31重組DNA技術(shù)的基本工具課件-人教版高中生物選擇性必修三（29張）

第1節(jié)重組DNA技術(shù)的基本工具第3章基因工程河北峰峰第二中學(xué)提取抗蟲基因棉花細(xì)胞蘇云金芽孢桿菌(有抗蟲特征)

普通棉花

(無抗蟲特征)與載體DNA拼接，導(dǎo)入(含抗蟲基因)

棉花植株(有抗蟲特征)培育抗蟲棉的簡要過程基因工程實(shí)例：基因工程的概念：

基因工程是指按照人們的愿望，通過轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物制品。從技術(shù)操作層面看，由于基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)和施工的，因此又叫重組DNA技術(shù)。1.別名：2.原理：3.操作對(duì)象：4.操作水平：5.結(jié)果：重組DNA技術(shù)基因分子水平基因重組賦予生物新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物制品科技探索之路基因工程的誕生和發(fā)展1944年，艾弗里等人通過肺炎鏈球菌的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，不僅證明了遺傳物質(zhì)是DNA，還證明了DNA可以在同種生物的不同個(gè)體之間轉(zhuǎn)移。1950年，埃特曼發(fā)明了一種測(cè)定氨基酸序列的方法。2年后，桑格首次完成了對(duì)胰島素氨基酸序列的測(cè)定。1958年，梅塞爾森和斯塔爾用實(shí)驗(yàn)證明了DNA的半保留復(fù)制。隨后不久，克里克提出中心法則。1953年，沃森和克里克建立了DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型并提出了遺傳物質(zhì)自我復(fù)制的假說。1961年，尼倫伯格和馬太破譯了第一個(gè)編碼氨基酸的密碼子。截至1966年，64個(gè)密碼子均被成功破譯。1967年，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，在細(xì)菌擬核DNA之外的質(zhì)粒有自我復(fù)制能力，并可以在細(xì)菌細(xì)胞間轉(zhuǎn)移。1970年，科學(xué)家在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)限制性內(nèi)切核酸酶（簡稱限制酶）。20世紀(jì)70年代初，多種限制酶、DNA連接酶和逆轉(zhuǎn)錄酶被相繼發(fā)現(xiàn)。這些發(fā)現(xiàn)為DNA的切割、連接以及功能基因的獲得創(chuàng)造了條件。1972年，伯格首先在體外進(jìn)行了DNA改造的研究，成功構(gòu)建了第一個(gè)體外重組DNA分子。1973年，科學(xué)家證明質(zhì)?？梢宰鳛榛蚬こ痰妮d體，構(gòu)建重組DNA，導(dǎo)入受體細(xì)胞，使外源基因在原核細(xì)胞中成功表達(dá)，并實(shí)現(xiàn)物種間的基因交流。至此，基因工程正式問世。1977年，桑格等科學(xué)家發(fā)明了DNA序列分析的方法，為基因序列圖的繪制提供了可能。此后，DNA合成儀的問世為體外合成DNA提供了方便。1982年，第一個(gè)基因工程藥物-重組人胰島素被批準(zhǔn)上市?；蚬こ趟幬锍蔀槭澜绺鲊芯亢屯顿Y開發(fā)的熱點(diǎn)。1983年，科學(xué)家采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法培育出世界上第一例轉(zhuǎn)基因煙草。此后，基因工程進(jìn)入了迅速發(fā)展的階段。1985年，穆里斯等人發(fā)明了PCR，為獲取目的基因提供了有效手段。1990年，人類基因組計(jì)劃啟動(dòng)。2003年，該計(jì)劃的測(cè)序任務(wù)順利完成。21世紀(jì)以來，科學(xué)家發(fā)明了多種高通量測(cè)序技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)低成本測(cè)定大量核酸序列，加速了人們對(duì)基因組序列的了解。2013年，華人科學(xué)家張鋒及其團(tuán)隊(duì)首次報(bào)道利用最新的基因組編輯技術(shù)——CRISPR（成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)）技術(shù)編輯了哺乳動(dòng)物基因組。該技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)特定基因的定點(diǎn)插入、敲除或替換。1984年，我國科學(xué)家朱作言領(lǐng)導(dǎo)的團(tuán)隊(duì)培育出世界上第一條轉(zhuǎn)基因魚。從社會(huì)中來

番木瓜容易受番木瓜環(huán)斑病毒的侵襲。當(dāng)番木瓜被這種病毒感染后，產(chǎn)量會(huì)大大下降?？茖W(xué)家通過精心設(shè)計(jì)，用“分子工具”培育出了轉(zhuǎn)基因番木瓜，它可以抵御番木瓜環(huán)斑病毒。

DNA雙螺旋的直徑只有2nm,對(duì)如此微小的分子進(jìn)行操作，是一項(xiàng)非常精細(xì)的工作，更需要專門的“分子工具”。那么，科學(xué)家究竟用到了哪些“分子工具”？這些“分子工具”各具有什么特征呢？轉(zhuǎn)基因番木瓜(左）與非轉(zhuǎn)基因番木瓜(右）工具分子手術(shù)刀分子縫合針分子運(yùn)輸車限制性內(nèi)切核酸酶：DNA連接酶：載體：準(zhǔn)確切割DNA分子將DNA片段連接起來將體外重組好的DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞培育轉(zhuǎn)基因番木瓜“分子手術(shù)刀”準(zhǔn)確切割DNA分子“分子縫合針”“分子運(yùn)輸車”將DNA片段連接起來將體外重組好的DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞一、限制性內(nèi)切核酸酶——“分子手術(shù)刀”1.簡稱：限制酶2.來源：主要是從原核生物中分離純化出來的。3.作用：

識(shí)別雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的磷酸二酯鍵斷開。4.作用部位：特定部位的磷酸二酯鍵ATCGTAGC5’3’5’3’磷酸二酯鍵5.識(shí)別序列：

大多數(shù)限制酶的識(shí)別序列由6個(gè)核苷酸組成，也有少數(shù)限制酶的識(shí)別序列由4個(gè)、8個(gè)或其他數(shù)量的核苷酸組成。EcoRⅠ5’…G-A-A-T-T-C…3’3’…C-T-T-A-A-G…5’SmaⅠ5’…C-C-C-G-G-G…3’3’…G-G-G-C-C-C…5’6.限制酶的命名：

用生物屬名的頭一個(gè)字母與種加詞的頭兩個(gè)字母，組成了3個(gè)字母的略語，以此來表示這個(gè)酶是從哪種生物中分離出來的。例如，一種限制酶是從大腸桿菌(Escherichiacoli)的R型菌株分離來的，就用字母EcoR表示；如果它是從大腸桿菌R型菌株中分離出來的第一種限制酶，則進(jìn)一步表示成EcoRI。7.切割結(jié)果：DNA分子經(jīng)限制酶切割產(chǎn)生的DNA片段末端通常有兩種形式——_________和_______黏性末端平末端當(dāng)限制酶在它識(shí)別序列的___________將DNA分子的兩條鏈分別切開時(shí)，產(chǎn)生的是__________；當(dāng)限制酶在它識(shí)別序列的_________切開時(shí)，產(chǎn)生的是______；中軸線兩側(cè)黏性末端中軸線處平末端黏性末端黏性末端2024/11/18

實(shí)例1—EcoRⅠ限制酶：

識(shí)別序列為GAATTC，

切割部位為GA之間的磷酸二酯鍵。

實(shí)例2——SmaⅠ限制酶：

識(shí)別序列為CCCGGG

切割部位為CG之間的磷酸二酯鍵。形成黏性末端平末端形成平末端課堂練習(xí)：寫出下列限制酶切割形成的黏性末端BamHⅠ____EcoRⅠ___HindⅢ___BglⅡ___GATCAATTAGCTGATC思考：你從中發(fā)現(xiàn)什么現(xiàn)象了？不同的限制酶可能切割形成相同的黏性末端你能根據(jù)所掌握的知識(shí)，推測(cè)限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么嗎？

原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，所以它在長期的進(jìn)化過程中形成了一套完善的防御機(jī)制。限制酶就是它的一種防御性工具。當(dāng)外源DNA入侵時(shí)，它會(huì)利用限制酶來切割外源DNA，使之失效，以保證自身安全。

所以，簡單來說：限制酶在原核生物中起到的作用為：

切割外源DNA、使之失效，以保證自身安全試推測(cè)限制酶為什么不會(huì)切割自身的DNA？原核生物中不存在該酶的識(shí)別序列或識(shí)別序列已被修飾二、分子縫合針—DNA連接酶1.作用：將兩個(gè)DNA片段連接起來，恢復(fù)被限制酶切開的磷酸二酯鍵。G

C

TT

AA

AA

T

T

C

GGCTTAA

AA

TT

C

GDNA連接酶和DNA聚合酶是一回事嗎？為什么？AATT

GCAATTAATTDNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶種類DNA聚合酶DNA連接酶不同點(diǎn)作用實(shí)質(zhì)作用結(jié)果模板相同點(diǎn)催化單個(gè)核苷酸加到已有核苷酸片段的3’末端的羥基上，形成磷酸二酯鍵催化兩個(gè)DNA片段之間形成磷酸二酯鍵催化形成與模板鏈互補(bǔ)的DNA鏈，形成新的雙鏈DNA分子催化具有互補(bǔ)黏性末端或平末端的DNA片段連接起來，形成重組DNA分子需要不需要①化學(xué)本質(zhì)都是蛋白質(zhì)②都是催化形成磷酸二酯鍵DNA連接酶和DNA聚合酶功能比較2.分類：種類E·coli

DNA連接酶T4DNA連接酶來源功能特性相同點(diǎn)大腸桿菌T4噬菌體只能將具有互補(bǔ)黏性末端的DNA片段連接起來，不能連接具有平末端的DNA片段既可以連接雙鏈DNA片段互補(bǔ)的黏性末端，又可以連接雙鏈DNA片段的平末端（但連接平末端的效率相對(duì)較低）恢復(fù)的都是磷酸二酯鍵三、基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體——“分子運(yùn)輸車”1.作用：將外源基因送入受體細(xì)胞2.種類：質(zhì)粒、噬菌體和動(dòng)植物病毒等。種類用途不同點(diǎn)質(zhì)粒、噬菌體植物病毒動(dòng)物病毒將外源基因?qū)氪竽c桿菌等受體細(xì)胞將外源基因?qū)胫参锛?xì)胞將外源基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞來源不同，在大小、結(jié)構(gòu)、復(fù)制方式以及可以插入外源DNA片段的大小也有很大差別3.作為載體需具備的條件（1）有一個(gè)至多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)，供外源DNA片段（基因）插入其中。（2）能在細(xì)胞中進(jìn)行自我復(fù)制或整合到受體DNA上，隨受體DNA同步復(fù)制。（3）常有特殊的標(biāo)記基因（如四環(huán)素抗性基因、氨芐青霉素抗性基因等），便于重組DNA分子的篩選。利用標(biāo)記基因進(jìn)行篩選示例：4.最常用的運(yùn)載體——質(zhì)粒（1）質(zhì)粒的化學(xué)本質(zhì)：質(zhì)粒是一種____的、結(jié)構(gòu)簡單的、獨(dú)立于______________或_______________之外，并具有自我復(fù)制能力的____________分子裸露真核細(xì)胞細(xì)胞核原核細(xì)胞擬核DNA環(huán)狀雙鏈DNA（2）基因工程中使用質(zhì)粒的特點(diǎn)：

在基因工程操作中，真正被用作載體的質(zhì)粒，都是天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上進(jìn)行過_________的；這些質(zhì)粒上常有特殊的標(biāo)記基因，便于__________________；人工改造重組DNA分子的篩選重組DNA分子…TATCGTACGATAGGTACTTAA

…ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC…GCCGTATG……TCCTAG…AGGATCTTAAGAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATGAATTCCATAC…

GGTATG…GAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATG重組DNA分子1.剪刀和透明膠條分別代表哪種“分子工具”？剪刀代表限制酶；透明膠條代表DNA連接酶。2.你制作的黏性末端的堿基能不能互補(bǔ)配對(duì)?如果不能，可能是什么原因造成的？如果制作的黏性末端的堿基不能互補(bǔ)配對(duì)，可能是剪切位點(diǎn)或連接位點(diǎn)選得不對(duì)，也可能是其他原因。3.你插入的DNA片段能稱得上一個(gè)基因嗎？不能，因?yàn)榛虻拈L度一般在100個(gè)堿基對(duì)以上。DNA的粗提取與鑒定1.實(shí)驗(yàn)原理：（1）DNA不溶于酒精，但某些蛋白質(zhì)溶于酒精。（2）DNA在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2mol/LNaCl溶液。（3）在一定溫度下，DNA遇二苯胺試劑會(huì)呈現(xiàn)藍(lán)色。DNA、RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等在物理和化學(xué)性質(zhì)方面存在差異，可以利用這些差異，選用適當(dāng)?shù)奈锢砘蚧瘜W(xué)方法去除其他成分，對(duì)DNA進(jìn)行提取。DNA含量相對(duì)較高的生物組織，如新鮮洋蔥、香蕉、菠菜、菜花和豬肝等

不能選擇哺乳動(dòng)物成熟的紅細(xì)胞，因?yàn)椴溉閯?dòng)物成熟的紅細(xì)胞中沒有細(xì)胞核和線粒體，幾乎不含DNA二、材料用具1.選材：注意：2.試劑：①研磨液②體積分?jǐn)?shù)為95%的酒精③2mol/L的NaCl溶液④二苯胺試劑⑤蒸餾水含有NaCl、EDTA、SDS、Tris和HCl析出DNA溶解DNA鑒定DNA，要現(xiàn)配現(xiàn)用三、方法步驟：取材、研磨過濾或離心取上清液預(yù)冷酒精析出DNA或離心收集沉淀中的DNANaCl溶液溶解DNA并鑒定

抑制核酸水解酶的活性，進(jìn)而抑制DNA降解；抑制DNA分子運(yùn)動(dòng)，使DNA易形成沉淀析出；1.取材、研磨：

稱取30g洋蔥，切碎，然后放入研缽中，倒入10mL

研磨液，充分研磨研磨的目的：破碎細(xì)胞，使核物質(zhì)容易溶解在研磨液中2.過濾或離心取上清液：

在漏斗中墊上紗布，將洋蔥研磨液過濾到燒杯中，在4℃冰箱中放置幾分鐘后，再取上清液。

也可直接將研磨液倒入塑料離心管中，1500r/min的轉(zhuǎn)速下離心5min，再取上清液放入燒杯中。①上清液中除DNA之外，可能含有哪些雜質(zhì)？可能含有核蛋白、多糖等雜質(zhì)②低溫放置幾分鐘的作用：3.預(yù)冷酒精析出DNA或離心收集沉淀中的DNA

在上清液中加入體積相等的、預(yù)冷的酒精溶液(體積分?jǐn)?shù)為95%)，靜置2-3min，溶液中出現(xiàn)的白色絲狀物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一個(gè)方向攪拌，卷起絲狀物，并用濾紙吸去上面的水分；

或?qū)⑷芤旱谷胨芰想x心管中