外科學(xué)與分子生物學(xué)Surgerymolecularbiology

外科學(xué)與分子生物學(xué)

Surgery&molecularbiology

于穎彥上海消化外科研究所Definition:是在分子水平闡述核酸與蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用，闡述基因表達(dá)與調(diào)控機(jī)理的科學(xué)DNA分子雙螺旋結(jié)構(gòu)：goldenhelixCrick(物理學(xué)家),Watson(生物學(xué)家).Nature,19531962年榮獲諾貝爾生理學(xué)與醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)現(xiàn)代分子生物學(xué)誕生DNA：deoxyribonucleicacid：

是具有保存、復(fù)制信息，并可在細(xì)胞與細(xì)胞之間，親代與子代之間傳遞信息的生物大分子

結(jié)構(gòu)：兩條緞帶樣結(jié)構(gòu)盤繞成梯形雙螺旋結(jié)構(gòu)，呈致密線圈狀存在于細(xì)胞核的染色體內(nèi)。緞帶結(jié)構(gòu)是核糖與磷酸構(gòu)成的骨架；內(nèi)部階梯是堿基對(duì)

堿基對(duì)：A-T，C-G

A:adenineT:thymine

C:cytosineG:guanine

DNA的半保留復(fù)制：子代DNA雙鏈一條來自親代，另一條為新合成的互補(bǔ)鏈，子鏈?zhǔn)悄告湹臏?zhǔn)確抄本，由此構(gòu)成了遺傳保守性DNA半保留復(fù)制logo分子生物學(xué)中心法則centraldogma：DNA指導(dǎo)RNA合成，RNA指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成，而特異性蛋白質(zhì)又反過來催化DNA、RNA合成”以上字母組成多個(gè)詞：ATGCTCGAATAAATGTGAATTTGA以上句子就是基因DNA的每條單鏈由很多字母組成：ATGCTCGAATAAATGTGAATTTGA以上單詞構(gòu)成了句子：[ATGCTCGAATAA][ATGTGAATTTGA]基因：是負(fù)載特定遺傳信息的DNA分子片段。是編碼一個(gè)RNA分子所必須的DNA序列，RNA是充當(dāng)DNA與蛋白質(zhì)合成間的信使，DNA發(fā)布制造蛋白質(zhì)（Protein）的命令基因組（genome）：構(gòu)成細(xì)胞DNA的大約60億個(gè)堿基，組成的全套基因。除了同卵雙胞胎外，每個(gè)各體堿基序列均不相同，使得每一各體都有各自的特點(diǎn)染色體：chromosome：是基因的載體，人類體細(xì)胞含46條染色體，44條為常染色體，另兩條為性染色體，在女性為XX，男性為XY突變：Mutation,即構(gòu)成基因的DNA字母發(fā)生改變GenemutationGenemutation單核苷酸多態(tài)性：singlenucleotidepolymorphism,SNP

即構(gòu)成基因的DNA字母發(fā)生改變。與基因突變的差別在于，突變在群體中的發(fā)生頻率小于1%，而多態(tài)性在群體中的出現(xiàn)頻率大于1%Geneexpression真核生物的基因由編碼序列和非編碼序列組成。前者稱為外顯子（exon）；后者稱為內(nèi)含子（intron）。兩者相嵌排列。內(nèi)含子被切掉后外顯子拼接起來轉(zhuǎn)錄為基因產(chǎn)物。每一個(gè)基因首位和末位外顯子外側(cè)均有一段不被轉(zhuǎn)錄與翻譯的非編碼區(qū)，參與轉(zhuǎn)錄與翻譯的調(diào)控。此區(qū)含有與RNA聚合酶結(jié)合并啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子（promotor），使基因高效轉(zhuǎn)錄的增強(qiáng)子（enhancer），使轉(zhuǎn)錄終止的終止子（terminator）Regulationofgeneexpression基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控20世紀(jì)80年代1外科已能有效的控制創(chuàng)傷與感染2外科研究的主體轉(zhuǎn)向腫瘤研究3外科的優(yōu)勢：最易獲得人類腫瘤材料4外科分子生物學(xué)的提出研究內(nèi)容01細(xì)胞增殖與凋亡02Cellproliferationandapoptosis03腫瘤為主要研究對(duì)象，揭示細(xì)胞周期失控的類型與機(jī)制，為分子診斷與基因治療提供依據(jù)04目標(biāo)05外科疾病的基因診斷與基因治療061原癌基因：protooncogene，原本存在于正常細(xì)胞中，表示C-myc2癌基因：oncogene，具有使正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化為腫瘤的基因，或稱transforminggene。由小寫字母表示，如myc3腫瘤抑制基因：4tumorsupressorgene5抗癌基因：antioncogene6他們的失活或功能丟失，使細(xì)胞周期失去負(fù)性調(diào)控，正常細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槟[瘤細(xì)胞OncogeneTumorsuppressorgeneDNA損傷：

生物體的內(nèi)外環(huán)境可造成DNA損傷，引起堿基序列改變或斷裂，若不加以糾正，則將轉(zhuǎn)錄翻譯出錯(cuò)誤蛋白質(zhì)，是衰老、疾病、癌癥發(fā)生的原因腫瘤抑制基因功能丟失logo腫瘤是一類細(xì)胞周期疾?。╟ellcycledisease）細(xì)胞周期的調(diào)控應(yīng)用：腫瘤的發(fā)病機(jī)制研究腫瘤發(fā)病機(jī)制研究：腫瘤是多步驟多基因突變的疾病基因診斷：以探測基因存在，分析基因類型和缺陷以及功能是否正常從而達(dá)到診斷疾病的方法

1．

核酸分子雜交根據(jù)堿基互補(bǔ)原則，利用核苷酸單鏈作為分子探針檢測待測基因的過程。Southernblot;northernblot;dotblot;insituhybridization，F(xiàn)ISH

2．

聚合酶鏈反應(yīng)（polymerasechainreaction,PCR）：由DNA聚合酶催化，利用極微量DNA片段擴(kuò)增，經(jīng)過多個(gè)循環(huán)周而復(fù)始，使目的DNA片段達(dá)到擴(kuò)增

3．

DNA芯片技術(shù)在固相膜片上制成成千上萬個(gè)寡核苷酸點(diǎn)陣，以待測樣本DNA、RNA用熒光標(biāo)記后與之雜交，利用激光共聚焦顯微鏡對(duì)芯片掃描，計(jì)算機(jī)進(jìn)行信息分析

1．

人類基因組計(jì)劃：humangenomeproject,HGP由美國科學(xué)家提出，目的是將細(xì)胞內(nèi)基因組DNA序列全部分析出來。美國1990年正式啟動(dòng)，英、法、德、日、中等國科學(xué)家共同參與，2003年4月已宣布完成人類基因組序列圖后基因組計(jì)劃或功能基因組學(xué)：post-genomeproject,functionalgenomics研究基因組中各基因的功能，目前已知功能的基因僅占小部分，大量基因功能尚待闡明Homogenization01PCR：polymerasechainreaction02是在模板DNA、引物、四種脫氧核苷酸（dNTP）存在條件下由耐熱DNA聚合酶在體外酶促合成雙鏈DNA反應(yīng)。其特異性取決于引物和模板DNA的特異性PCRPCRPCRSouthernblotInsituhybridizationMicroarrayGenediagnosistechnique:microarray基因治療：genetherapy,指將人的正?；蚧蛴兄委熥饔玫幕蛲ㄟ^一定方式導(dǎo)入人體靶細(xì)胞以糾正基因的缺陷或發(fā)揮治療作用向免疫細(xì)胞導(dǎo)入細(xì)胞因子基因，增強(qiáng)機(jī)體免疫功能。包括腫瘤壞死因子類、干擾素類、白細(xì)胞介素類（基因增補(bǔ)）導(dǎo)入主要組織相容性復(fù)合物抗原基因（MHC），提高腫瘤抗原性，誘導(dǎo)特異性細(xì)胞毒性殺傷作用導(dǎo)入抑癌基因。如野生型P53基因，誘導(dǎo)腫瘤凋亡并喪失致瘤性12345導(dǎo)入自殺基因，將某些病毒、細(xì)菌中的前藥轉(zhuǎn)換酶基因——自殺基因?qū)氚┘?xì)胞，自殺基因編碼的酶類將藥物前體在癌細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)換為毒性產(chǎn)物，達(dá)到殺傷腫瘤目的遏制癌基因的表達(dá)。采用反義核苷酸序列在癌基因表達(dá)時(shí)與mRNA特異性結(jié)合，以阻遏癌基因表達(dá)（基因封閉）外科學(xué)與免疫學(xué)

Surgery&immunology免疫系統(tǒng)的組成免疫系統(tǒng)，immunesystem：參與免疫應(yīng)答，執(zhí)行免疫功能的獨(dú)立解剖學(xué)結(jié)構(gòu)。包括免疫器官、免疫細(xì)胞和免疫分子Thymus,bonemarrowLymphnode,spleen，mucosaassociatedlymphoidtissue(MALT)T、Blymphocyte,naturalkillercell,antigen-presentingcellImmunoglobulin,complement,cytokine,adhesionmolecule，MHC(HLA)免疫系統(tǒng)組成免疫應(yīng)答是由多種免疫細(xì)胞和免疫分子參與的復(fù)雜過程，根據(jù)參與主要免疫細(xì)胞的不同分為T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答和B細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答。免疫應(yīng)答效應(yīng)可保護(hù)機(jī)體免受抗原異物的侵害，但某種情況下也可導(dǎo)致自身組織的損傷免疫應(yīng)答三時(shí)相：識(shí)別相、激活相、效應(yīng)相免疫應(yīng)答的基本機(jī)理CD8+Tcell活化需要雙信號(hào)①TCR特異性識(shí)別MHCI分子-抗原肽復(fù)合物②共刺激信號(hào)或第二信號(hào)+CD4+T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子T細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞結(jié)合——?dú)兕w粒胞吐機(jī)制：穿孔素、顆粒酶、絲氨酸酯酶等②受體介導(dǎo)機(jī)制：Fas-FasL途徑；TNF途徑12T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫效應(yīng)機(jī)制（antibody）B細(xì)胞增殖、分化為漿細(xì)胞，產(chǎn)生免疫球蛋白03產(chǎn)生多種細(xì)胞因子（第二信號(hào)）Th細(xì)胞活化02抗原肽_MHCII分子復(fù)合物（第一信號(hào)）巨噬細(xì)胞加工抗原B細(xì)胞識(shí)別抗原決定簇01B細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫效應(yīng)機(jī)制MHC基因Dendriticcellandtumorantigen特點(diǎn)：無須抗原刺激，無MHC限制，不依賴抗體，為自然殺傷性質(zhì)01識(shí)別靶細(xì)胞：02與靶細(xì)胞膜結(jié)合的IgGFc段；LFA-1與靶細(xì)胞膜ICAM-1相互作用03殺傷靶細(xì)胞①穿孔素、顆粒酶機(jī)制②TNF機(jī)制③NK細(xì)胞毒因子04NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫效應(yīng)機(jī)制免疫記憶機(jī)制：immunologicalmemoryT細(xì)胞免疫記憶：終生存在。即初次免疫應(yīng)答結(jié)束后有長壽性記憶T細(xì)胞存活，濾泡樹突狀細(xì)胞可持續(xù)低水平保持抗原B細(xì)胞免疫記憶：與T細(xì)胞免疫記憶相似，初次應(yīng)答后有長壽性記憶B細(xì)胞存活，需要濾泡樹突狀細(xì)胞可持續(xù)低水平保持抗原及抗原特異性CD4+T細(xì)胞協(xié)調(diào)機(jī)體對(duì)胸腺依賴性抗原再次刺激時(shí)表現(xiàn)出比初次刺激更為強(qiáng)烈的應(yīng)答反應(yīng)，需要T、B細(xì)胞的共同參與免疫調(diào)節(jié)：immuneregulation23145Fas-FasL系統(tǒng)具有調(diào)節(jié)作用可溶性免疫分子具有調(diào)節(jié)作用例如APC表面MHC分子與黏附分子具有調(diào)節(jié)作用指機(jī)體多種因素對(duì)免疫應(yīng)答過程的正負(fù)調(diào)節(jié)作用，以使免疫應(yīng)答適度，維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定免疫調(diào)節(jié)抗感染免疫是機(jī)體識(shí)別、清除病原體的生理性防御機(jī)制。免疫學(xué)基本理論是建立在感染免疫基礎(chǔ)上01抗感染免疫特點(diǎn)：天然免疫和獲得性免疫共存；病原體不同，免疫機(jī)制也不同；病原體可發(fā)生免疫逃避或抵抗；不恰當(dāng)?shù)拿庖咄瑯右饟p傷與疾病02天然免疫：各種屏障，吞噬細(xì)胞，NK細(xì)胞，補(bǔ)體、細(xì)胞因子等03獲得性免疫：T細(xì)胞免疫應(yīng)答，B細(xì)胞免疫應(yīng)答；免疫記憶（immunologicalmemory）04以抗感染免疫為例感染的免疫效應(yīng)機(jī)制感染：免疫效應(yīng)機(jī)制抗感染免疫腫瘤免疫學(xué)：tumorimmunology腫瘤抗原腫瘤特異性抗原：tumor-specificantigen，TSA，指正常細(xì)胞不存在，腫瘤細(xì)胞所獨(dú)有的抗原。如黑色素瘤抗原基因產(chǎn)物（melanoma-antigen-encodinggene,MEGE）研究腫瘤的免疫源性、機(jī)體免疫功能與腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系、機(jī)體抗腫瘤效應(yīng)機(jī)制以及免疫診斷和免疫治療的科學(xué)是惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞中出現(xiàn)的蛋白與多肽分子總稱腫瘤相關(guān)抗原：tumor-associationantigen，TAA,指可存在于正常細(xì)胞或胚胎組織，腫瘤細(xì)胞表達(dá)增高，如AFP，CEA，CA19-9等TumorantigenTumorimmune抗腫瘤免疫應(yīng)答:細(xì)胞免疫占主導(dǎo)地位；體液免疫起一定作用；NK細(xì)胞起一定作用主動(dòng)免疫療法：activeimmunotherapy,即激活機(jī)體抗腫瘤免疫能力，如毒或滅活瘤苗；基因修飾瘤苗；腫瘤抗原肽疫苗等腫瘤的免疫治療：immunotherapy免疫治療分類：機(jī)理：提高腫瘤免疫源性；激發(fā)機(jī)體抗腫瘤免疫應(yīng)答能力被動(dòng)免疫療法：passiveimmunotherapy,即向宿主轉(zhuǎn)移有抗腫瘤活性的治療因子或細(xì)胞，如單克隆抗體；抗體偶聯(lián)物；淋巴細(xì)胞，TNF等抗原肽作為疫苗：生化技術(shù)純化腫瘤細(xì)胞抗原肽或依據(jù)肽序列人工合成抗原肽，結(jié)合MHCI分子作為疫苗02腫瘤細(xì)胞作為疫苗：加熱、凍融、放射線照射等處理，使瘤細(xì)胞滅活，保持抗原性，以非特異性刺激因子作為左劑聯(lián)合注射于患者體內(nèi)進(jìn)行主動(dòng)免疫治療01主動(dòng)免疫療法中腫瘤抗原的制備腫瘤免疫治療免疫監(jiān)視：immunesurveillence,指機(jī)體免疫系統(tǒng)可以識(shí)別并消滅表達(dá)新抗原的“異己”成分或突變細(xì)胞，保持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定01免疫逃逸：immuno-evasion，指機(jī)體免疫系統(tǒng)無法識(shí)別、消滅突變的細(xì)胞。是腫瘤進(jìn)展、轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)02原因①腫瘤抗原性低下；MHCI類分子表達(dá)減少、缺乏②腫瘤細(xì)胞自分泌免疫抑制因子TGF-β、IL-10③宿主T細(xì)胞發(fā)育或功能缺陷④宿主血清中的封閉因子⑤免疫豁免，即腫瘤細(xì)胞表達(dá)FasL，引起CTL凋亡03腫瘤的免疫監(jiān)視與免疫逃逸Transplantrejection排異反應(yīng)：由受體免疫系統(tǒng)識(shí)別供體的異體抗原引發(fā)的一系列免疫反應(yīng)，最終造成移植器官的功能喪失。01HLAI類抗原可出現(xiàn)在大多數(shù)有核細(xì)胞；而HLAII類抗原僅見于抗原遞呈細(xì)胞（AntigenPrensentingCell,APC），如樹突狀細(xì)胞、單核細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞03MHC（MajorHistocompatibilityComplex,主要組織相容性復(fù)合物），在人類指HLA(HumanLeucocyteAntigen,人類白細(xì)胞抗原)02同種異體器官移植排異反應(yīng)產(chǎn)生機(jī)制臨床抗排異治療藥物的作用機(jī)制

幾種免疫抑制劑特性以及作用靶點(diǎn)------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------名稱特性作用靶點(diǎn)------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------環(huán)孢霉素A（CsA