十三章-DNA的生物合成-復(fù)制

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Chap.13BiosynthesisofDNA

2生物機體的遺傳特征以Code形式編碼在DNA分子上，表現(xiàn)為特定核苷酸排列順序，并通過DNA復(fù)制把遺傳信息傳遞給子代。

第一節(jié)概述3

Replication：以原DNA分子為templete，合成相同的DNA分子的過程。

Transcription：以原DNA分子為templete，合成與DNAtemplete核苷酸順序相對應(yīng)的RNA分子的過程。

Translation：在mRNA指導(dǎo)下，按“TripletCode”規(guī)則，合成特定Aa順序的Pro的過程。

ReverseTranscription?4生物體內(nèi)DNA的合成主要包括三方面細胞周期的S期進行的DNA復(fù)制DNA的損傷修復(fù)某些病毒中存在的以RNA為模板的DNA合成5第二節(jié)參與DNA復(fù)制的酶DNA的復(fù)制是一個十分復(fù)雜而精確的過程，涉及多種酶和蛋白因子，如：DNA聚合酶DNA連接酶引物酶解旋酶拓撲異構(gòu)酶單鏈結(jié)合蛋白等6一、DNA聚合酶此酶最早在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)，以后陸續(xù)在細菌、植物和哺乳動物中找到。這類酶的共同性質(zhì)是：[1]以脫氧核苷三磷酸(dNTP)為底物合成DNA；[2]需要模板和引物的存在；因為聚合作用必須以DNA作模板，因此又稱為依賴于DNA的DNA聚合酶(DDDP)；[3]催化dNTP加到生長中的DNA鏈的3‘-OH末端；[4]催化DNA合成的方向是5'→3'。

78◆結(jié)構(gòu)：分子球形，相對分子質(zhì)量103000，由一條含Zn或Mg原子的928個氨基酸的多肽鏈組成。1、大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ

（DNApolymeraseⅠ，DNApolⅠ）

9功能I、聚合作用：在引物RNA3’-OH末端，以dNTP為底物，按模板DNA上的指令由DNApolⅠ逐個將脫氧核苷酸加上去。酶的專一性主要表現(xiàn)為新進入的脫氧核苷酸必須與模板DNA配對時才有催化作用。dNTP進入結(jié)合位點后，可能使酶的構(gòu)象發(fā)生變化，促進3’-OH與5’-PO4結(jié)合生成磷酸二酯鍵。10II、3'→5'外切酶活性──校對作用

3’-5’外切酶活性與聚合酶緊密結(jié)合，當(dāng)聚合出現(xiàn)錯配堿基時，聚合反應(yīng)立即停止，生長鏈的3’末端核苷酸落入3’-5’外切酶位點，錯配核苷酸被迅速除去，聚合反應(yīng)繼續(xù)進行。11DNA聚合酶的3’-5’外切酶活性只作用于單鏈DNA的3’末端，而對雙鏈DNA無作用。此作用被認(rèn)為有校對功能，能夠糾正聚合過程中的錯配。因此，DNA復(fù)制過程中堿基配對受到雙重核對：聚合酶的選擇作用和3’-5’外切酶的校對功能。12III、5'→3'外切酶活性──切除修復(fù)作用

DNA聚合酶I的5‘→3’外切酶活性作用于雙鏈DNA的堿基配對部分，從5’末端水解下核苷酸或寡核苷酸。因此在切除由紫外線照射而形成的嘧啶二聚體中起重要作用，也可切除半不連續(xù)合成中岡崎片段的5’末端引物。13DNA聚合酶I的功能——主要參與修復(fù)14經(jīng)過枯草桿菌蛋白酶處理后，大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ分裂成兩個片段，大片段分子量為68KD，通常稱為Klenow片段，具有聚合酶和3’-5’

外切酶活性。小片段的分子量為35KD，具有5’-3’外切酶活性。1516

聚合酶II主要作用為修復(fù)損傷，該酶的最適模板是雙鏈DNA而中間有空隙（gap）的單鏈DNA部分，而且該單鏈空隙部分不長于100個核苷酸。對于較長的單鏈DNA模板區(qū)該酶的聚合活性很低。無5′→3′外切酶活力，有3′→5′外切酶活力，但活力低。

2、大腸桿菌DNAPolymeraseII17

3、大腸桿菌DNAPolymeraseIII聚合酶III:由10種亞基（αβγδδ′εθτχψ）組成不對稱異源二聚體。α、ε、θ亞基組成全酶的核心酶

γ2、δ、δ’、χ、ψ組成γ－復(fù)合物

18α亞基：5’→3’聚合酶活性ε亞基：3’→5’外切酶活性和堿基選擇功能，是復(fù)制保真性所必需θ亞基：可能起組裝作用β亞基：夾穩(wěn)模板鏈并使酶沿模板鏈滑動τ亞基：促使核心酶二聚化γ－復(fù)合物（γ、δ、

δ’、χ、ψ）：促進全酶組裝至模板及增強核心酶活性19大腸桿菌DNAPolymeraseIII20對模板的要求與DNA聚合酶Ⅱ相同，最適模板也是雙鏈DNA中間有空隙的單鏈DNA，單鏈結(jié)合蛋白可以提高該酶催化單鏈DNA模板的DNA聚合作用。無5′→3′外切酶活力，有聚合酶和3′→5′外切酶活力，且活力強，是聚合酶I的15倍，聚合酶II的300倍。是大腸桿菌負責(zé)合成DNA的復(fù)制酶21三種大腸桿菌聚合酶的比較DNA聚合酶I、II、III的共同點：需要模板指導(dǎo)，以四種脫氧核糖核苷三磷酸作底物，需要有3’-OH的引物鏈存在，聚合反應(yīng)按5’-3’方向進行。三者都具有3’-5’外切酶活性，但DNA聚合酶I還具有5’-3’外切酶活性。DNA聚合酶II和DNA聚合酶III為多亞基酶，而DNA聚合酶I為單鏈酶。22DNA聚合酶I作用于有大段單鏈區(qū)的雙鏈DNA，甚至是帶有很短引物的單鏈DNA。但DNA聚合酶II和DNA聚合酶III宜作用于帶有小段缺口的雙鏈DNA。故PolymeraseIIIisreplicase（復(fù)制酶）PolymeraseIisarepairase（修復(fù)酶）

23二、DNALigases（DNA連接酶）一種封閉DNA鏈上缺口的酶，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA鏈的5'-PO4與另一DNA鏈的3'-OH生成磷酸二酯鍵。但這兩條鏈必須是與同一條互補鏈配對結(jié)合的(T4DNA連接酶除外)，而且必須是兩條緊鄰DNA鏈才能被DNA連接酶催化成磷酸二酯鍵。

24

DNA連接酶（DNAligase）ATPAMP+PPi或或NADNMN+AMPDNAligase25DNAligase的用途

Example:joiningtwoOkazakifragmentstogether.LaggingStrandOkazakiFragment2

DNAligaseOkazakiFragment15’5’3’3’26三、與DNA復(fù)制起始有關(guān)的酶及蛋白因子大腸桿菌的復(fù)制起始位點（oriC）:由245個bp構(gòu)成，關(guān)鍵序列為兩組短的重復(fù)：三次重復(fù)的13個堿基對組成的片段和4次重復(fù)的9個堿基對組成的片段27至少有9種不同的酶和蛋白質(zhì)參與復(fù)制的起始階段。DnaA蛋白：識別起始點序列，在起始點特異部位解開雙鏈DnaB蛋白（解旋酶）：使DNA解旋DnaC蛋白：輔助DnaB蛋白結(jié)合到解旋區(qū)域類組蛋白HU：使DNA彎曲，刺激復(fù)制的引發(fā)28Unwindingpr（SSB，單鏈結(jié)合蛋白）：解旋酶沿復(fù)制叉方向向前推進產(chǎn)生了一段單鏈區(qū)，但是這種單鏈DNA不會長久存在，會很快重新配對形成雙鏈DNA或被核酸酶降解。然而，在細胞內(nèi)有大量單鏈DNA結(jié)合蛋白能很快地和單鏈DNA結(jié)合，防止其重新配對形成雙鏈DNA或被核酸酶降解。29SSB與解螺旋酶不一樣，它不具備酶的活性，不和ATP結(jié)合。一個SSB結(jié)合于單鏈DNA上可以促進其他SSB與相鄰的單鏈DNA結(jié)合，這個過程稱為協(xié)同結(jié)合（cooperativebinding），

SSB結(jié)合到單鏈DNA上后，使其呈伸展?fàn)顟B(tài)，沒有彎曲和結(jié)節(jié)，有利于單鏈DNA作為模板。SSB可以重復(fù)使用，當(dāng)新生的DNA鏈合成到某一位置時，該處的SSB便會脫落，并被重復(fù)利用。30DNA旋轉(zhuǎn)酶（拓撲異構(gòu)酶II）

（DNATopisomerase）

消除由DnaB解旋酶催化DNA解旋而產(chǎn)生的拓撲張力。DNA每復(fù)制10bp，復(fù)制叉前方的模板DNA雙螺旋就要繞其長軸旋轉(zhuǎn)1周，產(chǎn)生正超螺旋，拓撲異構(gòu)酶可以消除正超螺旋，使復(fù)制叉能夠順利前進。31催化合成引物：在大腸桿菌中引物酶為dnaG蛋白。這些引物酶有的存在于宿主細胞內(nèi)，有的則是病毒本身基因編碼的蛋白質(zhì)，由它們結(jié)合其他蛋白因子共同組裝成引發(fā)體開始DNA的復(fù)制。Primase（引物酶）3233341、定義：雙鏈DNA拆開成為2條鏈，每條鏈分別作為模板按堿基互補原則，形成兩個與親代DNA（舊鏈）完全相同的子一代DNA分子（新的DNA)，子代DNA中一條鏈來自親代DNA，一條為新合成的，這樣的復(fù)制方式稱為半保留復(fù)制。

一、半保留復(fù)制

Semiconservativereplication第三節(jié)DNA復(fù)制的兩大特點35Replication

Semi-conservativemechanism362、DNA半保留復(fù)制的證據(jù)373、DNA的半保留復(fù)制的生物學(xué)意義

DNA的半保留復(fù)制表明DNA在代謝上的穩(wěn)定性，是保證親代的遺傳信息穩(wěn)定地傳遞給后代的必要措施。DNA在代謝上的穩(wěn)定性并非指DNA是一種惰性物質(zhì)。38

假如DNA兩條鏈都作為模板同時復(fù)制，但兩條鏈卻是反向平行的，另外，所有聚合酶都只能5'→3'方向復(fù)制，為解決這一矛盾，日本崗崎（Okazaki）提出不連續(xù)復(fù)制模型。

二、半不連續(xù)復(fù)制與崗崎片段

（OkazakiFragment）39后來許多實驗證實：3‘→5’

走向鏈實際上是由5‘→3’方向合成的許多DNA片段（稱為岡崎片段）連接起來的，而5′→3′走向鏈?zhǔn)沁B續(xù)合成，不形成崗崎片段，故稱半不連續(xù)復(fù)制。

4041第四節(jié)、DNA的復(fù)制過程DNA復(fù)制的起始DNA鏈的延伸DNA復(fù)制的終止

42一、復(fù)制的起始DNA復(fù)制的起始包括：對起點的識別模板DNA超螺旋及雙螺旋的解除引物的合成等統(tǒng)稱為引發(fā)（priming）431、辨認(rèn)起點：復(fù)制是從DNA分子上的特定部位開始的，這一部位叫做復(fù)制起始點(originofreplication)常用ori或O表示。關(guān)鍵序列：兩組短的重復(fù)序列

3個13bp的序列

4個9bp的序列OriC,thereplicationoriginofE.coliChromosome,containsthreerepeatsOf13bpandfourrepeatsof9bp.44i.一個包含20個DnaA蛋白分子的專一復(fù)合物結(jié)合到由9個堿基對組成的4次重復(fù)區(qū)域，DNA纏繞在該復(fù)合物上。ii.由13個堿基對組成的3次重復(fù)區(qū)域依次發(fā)生變性（兩條鏈分離）。iii.在DnaC蛋白的協(xié)助下，DnaB蛋白的六聚體結(jié)合到每條DNA鏈上，DnaB解旋酶活化，進一步使DNA解旋，為DNA合成作準(zhǔn)備。45引發(fā)前體的形成TTATCCACAGATCTNTTNTTTT462、模板DNA解除高級結(jié)構(gòu)：DnaB蛋白借助水解ATP產(chǎn)生的能量在DnaC蛋白協(xié)助下沿DNA鏈5’→3’方向移動，解開雙螺旋。DNA雙鏈解開還需要拓撲異構(gòu)酶解除拓撲張力；同時需要SSB維持單鏈模板穩(wěn)定。4748復(fù)制叉結(jié)構(gòu)：在體內(nèi)，雙鏈DNA并非一次性全部解鏈，而往往只解開一段。其形狀似叉子，故稱復(fù)制叉（Replicationfork）49DnaB蛋白和DnaA、DnaC蛋白，還有其他復(fù)制因子，一起形成復(fù)合體，結(jié)合引物酶，形成較大的聚合體，再結(jié)合到模板DNA上，這種復(fù)合物稱為引發(fā)體。此時，引物酶可催化引物的合成，以單鏈DNA為模板，沿5’-3’方向合成一低聚RNA引物。注意：DNA復(fù)制是半不連續(xù),在不連續(xù)復(fù)制的鏈上，引發(fā)體需多次生成。3、引物RNA的生成50先導(dǎo)鏈滯后鏈51

DNA復(fù)制從起始點開始直到終點為止，每個這樣的DNA單位稱為復(fù)制子或復(fù)制單元(replicon)。在原核細胞中，每個DNA分子只有一個復(fù)制起始點，因而只有一個復(fù)制子。在真核生物中，DNA的復(fù)制是從許多起始點同時開始的，所以每個DNA分子上有許多個復(fù)制子。52Bubblesform單個復(fù)制子53BubbleVisualization多個復(fù)制子54二、新鏈的延伸DNA的復(fù)制實際上就是以DNA為模板在DNA聚合酶作用下，將游離的四種脫氧單核苷酸dNTP逐個加入而延長DNA新鏈，其化學(xué)反應(yīng)本質(zhì)是生成磷酸二酯鍵。催化此反應(yīng)的酶：原核生物：DNA-polⅢ真核生物：聚合酶

;55在形成雙螺旋結(jié)構(gòu)時，DNA雙鏈的走向是相反的。復(fù)制起始時，母鏈即已解開，兩股單鏈都是模板，但兩股單鏈在復(fù)制叉上走向是相反的。復(fù)制，包括引物合成，只能從5’向3’延伸，而在同一復(fù)制叉上，解鏈的方向只可能有一個。復(fù)制方向與解鏈方向不一致，是不連續(xù)復(fù)制的成因。56順著解鏈方向而生成的子鏈，復(fù)制是連續(xù)進行的，這股鏈稱為領(lǐng)頭鏈（leadingstrand）。1、領(lǐng)頭鏈連續(xù)復(fù)制572、隨從鏈的不連續(xù)復(fù)制復(fù)制的方向與解鏈方向相反生成的子鏈稱為隨從鏈（laggingstrand）。隨從鏈的復(fù)制必須等待模板鏈解開至足夠長度，才能從5’→3’方向生成引物然后復(fù)制。隨從鏈在延長時，又要等到下一段暴露出足夠長度的模板，再次生成引物而延長,這就是不連續(xù)復(fù)制。58LeadingandLaggingStrandsRNA引物的位置未表示出來復(fù)制叉不連續(xù)合成連續(xù)合成復(fù)制總方向前導(dǎo)鏈：在引物的3′端按5′→3′方向連續(xù)不斷地合成的DNA鏈。后隨鏈：在引物的3′端按5′→3′方向不連續(xù)合成的DNA鏈。岡崎片段：后隨鏈上不連續(xù)合成的DNA短片段（不包括引物）

59三、復(fù)制的終止水解引物及填補空隙:岡崎片段合成后，由DNApolⅠ切除RNA引物（5‘

3’

外切酶活性），并填補留下的空隙(5‘

3’聚合酶活性)。完整雙鏈DNA分子的形成:填補空隙后，DNA片段與片段之間還有一個缺口(一個3',5'-磷酸二酯鍵的長度),由DNA連接酶催化連接成完整的鏈，從而產(chǎn)生完整的雙鏈DNA分子。60原核生物基因是環(huán)狀DNA，雙向復(fù)制的復(fù)制片段在復(fù)制的終止區(qū)(ter)匯合，該區(qū)含有多個約23bp的終止子位點。終止區(qū)可以結(jié)合一種特異的蛋白質(zhì)分子叫做Tus，這個蛋白質(zhì)可能是通過阻止解鏈酶(Helicase)的解鏈活性而終止復(fù)制的。詳細的機制還不完全清楚。6162

1．由解旋Pr使DNA雙鏈在特定點解開，形成復(fù)制叉。

2．在單鏈模板的起始點上，由引物酶合成小段RNA。

3．先導(dǎo)鏈以此RNA為引物，在聚合酶作用下連續(xù)合成完整的DNA鏈。

四、DNA生物合成過程總結(jié)63

4．滯后鏈以RNA為引物，由DNA聚合酶III催化，按5′

3′方向合成多個DNA片段（岡崎片段）直至另一RNA引物的5’末端。

5．在聚合酶I的5′

3′外切酶功能作用下，水解去除RNA引物。出現(xiàn)的缺口由酶I來延長、填補(原核)。

6．最后由DNA連接酶連接缺刻（nick）而成長鏈DNA。

64

7．在復(fù)制叉處的復(fù)制過程往往是雙向，多次發(fā)動（不同于真核的多點）進行的，鏈合成方向為5′

3′。

8．如錯配，酶I、III的3’

5’外切功能皆可外切修復(fù)。

互補、外切稱為雙重校對。65DNA復(fù)制的精確性（高保真復(fù)制）

為了保證遺傳的穩(wěn)定，DNA的復(fù)制必須具有高保真性。DNA復(fù)制時的保真性主要與下列因素有關(guān)：1、堿基的配對規(guī)律：模板鏈與新生鏈之間的堿基配對保證堿基配錯幾率約為1/104～1/105。

2、DNA聚合酶的3’→5’外切酶活性的校對功能：使堿基的錯配幾率又降低100～1000倍。

3、DNA的損傷修復(fù)系統(tǒng)66五、DNA復(fù)制的方式DNA的復(fù)制形式多種多樣，原核生物的染色體和質(zhì)粒，真核生物的細胞器DNA等環(huán)狀雙鏈分子，從一個起點開始雙向復(fù)制，一個復(fù)制子形成兩個復(fù)制叉，質(zhì)粒的單向復(fù)制以及對稱復(fù)制和不對稱復(fù)制，病毒DNA分子的滾環(huán)復(fù)制等。671、原核生物的"θ"型復(fù)制環(huán)狀DNA的復(fù)制可以從復(fù)制起點開始，雙向或單向同時進行，形成θ樣中間物，故又稱"θ"型復(fù)制，最后兩個復(fù)制方向相遇而終止復(fù)制。682、滾環(huán)復(fù)制噬菌體φX174是單鏈環(huán)狀DNA，當(dāng)侵入寄主后，侵入的單鏈DNA稱為正鏈DNA。在復(fù)制開始時，以正鏈DNA為模板利用寄主細胞的DNA聚合酶復(fù)制出與之互補的負鏈DNA，形成共價閉環(huán)的雙鏈分子（復(fù)制型）。6970正鏈DNA在特定位置被自身編碼的A蛋白切開，游離出3‘-OH末端作為引物。在DNA聚合酶Ⅲ的作用下，以環(huán)狀負鏈為模板，在正鏈的3‘-OH端加入脫氧核苷酸，使鏈不斷延長，通過滾動而合成新的正鏈。當(dāng)復(fù)制向前進行時，5'端從環(huán)上向下解鏈的同時伴有環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)繞其軸不斷的旋轉(zhuǎn)，而且以3'-OH端為引物的DNA生長鏈則不斷地以另一條環(huán)狀DNA鏈為模板向前延伸，因而稱為滾環(huán)復(fù)制。

713、D環(huán)復(fù)制真核細胞內(nèi)線粒體DNA的復(fù)制為D環(huán)復(fù)制。D環(huán)復(fù)制的特點是兩條鏈在固定點解開進行復(fù)制，但兩條鏈的合成高度不對稱。72一條鏈先復(fù)制，另一條鏈保持單鏈而被取代。待一條鏈復(fù)制到一定程度，露出另一條鏈的復(fù)制起點時，另一條鏈才開始復(fù)制。73

真核生物基因組比原核生物復(fù)雜得多，但DNA復(fù)制的基本過程還是相似的。第五節(jié)、真核生物DNA的復(fù)制特點

真核生物中也具有幾種DNA聚合酶，其聚合反應(yīng)機制與原核生物的聚合一樣。

74聚合酶α:主要負責(zé)染色體DNA復(fù)制過程中引物的合成；聚合酶β：可能與DNA重組修復(fù)有關(guān)；聚合酶γ：負責(zé)線粒體DNA的復(fù)制；聚合酶δ：主要負責(zé)核DNA的合成；聚合酶

：，類似大腸桿菌DNApolI，主要起校正、修復(fù)和填補缺口。哺乳動物中發(fā)現(xiàn)的5種DNA聚合酶7576一.與原核生物不同，真核生物DNA復(fù)制有許多起始點。例如酵母S.cerevisiae的17號染色體約有400個起始點，因此，雖然真核生物DNA復(fù)制的速度(60核苷酸/每秒鐘)比原核生物DNA復(fù)制的速度(E.coli1700核苷酸/每秒鐘)慢得多，但復(fù)制完全部基因組DNA也只要幾分鐘的時間。

77二.在真核生物DNA復(fù)制叉處，需要兩種不同的酶DNA聚合酶α(polα)和DNA聚合酶δ(polδ)78DNA聚合酶α/引發(fā)酶復(fù)合物

合成RNA-DNA引物7980復(fù)制因子C（RFC）83復(fù)制蛋白A（RPA）：單鏈結(jié)合蛋白RPA可使雙螺旋DNA進一步解旋，在一定條件下激活Polα/引發(fā)酶活性，并且為DNA聚合酶δ持續(xù)合成DNA過程中所必需的。84真核生物DNA聚合酶α/δ轉(zhuǎn)換85三、FEN1和RNaseHI切除RNA引物8687參與真核生物DNA復(fù)制的酶與蛋白8889表：真核生物與原核生物DNA合成的區(qū)別區(qū)別原核生物真核生物DNA合成的時期整個細胞生長過程細胞周期的S期復(fù)制起點數(shù)單個多個RNA引物長度10-60核苷酸10核苷酸岡崎片段長度1000-2000核苷酸100-150核苷酸前導(dǎo)鏈與后隨鏈的合成聚合酶III同時控制聚合酶α和δ控制90

四、真核生物5’末端的復(fù)制機制真核生物可由RNaseH1切除引物，DNApol

或填補空隙，并由連接酶連接成完整的新鏈。但5’端切除后留下的空隙如不補齊，細胞染色體DNA將面臨復(fù)制一次就縮短一些的問題。91真核生物新鏈末端的復(fù)制

——端粒和端粒酶I、端粒（telomere）定義：是一段DNA序列和蛋白質(zhì)形成的一種復(fù)合體，形態(tài)學(xué)上，染色體末端膨大成粒狀，是真核生物染色體線性DNA分子末端的結(jié)構(gòu)。92端粒的結(jié)構(gòu)特點：對多種不同生物端粒的DNA序列測定，發(fā)現(xiàn)其共同特點都是富含TG堿基的短序列多次重復(fù)。端粒的功能：穩(wěn)定染色體末端結(jié)構(gòu)；補償滯后鏈5’末端在消除引物后造成的空缺。932、端粒酶（telornerase）20世紀(jì)的80年代中期發(fā)現(xiàn)了端粒酶，它是一種RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物。端粒酶中的RNA序列?？膳c端粒區(qū)的重復(fù)序列互補并作為端粒區(qū)重復(fù)序列延長的模板。端粒酶中的蛋白質(zhì)部分具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性，能以其自身攜帶的RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成端粒DNA。942009年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎授予美國科學(xué)家伊麗莎白·布萊克本、卡蘿爾·格雷德和杰克·紹斯塔克，以表彰他們“發(fā)現(xiàn)端粒和端粒酶是如何保護染色體的”。95A、端粒DNA的3’末端和端粒酶所含的RNA分子的3’端形成堿基配對。3、端粒的合成過程96B、端粒酶利用RNA為模板，將dNTP加到端粒DNA的3’端。97C、DNA-RNA雜交鏈之間發(fā)生相對滑動，端粒DNA鏈3’端和RNA下游（3’端）形成新的堿基配對，并暴露出部分RNA模板序列。98D、重復(fù)B、C，周而復(fù)始直至足夠長度。99復(fù)制終止時，染色體線性DNA末端確有可能縮短，但通過端粒的合成可以補償這種由除去引物引起的末端縮短。因為模板DNA的3’端延長后，延長的3’端可以回折作為引物，合成其互補鏈。100端粒酶在保證染色體

復(fù)制的完整性上有重要意義端粒特別是端粒酶的活性與細胞的生長、繁殖、衰老凋亡以及腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。端粒的平均長度隨細胞分裂次數(shù)的增多及年齡的增長而逐漸變短至消失，可導(dǎo)致染色體穩(wěn)定性下降，導(dǎo)致細胞衰老凋亡。101端粒酶在保證染色體

復(fù)制的完整性上有重要意義體細胞幾乎沒有端粒酶活性，隨多次細胞分裂端粒逐漸縮短，細胞失去增殖能力。而端粒酶活性較高的胚原細胞，端粒長度未縮短。腫瘤細胞端粒酶重新獲得活性，以維持端粒結(jié)構(gòu)致使染色體穩(wěn)定而成為永生細胞。102第六節(jié)

RNA指導(dǎo)的DNA合成

（Reversetranscription）1031964年，H.Temin首次發(fā)現(xiàn)，鳥類Rous肉瘤病毒等RNA腫瘤病毒可被DNA合成抑制劑阻遏。這一發(fā)現(xiàn)提示，在RNA腫瘤病毒的復(fù)制過程中需要合成DNA。原病毒DNA是RNA腫瘤病毒復(fù)制與致癌過程中的中間物RNA腫瘤病毒→DNA原病毒（前病毒）→RNA腫瘤病毒1、發(fā)現(xiàn)104105逆轉(zhuǎn)錄擴大和發(fā)展了中心法則，使人們對遺傳信息的流向有了新的認(rèn)識。1062、定義：以RNA為模板、dNTP為原料，反轉(zhuǎn)錄酶催化，按照RNA中的核苷酸順序合成DNA的過程。與通常轉(zhuǎn)錄過程中遺傳信息流從DNA到RNA的方向相反，故稱為反轉(zhuǎn)錄（Reversetranscription）反轉(zhuǎn)錄酶：又稱為依賴RNA的DNA聚合酶(RNA-dependentDNApolymerase,RDDP)。

107

RNA指導(dǎo)的DNA合成

（Reversetranscription）108

3、性質(zhì)

反應(yīng)特點：

1）要求引物（通常為宿主細胞的tRNA），引物與模板互補，具有游離3′-OH2）模板（RNA病毒自身，或帶有適當(dāng)引物的其他RNA）

3）dNTP底物，Mg2+和Mn2+，

4）DNA鏈的延長方向為5′→3′109110

(SinglestrandRNA)(SinglestrandDNA)(DoublestrandDNA)

111

4、反轉(zhuǎn)錄酶發(fā)現(xiàn)的意義①對中心法則的補充和修正逆轉(zhuǎn)錄酶：RNA→cDNA②導(dǎo)致了“癌基因”發(fā)現(xiàn)，并使致癌的分子機制研究有了重大進展。112癌基因（oncogene）：最先在致癌病毒中發(fā)現(xiàn)，與原癌基因很相似或從原癌基因衍生而來。原癌基因編碼生長調(diào)節(jié)蛋白。在病毒感染期間，一些原癌基因的DNA序列被病毒整合至病毒基因組。在病毒感染的某個階段，這段基因通過截短或突變而形成缺陷型基因。在隨后感染過程中被宿主細胞表達，異常的蛋白質(zhì)產(chǎn)物干擾了細胞生長的正常調(diào)節(jié)，有時就導(dǎo)致癌癥。113正常細胞被反轉(zhuǎn)錄病毒感染

反轉(zhuǎn)錄病毒調(diào)控生長的蛋白的基因（原癌基因）114反轉(zhuǎn)錄病毒將自己的基因組插入到宿主細胞染色體中，在原癌基因附近與其整合115從被感染的宿主細胞釋放的病毒顆粒捕獲了原癌基因含原癌基因的反轉(zhuǎn)錄病毒116突變產(chǎn)生了癌基因含有癌基因的反轉(zhuǎn)錄病毒侵入正常細胞轉(zhuǎn)化后的細胞產(chǎn)生有缺陷的調(diào)控蛋白117獲得性免疫缺陷綜合癥

（艾滋病AIDS）人類免疫缺陷病毒（HIV）：反轉(zhuǎn)錄病毒。HIV會殺死許多受感染細胞（主要為T淋巴細胞）而導(dǎo)致宿主機體免疫系統(tǒng)的抑制。HIV反轉(zhuǎn)錄酶的錯誤率比其他已知反轉(zhuǎn)錄酶更高，致使該病毒具有高突變率。118119AZT：T淋巴細胞吸收后轉(zhuǎn)化為AZT三磷酸鹽。HIV反轉(zhuǎn)錄酶與AZT三磷酸鹽的親和力比與dTTP的更強，競爭性地抑制了該酶與dTTP的結(jié)合。當(dāng)AZT三磷酸鹽被加入到延長鏈的3‘端時，由于3’羥基的缺失，鏈的合成被提前終止。120DNA復(fù)制產(chǎn)生的誤差、DNA結(jié)構(gòu)本身的不穩(wěn)定、物理化學(xué)因素等都可引起DNA分子結(jié)構(gòu)的異常改變稱為DNA損傷(DNAdamage)。針對由損傷導(dǎo)致的缺陷而采取的補救措施稱為修復(fù)（DNArepairing）。

第七節(jié)、DNA損傷及修復(fù)121一、DNA損傷的類型1、轉(zhuǎn)換：同型堿基間的置換2、顛換：異型堿基的置換1221231243、插入或缺失在多核苷酸鏈中增加1對或幾對核苷酸稱為插入；丟失1個或幾個核苷酸對稱為缺失；兩種情況都會導(dǎo)致遺傳密碼發(fā)生改變，因此也稱為移碼突變。1254、鏈內(nèi)或鏈間發(fā)生共價連接126根據(jù)DNA分子的改變，突變可分為4類：顛換：異型堿基間變異

點突變

轉(zhuǎn)換：同型堿基間變異

缺失

缺失或插入堿基

插入

則引起移碼突變

鏈內(nèi)或鏈間發(fā)生共價連接127二、DNA損傷的修復(fù)

DNA復(fù)制過程所發(fā)生的突變(堿基配對錯誤)，由核內(nèi)DNA聚合酶Ⅰ以其校對功能予以糾正，但這種校正作用并不十分可靠。錯配修復(fù)系統(tǒng)能夠發(fā)現(xiàn)和修復(fù)這些錯配的核苷酸。1281、錯配修復(fù)129130大腸桿菌DNA錯配修復(fù)需要：錯配修復(fù)蛋白MutS、MutL

核酸內(nèi)切酶MutH

解旋酶UvrD、核酸外切酶單鏈結(jié)合蛋白

DNA聚合酶III、DNA連接酶131甲基化導(dǎo)向的錯配修復(fù)132

復(fù)制后的短時間內(nèi)，模板鏈?zhǔn)羌谆?，而新鏈沒有甲基化。幾分鐘后新鏈被甲基化，兩條鏈不再有區(qū)別。在新合成鏈中瞬間未被甲基化的GATC序列可以被錯配修復(fù)系統(tǒng)識別出來。133真核細胞可能借助錯配修復(fù)系統(tǒng)中

的某些蛋白質(zhì)與復(fù)制機構(gòu)之間的接觸真核細胞也具有多種與原核生物中的錯配修復(fù)蛋白類似的蛋白因子，但錯配修復(fù)的詳細機制還不明確。只是人類編碼這類錯配修復(fù)蛋白的基因變異會導(dǎo)致一些最常見的遺傳性易感癌綜合癥。134

2、利用酶簡單地逆轉(zhuǎn)DNA損傷

——光復(fù)活作用

這是最早發(fā)現(xiàn)的DNA修復(fù)方式。修復(fù)是由細菌中的DNA光解酶(photolyase)完成的，后來發(fā)現(xiàn)類似的修復(fù)酶廣泛存在，但哺乳動物中缺乏這種酶。135此酶能特異性識別紫外線造成的核酸鏈上相鄰嘧啶共價結(jié)合的二聚體，并與其結(jié)合，這步反應(yīng)不需要光；結(jié)合后如受400nm波長的光照射，則此酶就被激活，將二聚體分解為兩個正常的嘧啶單體，然后酶從DNA鏈上釋放，DNA恢復(fù)正常結(jié)構(gòu)。136大腸桿菌細胞中還存在O6-甲基鳥嘌呤DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，直接修復(fù)DNA中被甲基化修飾的鳥嘌呤（GC—AT）,將甲基轉(zhuǎn)移至酶蛋白活性中心的Cys上，使鳥嘌呤復(fù)原。1373、切除修復(fù)是修復(fù)DNA損傷最為普遍的方式，對多種DNA損傷包括堿基脫落形成的無堿基位點、嘧啶二聚體、堿基烷基化、單鏈斷裂等都能起修復(fù)作用。這種修復(fù)方式普遍存在于各種生物細胞中，也是人體細胞主要的DNA修復(fù)機制。138DNA糖苷酶損傷的堿基AP核酸內(nèi)切酶DNA聚合酶IDNA連接酶堿基切除修復(fù)139核苷酸切除修復(fù)（NER）與堿基切除修復(fù)不同，核苷酸切除修復(fù)系統(tǒng)并不識別任何特殊的堿基損傷，而是識別由于DNA損傷造成的DNA螺旋狀結(jié)構(gòu)的扭曲。多亞基酶水解損傷DNA鏈的任意一側(cè)的磷酸二酯鍵，產(chǎn)生一個包含12~13個核苷酸的片段（人類中為27~29個核苷酸），雙重斷裂后，由聚合酶填補空隙，連接酶連接切口。140核苷酸切除修復(fù)1414、重組修復(fù)上述的切除修復(fù)在切除損傷段落后是以原來正確的互補鏈為模板來合成新的段落而做到修復(fù)的。但在某些情況下互補鏈也損傷或不存在，此時利用DNA重組修復(fù)系統(tǒng)修復(fù)雙鏈斷裂損傷。142①受損傷的DNA鏈復(fù)制時，產(chǎn)生的子代DNA在損傷的對應(yīng)部位出現(xiàn)缺口；143②另一條母鏈DNA與有缺口的子鏈DNA進行重組交換，母鏈DNA上相應(yīng)的片段填補子鏈缺口處，而母鏈DNA出現(xiàn)缺口；③以另一條子鏈DNA為模板，經(jīng)DNA聚合酶催化合成一新DNA片段填補母鏈DNA的缺口，最后由DNA連接酶連接，完成修補。144

重組修復(fù)不能完全去除損傷，損傷的DNA段落仍然保留在親代DNA鏈上，只是重組修復(fù)后合成的DNA分子是不帶損傷的，但經(jīng)多次復(fù)制后，損傷就被“沖淡”了。1455、SOS修復(fù)DNA受到嚴(yán)重損傷，細胞處于危急狀態(tài)時所誘導(dǎo)的一種DNA修復(fù)方式——SOS修復(fù)。修復(fù)結(jié)果只是能維持基因組的完整性，提高細胞的生成率，但留下的錯誤較多，故又稱為錯誤傾向修復(fù)(errorpronerepair)，使細胞有較高的突變率。146SOS修復(fù)機制147SOS修復(fù)由RecA蛋白和LexA阻遏物相互作用引起的。在單鏈DNA和ATP存在時，RecA蛋白被激活，從而促進LexA自身的蛋白水解酶活性。LexA自我分解，使一系列與修復(fù)有關(guān)的酶表達，完成空缺部位DNA的合成。這時補上去的核苷酸幾乎是隨機的，但仍然保持了DNA雙鏈的完整性，使細胞得以生存。但這種修復(fù)帶給細胞很高的突變率。

148本章小結(jié)DNA是攜帶遺傳信息的載體，細胞分裂前，通過DNA的復(fù)制作用，遺傳信息從親代DNA分子傳到子代DNA分子中。DNA復(fù)制時，是從一個特定的起始點開始的，兩條DNA鏈分別做模板，在DNA聚合酶等許多酶和蛋白質(zhì)分子的參與下，以dNTP為原料，按堿基配對原則合成新一代的DNA分子，合成方向是5'→3'。經(jīng)過復(fù)制后的DNA分子中，一條鏈來自親代DNA分子，另一條鏈?zhǔn)切潞铣傻?，這種復(fù)制方式叫做半保留復(fù)制。149由于DNA分子復(fù)制時，兩條模板鏈的走向是相反的，而解鏈方向只有1個，且合成方向只能是5‘→3’，所以有一條鏈?zhǔn)沁B續(xù)合成的