)研究

共四十六頁(yè)重要藥代指標(biāo)：Cmax：最大藥物(yàowù)濃度，給藥后體內(nèi)檢測(cè)到的最大藥物(yàowù)濃度。Tmax：達(dá)峰時(shí)間，到達(dá)Cmax的時(shí)間，所需時(shí)間越短，說(shuō)明藥物分散越快。t1/2：藥物清除半衰期，藥物濃度下降一半所需要的時(shí)間，值越大說(shuō)明藥物在體內(nèi)存留時(shí)間越長(zhǎng)。藥物代謝(dàixiè)動(dòng)力學(xué)的指標(biāo)共四十六頁(yè)康柏西普的兔眼藥(yǎnyào)代動(dòng)力學(xué)研究玻璃(bōlí)體腔注射0.5mg(A,Group1)和1.5mg(B,Group2)康柏西普在玻璃體、房水、脈絡(luò)膜-PRE、視網(wǎng)膜中的藥代參數(shù)

康柏西普注射玻璃體腔后6-12h內(nèi)在各組織中達(dá)到最高藥濃度，之后以單指數(shù)模式下降，說(shuō)明在濃度梯度推動(dòng)下會(huì)快速分散到玻璃體腔及周圍組織。雷珠單抗在玻璃體腔中的Tmax為24h，但Cmax只有162μg/mL，t1/2為2.88天。共四十六頁(yè)康柏西普的兔藥代動(dòng)力學(xué)研究(yánjiū)康柏西普在血清(xuèqīng)中的時(shí)藥濃度

Group1:玻璃體腔注射0.5mg;Group2:玻璃體腔注射1.5mg;Group3:靜脈注射3mg玻璃體腔注射后血清中康柏西普的濃度較低，在6-12天后檢測(cè)不到。靜脈注射后康柏西普以雙指數(shù)模式消除，半衰期短于玻璃體腔注射。共四十六頁(yè)給予健康猴子單次注射康柏西普，并分別在2、7、15天檢測(cè)眼部組織中的康柏西普濃度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在注射后15天依然可以在眼部組織中檢測(cè)到康柏西普，且玻璃體腔中濃度最高，說(shuō)明玻璃體腔中的康柏西普可以長(zhǎng)期良好地分布到周圍(zhōuwéi)組織中，具有較