IPSC來(lái)源肝前體細(xì)胞制備及質(zhì)量鑒定規(guī)范

ICS07.080

CCSC04

團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)

T/XXXXXXX—XXXX

IPSC來(lái)源肝前體細(xì)胞制備及質(zhì)量鑒定規(guī)范

SpecificationforpreparationandqualityidentificationofIPSCderivedliver

precursorcells

XXXX-XX-XX發(fā)布XXXX-XX-XX實(shí)施

中國(guó)國(guó)際經(jīng)濟(jì)技術(shù)合作促進(jìn)會(huì)發(fā)布

T/XXXXXXX—XXXX

IPSC來(lái)源肝前體細(xì)胞制備及質(zhì)量鑒定規(guī)范

1范圍

本文件規(guī)定了IPSC來(lái)源肝前體細(xì)胞的術(shù)語(yǔ)和定義、基本要求、制備過(guò)程、質(zhì)量鑒定。

本文件適用于IPSC來(lái)源肝前體細(xì)胞的制備與質(zhì)量鑒定。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB3095環(huán)境空氣質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求

GB50073潔凈廠房設(shè)計(jì)規(guī)范

GB50346生物安全實(shí)驗(yàn)室建筑技術(shù)規(guī)范

GB50591潔凈室施工及驗(yàn)收規(guī)范

3術(shù)語(yǔ)和定義、縮略語(yǔ)

術(shù)語(yǔ)和定義

下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。

3.1.1

誘導(dǎo)多能干細(xì)胞inducedpluripotentstemcell；IPSC

由人體細(xì)胞經(jīng)重編程而獲得的具有自我更新能力和向三胚層細(xì)胞分化潛能的一種干細(xì)胞。

3.1.2

凍存cryopreservation

經(jīng)過(guò)程序降溫冷凍，并利用深低溫冷凍儲(chǔ)存技術(shù)，以減少細(xì)胞代謝活動(dòng)，保存細(xì)胞生物學(xué)活性。

3.1.3

復(fù)蘇thawing

細(xì)胞從脫離生長(zhǎng)狀態(tài)重新獲得生長(zhǎng)活力的過(guò)程。

3.1.4

細(xì)胞活率cellviability

能夠增值、保持正常代謝活性的細(xì)胞占全部細(xì)胞的百分比。

縮略語(yǔ)

下列縮略語(yǔ)適用于本文件。

HAV：甲型肝炎病毒（HepatitisAVirus）

HBV：乙型肝炎病毒（HepatitisBVirus）

HCV：丙型肝炎病毒（HepatitisCVirus）

HIV：人類(lèi)免疫缺陷病毒（HumanImmunodeficiencyVirus）

IPSC：誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（InducedPluripotentStemCell）

4基本要求

場(chǎng)地與設(shè)施

1

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4.1.1IPSC來(lái)源肝前體細(xì)胞制備機(jī)構(gòu)選址應(yīng)符合《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》要求，空氣質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)符

合GB3095標(biāo)準(zhǔn)分級(jí)二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。

4.1.2IPSC來(lái)源肝前體細(xì)胞制備機(jī)構(gòu)實(shí)驗(yàn)室或廠房應(yīng)由具有潔凈實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)建設(shè)資質(zhì)的工程公司設(shè)

計(jì)與建造，并應(yīng)符合GB19489、GB50073、GB50346和GB50591的規(guī)定。建設(shè)完成后，各功能區(qū)域的

潔凈級(jí)別應(yīng)由專業(yè)機(jī)構(gòu)進(jìn)行檢測(cè)并出具合格證明。

4.1.3干細(xì)胞制備功能區(qū)應(yīng)按IPSC來(lái)源肝前體細(xì)胞制備工藝進(jìn)行各區(qū)域設(shè)計(jì)，符合《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管

理規(guī)范》和《干細(xì)胞制劑質(zhì)量控制及臨床前研究指導(dǎo)原則》要求。干細(xì)胞制備機(jī)構(gòu)應(yīng)配備獨(dú)立質(zhì)量檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)室，并符合GB19489和GB50346的規(guī)定。

設(shè)備和耗材

4.2.1IPSC來(lái)源肝前體細(xì)胞的制備機(jī)構(gòu)應(yīng)優(yōu)先選用符合《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》和《干細(xì)胞制劑質(zhì)

量控制及臨床前研究指導(dǎo)原則》要求，獲得國(guó)家資質(zhì)認(rèn)證的設(shè)備、儀器、耗材和試劑。

4.2.2IPSC來(lái)源肝前體細(xì)胞的制備機(jī)構(gòu)應(yīng)對(duì)設(shè)備、儀器、耗材和試劑供應(yīng)商進(jìn)行資質(zhì)審核認(rèn)證，要求

供應(yīng)商提供產(chǎn)品質(zhì)量報(bào)告和批次檢驗(yàn)報(bào)告，并對(duì)耗材及試劑進(jìn)行質(zhì)量抽檢，避免采購(gòu)質(zhì)量不合格的產(chǎn)品。

4.2.3IPSC來(lái)源肝前體細(xì)胞的制備機(jī)構(gòu)設(shè)備和儀器正式使用前應(yīng)做安裝確認(rèn)(IQ)、運(yùn)行確認(rèn)（OQ）和

性能確認(rèn)(PQ)，并定期進(jìn)行第三方校準(zhǔn)，不得使用有安全隱患的儀器操作樣本及細(xì)胞制品。

4.2.4IPSC來(lái)源肝前體細(xì)胞的制備機(jī)構(gòu)應(yīng)對(duì)設(shè)備與儀器進(jìn)行編號(hào)建檔，并建立標(biāo)準(zhǔn)操作流程(SOP)，

確保使用、運(yùn)行、保養(yǎng)、維修記錄完整可追溯，對(duì)于關(guān)鍵工藝相關(guān)設(shè)備參數(shù)應(yīng)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，及時(shí)對(duì)狀

態(tài)異常的設(shè)備進(jìn)行校對(duì)和維修。

人員管理

4.3.1IPSC來(lái)源肝前體細(xì)胞制備機(jī)構(gòu)應(yīng)分別設(shè)立干細(xì)胞制備負(fù)責(zé)人、質(zhì)量管理負(fù)責(zé)人和質(zhì)量授權(quán)人崗

位。由法人授權(quán)任命，任職資質(zhì)應(yīng)符合《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》和《干細(xì)胞制劑質(zhì)量控制及臨床前研

究指導(dǎo)原則》要求，定期接受崗位專業(yè)培訓(xùn)，制備技術(shù)負(fù)責(zé)人與質(zhì)量管理負(fù)責(zé)人、質(zhì)量授權(quán)人不得相互

兼任。

4.3.2IPSC來(lái)源肝前體細(xì)胞制備和質(zhì)控技術(shù)人員應(yīng)具備的健康要求：HAV、HBV、HCV、HIV及梅毒的抗

體檢測(cè)應(yīng)為陰性，并且(矯正)視力正常，無(wú)色盲、色弱。

4.3.3IPSC來(lái)源肝前體細(xì)胞制備和質(zhì)控技術(shù)人員應(yīng)半年接受體檢一次，有呼吸道感染或發(fā)熱等疾病狀

態(tài)下不得進(jìn)入潔凈操作區(qū)，需完全康復(fù)后方可恢復(fù)崗位操作。

4.3.4IPSC來(lái)源肝前體細(xì)胞制備和質(zhì)控技術(shù)人員上崗前應(yīng)經(jīng)過(guò)專業(yè)培訓(xùn)，內(nèi)容包括但不限于干細(xì)胞理

論與實(shí)踐、生命倫理、干細(xì)胞法律法規(guī)、GMP管理、GCP資質(zhì)、制劑基本知識(shí)、細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)、生物安

全、儀器設(shè)備使用與維護(hù)方法、物料管理與清潔衛(wèi)生、崗位職責(zé)、操作規(guī)范等內(nèi)容。

5制備過(guò)程

樣本采集

5.1.1選擇適當(dāng)?shù)某赡旮渭?xì)胞來(lái)源作為起始材料制備IPSC來(lái)源肝前體細(xì)胞。

5.1.2樣本的采集應(yīng)在指定的取得《醫(yī)療機(jī)構(gòu)執(zhí)業(yè)許可證》的醫(yī)療機(jī)構(gòu)進(jìn)行。

5.1.3樣本采集應(yīng)符合醫(yī)學(xué)倫理的相關(guān)要求，獲取其供者或法定代表人、監(jiān)護(hù)人的同意和授權(quán)，并簽

署知情同意書(shū)。

5.1.4應(yīng)建立合適的供者篩選標(biāo)準(zhǔn)，至少應(yīng)包括既往病史和家族病史的調(diào)查、傳染性疾病的結(jié)果、近

期旅行或居住史調(diào)查和當(dāng)前健康狀況報(bào)告。供者篩選宜參考GB18467相關(guān)要求。

5.1.5樣本采集過(guò)程應(yīng)采取措施保護(hù)供者的健康和安全，并通過(guò)無(wú)菌技術(shù)最大限度降低污染、感染和

病原傳播的風(fēng)險(xiǎn)。采集用的接觸采集物的試劑和物料應(yīng)無(wú)菌、符合臨床安全標(biāo)準(zhǔn)，且在有效期內(nèi)使用。

細(xì)胞培養(yǎng)

5.2.1細(xì)胞培養(yǎng)基的選擇

2

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5.2.1.1細(xì)胞培養(yǎng)基的成分：細(xì)胞培養(yǎng)基的成分應(yīng)包括適當(dāng)?shù)臓I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、生長(zhǎng)因子、抗生素和其他必

要的添加劑，以支持細(xì)胞的健康生長(zhǎng)。

5.2.1.2細(xì)胞培養(yǎng)基的pH值和溫度：細(xì)胞培養(yǎng)基的pH值應(yīng)在適宜的范圍內(nèi)維持，并且培養(yǎng)溫度應(yīng)符

合細(xì)胞來(lái)源的要求。

5.2.1.3培養(yǎng)基的質(zhì)量控制：應(yīng)定期檢測(cè)和確保細(xì)胞培養(yǎng)基的質(zhì)量，包括檢查細(xì)胞培養(yǎng)基的污染情況。

5.2.2細(xì)胞培養(yǎng)條件

5.2.2.1培養(yǎng)皿：選擇適當(dāng)類(lèi)型和規(guī)格的培養(yǎng)皿，以支持細(xì)胞的黏附和生長(zhǎng)。

5.2.2.2培養(yǎng)環(huán)境：維持適當(dāng)?shù)募?xì)胞培養(yǎng)環(huán)境，包括CO2濃度、濕度和氧氣濃度等。

5.2.2.3培養(yǎng)時(shí)間和傳代：定期更換培養(yǎng)基，并根據(jù)需要進(jìn)行細(xì)胞傳代，以避免過(guò)度密度和細(xì)胞老化。

5.2.3細(xì)胞培養(yǎng)的記錄和文檔

5.2.3.1細(xì)胞培養(yǎng)記錄：詳細(xì)記錄每次細(xì)胞培養(yǎng)的信息，包括培養(yǎng)開(kāi)始日期、細(xì)胞數(shù)量、培養(yǎng)基成分、

傳代信息等。

5.2.3.2細(xì)胞培養(yǎng)文檔：建立細(xì)胞培養(yǎng)的文檔記錄，包括培養(yǎng)基配方、培養(yǎng)條件和培養(yǎng)方法的詳細(xì)描

述。

5.2.3.3細(xì)胞培養(yǎng)的質(zhì)量控制：進(jìn)行定期的細(xì)胞培養(yǎng)質(zhì)量控制，包括細(xì)胞健康狀態(tài)的評(píng)估、細(xì)胞的鑒

定和細(xì)胞培養(yǎng)的污染。

誘導(dǎo)因子選擇

5.3.1誘導(dǎo)因子的種類(lèi)和特性

5.3.1.1多能性誘導(dǎo)因子：選擇適當(dāng)?shù)亩嗄苄哉T導(dǎo)因子，如Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc等，以確保細(xì)

胞能夠重編程為多能性干細(xì)胞。

5.3.1.2肝細(xì)胞分化誘導(dǎo)因子：在肝前體細(xì)胞誘導(dǎo)過(guò)程中，選擇適當(dāng)?shù)母渭?xì)胞分化誘導(dǎo)因子，如HNF4

α、FOXA2、ALB等，以促進(jìn)肝前體細(xì)胞向肝細(xì)胞的定向分化。

5.3.1.3誘導(dǎo)因子的濃度和添加時(shí)間：確定適宜的誘導(dǎo)因子濃度和添加時(shí)間，以最大程度地促進(jìn)細(xì)胞

的轉(zhuǎn)化和分化，同時(shí)避免不必要的細(xì)胞應(yīng)激。

5.3.2誘導(dǎo)因子的來(lái)源和純度

5.3.2.1誘導(dǎo)因子的來(lái)源：使用高質(zhì)量、來(lái)源可追溯的誘導(dǎo)因子，確保誘導(dǎo)因子不帶有潛在的細(xì)胞污

染或其他不良成分。

5.3.2.2誘導(dǎo)因子的純度：誘導(dǎo)因子應(yīng)具有高純度，以減少不純物對(duì)細(xì)胞誘導(dǎo)和分化過(guò)程的干擾。

5.3.3誘導(dǎo)因子的質(zhì)量控制

5.3.3.1誘導(dǎo)因子的活性檢測(cè)：定期檢測(cè)誘導(dǎo)因子的活性，以確保其在細(xì)胞誘導(dǎo)過(guò)程中的有效性。

5.3.3.2誘導(dǎo)因子的質(zhì)量控制記錄：建立誘導(dǎo)因子的質(zhì)量控制記錄，包括批次信息、活性檢測(cè)結(jié)果和

使用情況。

細(xì)胞傳代

5.4.1傳代條件的確定

5.4.1.1傳代時(shí)間間隔：確定適宜的細(xì)胞傳代時(shí)間間隔，以維持細(xì)胞的健康狀態(tài)并避免過(guò)度密度。

5.4.1.2傳代液的配制：使用適當(dāng)?shù)膫鞔簛?lái)分離和重新懸浮細(xì)胞，確保傳代液的成分和pH值適合細(xì)

胞的需求。

5.4.2傳代操作規(guī)程

5.4.2.1細(xì)胞分離：使用適當(dāng)?shù)姆椒ê驮噭⒓?xì)胞從培養(yǎng)皿中分離，避免細(xì)胞聚集和損傷。

5.4.2.2細(xì)胞計(jì)數(shù)：在傳代過(guò)程中進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，以確定傳代液中的細(xì)胞密度。

5.4.2.3傳代液的添加：將適量的傳代液添加到細(xì)胞中，確保細(xì)胞在傳代過(guò)程中獲得足夠的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)

和支持。

3

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5.4.2.4IPSC來(lái)源肝前體細(xì)胞傳代操作應(yīng)嚴(yán)格遵照《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》和《干細(xì)胞制劑質(zhì)量控

制及臨床前研究指導(dǎo)原則》要求，保證無(wú)外源微生物污染。

5.4.3細(xì)胞傳代記錄和文檔

5.4.3.1傳代記錄：記錄每次細(xì)胞傳代的信息，包括傳代日期、傳代液成分、細(xì)胞密度等。

5.4.3.2傳代文檔記錄：建立細(xì)胞傳代的文檔記錄，包括傳代操作規(guī)程、傳代液配方和傳代效果的評(píng)

估。

5.4.3.3傳代的質(zhì)量控制：進(jìn)行定期的傳代質(zhì)量控制，包括檢查傳代后細(xì)胞的健康狀態(tài)和細(xì)胞數(shù)目。

細(xì)胞凍存

5.5.1IPSC來(lái)源肝前體細(xì)胞凍存操作應(yīng)嚴(yán)格遵照《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》和《干細(xì)胞制劑質(zhì)量控制

及臨床前研究指導(dǎo)原則》要求，保證無(wú)外源微生物污染。

5.5.2經(jīng)制備數(shù)量達(dá)到凍存要求的IPSC來(lái)源肝前體細(xì)胞系可進(jìn)行凍存操作，凍存細(xì)胞應(yīng)加入適當(dāng)?shù)?/p>

凍存保護(hù)液，遵循程序降溫原則，并在液氮中進(jìn)行保存。

5.5.3凍存液成分應(yīng)符合IPSC來(lái)源肝前體細(xì)胞分離與培養(yǎng)的基本要求，盡量采用國(guó)家已批準(zhǔn)的臨床

級(jí)產(chǎn)品或藥品輔料，二甲基亞砜含量不得超過(guò)10%，如必須使用動(dòng)物源性血清，應(yīng)確保其無(wú)特定動(dòng)物源

性病毒污染，嚴(yán)禁使用海綿狀腦病流行區(qū)來(lái)源的牛血清。

5.5.4凍存細(xì)胞應(yīng)標(biāo)明干細(xì)胞名稱、培養(yǎng)條件、代次、批次、操作人員、凍存日期等信息，并具有唯

一標(biāo)識(shí)。

5.5.5液氮凍存應(yīng)使用符合要求的液氮容器，氣相凍存，由專人負(fù)責(zé)，保證液氮充足，溫度恒定。

細(xì)胞復(fù)蘇

5.6.1將凍存管從冷凍罐中取出后，盡快放入37℃～42℃水浴鍋中，輕搖凍存管使其內(nèi)容物在3min

內(nèi)融化。用75%酒精擦拭凍存管外部后，將其移入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)。

5.6.2將干細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至含有培養(yǎng)基的離心管中進(jìn)行離心，去除冷凍保護(hù)劑。離心后用完全培養(yǎng)基

重懸干細(xì)胞，并將細(xì)胞按密度接種于培養(yǎng)瓶中，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

5.6.3復(fù)蘇后細(xì)胞的活率應(yīng)不低于75%。復(fù)蘇后細(xì)胞的接種密度應(yīng)適宜。

制劑制備

5.7.1復(fù)蘇檢測(cè)合格的工作庫(kù)細(xì)胞，按規(guī)定的接種密度進(jìn)行接種、培養(yǎng)；融合度達(dá)到70%～90%時(shí)，按

規(guī)定的制劑類(lèi)型制備成IPSC來(lái)源肝前體細(xì)胞制劑。

5.7.2按制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢驗(yàn)，檢驗(yàn)合格后進(jìn)行制劑放行。

6質(zhì)量鑒定

鑒定內(nèi)容

6.1.1細(xì)胞形態(tài)

應(yīng)呈克隆團(tuán)生長(zhǎng)、克隆邊緣清晰、核質(zhì)比高、形態(tài)均一，克隆內(nèi)細(xì)胞與細(xì)胞之間接觸緊密。

6.1.2染色體核型

正常核型應(yīng)為46，XY或46，XX。

6.1.3細(xì)胞存活率

未凍存細(xì)胞存活率≥90%，凍存復(fù)蘇后細(xì)胞存活率≥60%。

6.1.4細(xì)胞標(biāo)志蛋白

細(xì)胞表面標(biāo)志物SSEA3、SSEA4、TRA-1-60和TRA-1-81中的任意兩個(gè)陽(yáng)性率≥70.0%；細(xì)胞內(nèi)部標(biāo)志

物OCT4陽(yáng)性率≥70.0%、NANOG陽(yáng)性率≥70.0%。

6.1.5畸胎瘤形成

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應(yīng)具備在體內(nèi)形成具有三胚層結(jié)構(gòu)的畸胎瘤的能力。

6.1.6微生物

真菌、細(xì)菌、支原體、HIV、HBV、HCV、HTLV、EBV、HCMV、TP應(yīng)為陰性。

檢驗(yàn)方法

6.2.1細(xì)胞形態(tài)

體外二維培養(yǎng)條件下，使用倒置相差顯微觀察。

6.2.2染色體核型

按《中華人民共和國(guó)藥典》中“生物制品生產(chǎn)檢定用動(dòng)物細(xì)胞基質(zhì)制備及質(zhì)量控制”項(xiàng)檢測(cè)。

6.2.3細(xì)胞存活率

按附錄A進(jìn)行檢測(cè)。

6.2.4細(xì)胞標(biāo)志蛋白

按附錄B進(jìn)行檢測(cè)。

6.2.5外源重編程基因

按附錄C進(jìn)行檢測(cè)。

6.2.6畸胎瘤形成

按附錄D進(jìn)行檢測(cè)。

6.2.7微生物

6.2.7.1真菌、細(xì)菌

按《中華人民共和國(guó)藥典》中“1101無(wú)菌檢查法”項(xiàng)檢測(cè)。

6.2.7.2支原體

按《中華人民共和國(guó)藥典》中“3301衣原體檢查法”項(xiàng)檢測(cè)。

6.2.7.3HIV

按WS293核酸法檢測(cè)。

6.2.7.4HBV

按WS299核酸法檢測(cè)。

6.2.7.5HCV

按WS213核酸法檢測(cè)。

6.2.7.6HTLV、EBV、HCMV

按《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》核酸法檢驗(yàn)。

6.2.7.7TP

按WS273核酸法檢測(cè)。

6.2.7.8外源病毒因子檢測(cè)

按《中華人民共和國(guó)藥典》中“3302外源病毒因子檢查法”項(xiàng)檢測(cè)。

檢驗(yàn)分類(lèi)

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6.3.1批次質(zhì)量檢驗(yàn)

IPSC來(lái)源肝前體細(xì)胞制備機(jī)構(gòu)應(yīng)對(duì)同一生產(chǎn)周期、同一生產(chǎn)線、同一來(lái)源、同一代次、同一方法制

備出來(lái)的產(chǎn)品為一批，在同一批產(chǎn)品中隨機(jī)抽取3個(gè)最小包裝單元。制備機(jī)構(gòu)應(yīng)對(duì)每批次產(chǎn)品進(jìn)行質(zhì)量

檢驗(yàn)，確保工藝和質(zhì)量穩(wěn)定合格。

6.3.2復(fù)核質(zhì)量檢驗(yàn)

IPSC來(lái)源肝前體細(xì)胞制備機(jī)構(gòu)應(yīng)對(duì)每一批次干細(xì)胞制劑單獨(dú)留樣保存，詳細(xì)記錄批號(hào)、代次、生產(chǎn)

日期、來(lái)源等信息。定期由國(guó)家或地方相關(guān)部門(mén)授權(quán)的專業(yè)細(xì)胞檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)或?qū)嶒?yàn)室進(jìn)行IPSC來(lái)源肝前體

細(xì)胞制劑的質(zhì)量復(fù)核檢驗(yàn)，并出具檢驗(yàn)報(bào)告。復(fù)核質(zhì)量檢驗(yàn)報(bào)告出具時(shí)間應(yīng)在該批次IPSC來(lái)源肝前體細(xì)

胞制劑提出放行申請(qǐng)之前，并作為放行檢驗(yàn)參考。

評(píng)價(jià)結(jié)論

6.4.1批次檢驗(yàn)結(jié)果全部符合6.1的規(guī)定，判定為合格品；有1項(xiàng)及以上不符合本文件規(guī)定，則判為

不合格品。

6.4.2復(fù)核檢驗(yàn)結(jié)果全部符合6.1的規(guī)定，判定為合格品；有1項(xiàng)及以上不符合本文件規(guī)定，則判為

不合格品。

6

T/XXXXXXX—XXXX

A

A

附錄A

（規(guī)范性）

細(xì)胞存活率檢測(cè)細(xì)胞計(jì)數(shù)法

A.1儀器和設(shè)備

A.1.1顯微鏡。

A.1.2血球計(jì)數(shù)板。

A.2試劑

除特別說(shuō)明外，所用試劑均為分析純，檢測(cè)用水均為去離子水。

A.2.1磷酸鹽緩沖液：pH為7.4。

A.2.2臺(tái)盼藍(lán)染液：使用時(shí)，用磷酸鹽緩沖液（A.2.1）稀釋至0.4%（質(zhì)量濃度）。

A.3檢測(cè)步驟

A.3.1細(xì)胞懸液制備

根據(jù)檢測(cè)需求，收集待檢測(cè)細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖液(A.2.1)配制細(xì)胞懸液。

A.3.2細(xì)胞染色

按1：1的體積比將臺(tái)盼藍(lán)染液（A.2.2）與細(xì)胞懸液（A.3.1）混合均勻。

A.3.3細(xì)胞計(jì)數(shù)

將蓋玻片蓋在血球計(jì)數(shù)板（A.1.2）計(jì)數(shù)槽上，取10μL混合液（A.3.2）滴在一側(cè)計(jì)數(shù)室的蓋玻片

邊緣，另取10μL混合液，滴在另一側(cè)計(jì)數(shù)室的蓋玻片邊緣，使混合液充滿蓋玻片和計(jì)數(shù)板之間，靜置

30s，將計(jì)數(shù)板置顯微鏡（A.1.1）下對(duì)被染色的細(xì)胞和細(xì)胞總數(shù)分別進(jìn)行計(jì)數(shù)。

按照步驟A.3.2～A.3.3再重復(fù)測(cè)定一個(gè)樣品。

A.3.4細(xì)胞存活率計(jì)算

細(xì)胞存活率按式（A.1）進(jìn)行計(jì)算：

???

?=×100%··································································(A.1)

?

式中：

X——細(xì)胞存活率；

M——細(xì)胞總數(shù)；

S——染色的細(xì)胞數(shù)。

計(jì)算兩次計(jì)數(shù)細(xì)胞存活率結(jié)果的平均值，記為細(xì)胞平均存活率。

A.4精密度

在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過(guò)算術(shù)平均值的10%。

7

T/XXXXXXX—XXXX

B

B

附錄B

（規(guī)范性）

細(xì)胞標(biāo)志蛋白檢測(cè)細(xì)胞流式分析

B.1儀器和設(shè)備

B.1.1流式細(xì)胞儀。

B.1.2水平離心機(jī)。

B.1.3電子天平。

B.2試劑

本方法所用試劑均為分析純，除特別說(shuō)明外，實(shí)驗(yàn)用水均為GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水。

B.2.1氯化鈉（NaCl）：分析純。

B.2.2氯化鉀（KCl）：分析純。

B.2.3無(wú)水磷酸氫二鈉（Na2HPO4）：分析純。

B.2.4無(wú)水磷酸二氫鉀（K2HPO4）：分析純。

B.2.5多聚甲醛（PFA）：純度95%。

B.2.6氫氧化鈉（NaOH）：分析純。

B.2.7牛血清白蛋白(BSA)：純度≥98%。

B.2.8聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)。

B.2.9抗體。

B.2.10使用電子天平（B.1.3）稱量按照相應(yīng)要求配制流式檢測(cè)所需的液體：洗滌液、固定液、封閉

通透液、抗體稀釋液。

B.3樣品制備和保存

B.3.1洗滌液和固定后的樣品于2℃～8℃保存。

B.3.2固定液放入分裝容器中，密封并標(biāo)記，按照相關(guān)試劑使用說(shuō)明保存。

B.3.3相關(guān)抗體按說(shuō)明書(shū)保存。

B.4檢測(cè)步驟

B.4.1樣品準(zhǔn)備和固定

收集單細(xì)胞，使用水平離心機(jī)（B.1.2）250g，離心3min。棄上清，加適量固定液冰上放置10min，

使用水平離心機(jī)（B.1.2）取適量洗滌液洗滌3次～5次，每次3min～5min。

B.4.2封閉和通透

用封閉通透液重懸細(xì)胞并把細(xì)胞分成兩等份，分別作為實(shí)驗(yàn)組和同型對(duì)照抗體組，冰上孵育20min，

然后用洗滌液清洗一遍。

B.4.3抗體孵育

按照抗體說(shuō)明書(shū)進(jìn)行稀釋使用。

B.4.4過(guò)濾上機(jī)

用洗滌液重懸細(xì)胞，然后通過(guò)40μm濾網(wǎng)轉(zhuǎn)移到流式管中，按流式細(xì)胞儀（B.1.1）應(yīng)用手冊(cè)上機(jī)檢

測(cè)。

B.4.5圈門(mén)設(shè)定原則

8

T/XXXXXXX—XXXX

首先根據(jù)顆粒度和透光性設(shè)門(mén)圈出目標(biāo)細(xì)胞分群1，排除死細(xì)胞和其他雜細(xì)胞，然后根據(jù)同型對(duì)照

抗體組熒光強(qiáng)度，在分群1的基礎(chǔ)上畫(huà)出陽(yáng)性細(xì)胞群2，排除沒(méi)有被熒光抗體標(biāo)記的陰性細(xì)胞。同型對(duì)照

抗體組作為陰性對(duì)照。

B.5結(jié)果分析

得到的檢測(cè)結(jié)果用軟件綜合分析，具體參考其軟件使用說(shuō)明。

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C

C

附錄C

（規(guī)范性）

外源重編程基因定量PCR法

C.1儀器和設(shè)備

定量PCR擴(kuò)增儀。

C.2試劑

C.2.1商品化定量PCR擴(kuò)增試劑盒。

C.2.2商品化基因組DNA提取試劑盒。

C.2.3目標(biāo)基因PCR引物。

C.3檢測(cè)步驟

C.3.1提取樣品基因組DNA。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

C.3.2使用DNA定量標(biāo)準(zhǔn)品使用定量PCR擴(kuò)增儀(C.1.1)進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增，建立目標(biāo)基因檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲

線。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

C.3.3使用樣品基因組DNA使用定量PCR擴(kuò)增儀(C.1.1)進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增，檢測(cè)目標(biāo)基因濃度。按照試

劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

C.3.4參照標(biāo)準(zhǔn)曲線確定目標(biāo)基因濃度。

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T/XXXXXXX—XXXX

D

D

附錄D

（規(guī)范性）

分化潛能檢測(cè)畸胎瘤形成法

D.1儀器和設(shè)備

D.1.1血球計(jì)數(shù)板。

D.1.2顯微鏡。

D.1.3水平離心機(jī)。

D.1.4電子天平。

D.1.5包埋機(jī)。

D.1.6切片機(jī)。

D.1.7展片機(jī)。

D.1.8載玻片。

D.1.9蓋玻片。

D.1.10烘箱。

D.1.11通風(fēng)櫥。

D.2試劑

本方法所用試劑均為分析純，除特別說(shuō)明外，實(shí)驗(yàn)用水均為GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水。

D.2.1磷酸鹽緩沖液。

D.2.2消化酶。

D.2.34%臺(tái)盼藍(lán)染液。

D.2.4無(wú)水乙醇（C2H5OH）:分析純。

D.2.5二甲苯（C8H10）:分析純。

D.2.6石蠟（熔點(diǎn)60℃）。

D.2.74%多聚甲醛。

D.2.8蘇木素染液。

D.2.9伊紅染液。

D.2.10中性樹(shù)膠。

D.3檢測(cè)步驟

D.3.1細(xì)胞樣品的準(zhǔn)備

D.3.1.1細(xì)胞消化

離心收集細(xì)胞于離心管中，用生理鹽水輕輕重懸細(xì)胞，避免形成氣泡或殘留細(xì)胞團(tuán)塊。

D.3.1.2細(xì)胞計(jì)數(shù)

根據(jù)附錄A方法測(cè)定，計(jì)算細(xì)胞懸液活細(xì)胞濃度。

D.3.2細(xì)胞移植

用注射器將1×106～1×107個(gè)人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞注射到6周齡～8周齡的免疫缺陷型小鼠皮下，或肌肉，

或睪丸白膜下的生精小管周隙，或腎背膜下等部位。

D.3.3畸胎瘤收樣及處理

D.3.3.1收樣

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人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞注射約6周～10周后（確?；チ霾怀^(guò)荷載小鼠體重的15%）,對(duì)小鼠實(shí)施安樂(lè)

死。剝離受體小鼠上的畸胎瘤并進(jìn)行切割（體積不大于5mm×5mm×2mm）,將畸胎瘤組織塊用4%多聚

甲醛進(jìn)行4℃過(guò)夜固定。

D.3.3.2石蠟切片及HE染色

對(duì)上述固定好的樣本進(jìn)行HE染色，鏡下觀察并拍照。

D.4結(jié)果分析

觀察到來(lái)源于3個(gè)胚層的組織，包括內(nèi)胚層來(lái)源的消化道上皮腺體樣組織、中胚層來(lái)源的軟骨組織，

以及外胚層來(lái)源神經(jīng)組織等，即證明所接種的人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞具有體內(nèi)向3個(gè)胚層組織分化的多能

性。

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參考文獻(xiàn)

[1]干細(xì)胞制劑質(zhì)量控制及臨床前研究指導(dǎo)原則（試行）（國(guó)衛(wèi)辦科教發(fā)〔2015〕46號(hào)）

[2]WHO實(shí)驗(yàn)室生物安全手冊(cè)(第三版)

[3]藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（衛(wèi)生部令第79號(hào)）

[4]中華人民共和國(guó)藥典（2020年版）

13

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目次

前言.................................................................................II

1范圍...............................................................................1

2規(guī)范性引用文件.....................................................................1

3術(shù)語(yǔ)和定義、縮略語(yǔ).................................................................1

4基本要求...........................................................................1

5制備過(guò)程...........................................................................2

6質(zhì)量鑒定...........................................................................4

附錄A（規(guī)范性）細(xì)胞存活率檢測(cè)細(xì)胞計(jì)數(shù)法............................................7

附錄B（規(guī)范性）細(xì)胞標(biāo)志蛋白檢測(cè)細(xì)胞流式分析........................................8

附錄C（規(guī)范性）外源重編程基因定量PCR法..........................................10

附錄D（規(guī)范性）分化潛能檢測(cè)畸胎瘤形成法...........................................11

參考文獻(xiàn).............................................................................13

I

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IPSC來(lái)源肝前體細(xì)胞制備及質(zhì)量鑒定規(guī)范

1范圍

本文件規(guī)定了IPSC來(lái)源肝前體細(xì)胞的術(shù)語(yǔ)和定義、基本要求、制備過(guò)程、質(zhì)量鑒定。

本文件適用于IPSC來(lái)源肝前體細(xì)胞的制備與質(zhì)量鑒定。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB3095環(huán)境空氣質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求

GB50073潔凈廠房設(shè)計(jì)規(guī)范

GB50346生物安全實(shí)驗(yàn)室建筑技術(shù)規(guī)范

GB50591潔凈室施工及驗(yàn)收規(guī)范

3術(shù)語(yǔ)和定義、縮略語(yǔ)

術(shù)語(yǔ)和定義

下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。

3.1.1

誘導(dǎo)多能干細(xì)胞inducedpluripotentstemcell；IPSC

由人體細(xì)胞經(jīng)重編程而獲得的具有自我更新能力和向三胚層細(xì)胞分化潛能的一種干細(xì)胞。

3.1.2

凍存cryopreservation

經(jīng)過(guò)程序降溫冷凍，并利用深低溫冷凍儲(chǔ)存技術(shù)，以減少細(xì)胞代謝活動(dòng)，保存細(xì)胞生物學(xué)活性。

3.1.3

復(fù)蘇thawing

細(xì)胞從脫離生長(zhǎng)狀態(tài)重新獲得生長(zhǎng)活力的過(guò)程。

3.1.4

細(xì)胞活率cellviability

能夠增值、保持正常代謝活性的細(xì)胞占全部細(xì)胞的百分比。

縮略語(yǔ)

下列縮略語(yǔ)適用于本文件。

HAV：甲型肝炎病毒（HepatitisAVirus）

HBV：乙型肝炎病毒（HepatitisBVirus）

HCV：丙型肝炎病毒（HepatitisCVirus）

HIV：人類(lèi)免疫缺陷病毒（HumanImmunodeficiencyVirus）

IPSC：誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（InducedPluripotentStemCell）

4基本要求

場(chǎng)地與設(shè)施

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