微生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù) 課件 23項(xiàng)目二十三：非發(fā)酵菌鑒定

項(xiàng)目二十三非發(fā)酵菌鑒定學(xué)習(xí)目標(biāo)1．掌握銅綠假單胞菌的主要生物學(xué)特性、微生物學(xué)檢驗(yàn)方法及鑒定依據(jù)。2．熟悉不動(dòng)桿菌屬和產(chǎn)堿桿菌屬主要生物學(xué)特性、微生物學(xué)檢驗(yàn)方法及鑒定依據(jù)。3．了解常見非發(fā)酵革蘭陰性桿菌的臨床意義。4．具有正確采集和處理常見非發(fā)酵革蘭陰性桿菌檢驗(yàn)標(biāo)本及進(jìn)行相關(guān)檢測的能力。5．能正確選擇試驗(yàn)項(xiàng)目對(duì)常見非發(fā)酵革蘭陰性桿菌進(jìn)行檢驗(yàn)，能正確判斷和分析試驗(yàn)結(jié)果并發(fā)出檢驗(yàn)報(bào)告。項(xiàng)目二十三非發(fā)酵菌鑒定思維導(dǎo)圖項(xiàng)目二十三非發(fā)酵菌鑒定一、假單胞菌屬的鑒定項(xiàng)目二十三非發(fā)酵菌鑒定一、假單胞菌屬的鑒定概述1.假單胞菌屬（Pseudomonas）為嚴(yán)格需氧、有鞭毛、無芽胞、無莢膜的革蘭陰性桿菌，氧化酶試驗(yàn)均陽性，是假單胞菌科的代表菌屬，包括200多個(gè)菌種。2.假單胞菌屬是一類無芽胞、散在排列的革蘭陰性桿菌，菌體直或微彎，有單鞭毛或叢鞭毛，運(yùn)動(dòng)活潑，專性需氧。3.與人類關(guān)系密切的有銅綠假單胞菌、熒光假單胞菌、惡臭假單胞菌、產(chǎn)堿假單胞菌等，是醫(yī)院感染的主要病原菌。1.生物學(xué)性狀（1）形態(tài)與染色：革蘭陰性細(xì)長桿菌，有莢膜，單鞭毛，運(yùn)動(dòng)活潑一、假單胞菌屬的鑒定（一）銅綠假單胞菌1.生物學(xué)性狀（2）培養(yǎng)特性：營養(yǎng)要求不高，專性需氧，4℃不生長，42℃可生長。普通培養(yǎng)基上生長，80～90％產(chǎn)生各種水溶性色素，如綠膿素和熒光素。一、假單胞菌屬的鑒定（一）銅綠假單胞菌1.生物學(xué)性狀（3）生化反應(yīng)：氧化酶陽性，氧化分解葡萄糖、木糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，液化明膠，還原硝酸鹽為亞硝酸鹽并產(chǎn)生氮?dú)?，吲哚陰性，利用枸櫞酸鹽，精氨酸雙水解酶陽性。一、假單胞菌屬的鑒定（一）銅綠假單胞菌1.生物學(xué)性狀（4）抗原構(gòu)造

菌體（O）抗原

鞭毛（H）抗原外膜蛋白：具有屬的特異性脂多糖：具有型特異性一、假單胞菌屬的鑒定（一）銅綠假單胞菌1.生物學(xué)性狀（5）抵抗力：抵抗力強(qiáng)，對(duì)干燥、紫外線有抵抗力，對(duì)熱抵抗力不強(qiáng)，56℃30min可被殺死，對(duì)某些消毒劑敏感，1%石炭酸處理5min即被殺死，臨床分離菌株對(duì)多種抗生素不敏感一、假單胞菌屬的鑒定（一）銅綠假單胞菌2.臨床意義（1）主要致病物質(zhì)：

銅綠假單胞菌有多種致病因子，包括結(jié)構(gòu)成分、毒素和酶，如粘附素、多糖莢膜樣物質(zhì)、內(nèi)毒素、外毒素A、彈性蛋白酶、磷脂酶C等（2）所致疾病：銅綠假單胞菌是條件致病菌，免疫力低下者易感染，是醫(yī)院內(nèi)感染的主要菌之一。臨床表現(xiàn)多樣，引起化膿性感染，如燒傷感染、呼吸道感染、中耳炎、眼角膜炎等，合并敗血癥者死亡率高。（3）藥物敏感性：對(duì)抗假單胞菌青霉素類、氨基糖苷類、環(huán)丙沙星、頭孢吡肟、頭孢他定、美羅培能、亞胺培南敏感。醫(yī)院獲得性銅綠假單胞菌較社區(qū)分離株有較高的耐藥性，常顯示多重耐藥。一、假單胞菌屬的鑒定（一）銅綠假單胞菌3.微生物學(xué)檢驗(yàn)（1）標(biāo)本采集：根據(jù)疾病及檢查目的分別采集不同的臨床標(biāo)本，如血液、痰液、腦脊液、胸（腹）水、尿液、膿液、分泌液、糞便等。醫(yī)院環(huán)境檢測可從空氣、水、物體表面等處采樣。一、假單胞菌屬的鑒定（一）銅綠假單胞菌3.微生物學(xué)檢驗(yàn)（2）檢驗(yàn)程序標(biāo)本增菌

分離培養(yǎng)（血平板）最后鑒定可疑菌落（性狀、色素）初步鑒定涂片染色鏡檢血標(biāo)本涂片鏡檢氧化酶菌落特征綠膿素氣味42℃生長分型生化鑒定：O/F

O枸櫞酸鹽利用＋精氨酸雙水解＋乙酰胺酶＋明膠液化＋一、假單胞菌屬的鑒定（一）銅綠假單胞菌3.微生物學(xué)檢驗(yàn)（3）檢驗(yàn)方法1）直接鏡檢：涂片、革蘭染色2）分離培養(yǎng)：直接接種或增菌后接種血平板和MAC3）鑒定：根據(jù)菌落特征、色素、菌體形態(tài)、生化反應(yīng)等作出鑒定。對(duì)無色素菌株應(yīng)與其他假單胞菌鑒別一、假單胞菌屬的鑒定（一）銅綠假單胞菌銅綠假單胞菌與其他假單胞菌的鑒別

銅綠假單胞菌熒光假單胞菌惡臭假單胞菌韋龍氏假單胞菌產(chǎn)堿假單胞菌氧化酶999710010096溴化-16-烷基-3-甲胺生長948987ND156.5%氯化鈉生長6543100ND4142℃生長1000000硝酸鹽還原9819010054青膿素6596931000精氨酸雙水解酶1009710010012尿素水解575275250明膠水解821000130葡萄糖產(chǎn)酸971001001000枸櫞酸鹽9593100ND65一、假單胞菌屬的鑒定（一）銅綠假單胞菌1.生物學(xué)特性（1）形態(tài)與染色：為革蘭氏陰性桿菌，大小為0.7～0.8μm×2.3～2.8μm，有鞭毛，無芽孢，有數(shù)根極生鞭毛。（2）培養(yǎng)特性：需氧，最適生長溫度是25～30℃，4℃生長，42℃不生長，在血平板上30℃孵育24h后形成灰白色、扁平稍隆起、濕潤、光滑、邊緣整齊的菌落，無溶血，挑取菌落呈黏絲狀。能分泌黃綠色熒光色素發(fā)出熒光一、假單胞菌屬的鑒定（二）熒光假單胞菌2.臨床意義

熒光假單胞菌具有嗜冷性，可在血庫儲(chǔ)存的血中繁殖，若輸入含有此種細(xì)菌的庫存血液或血制品，可導(dǎo)致敗血癥、感染性休克或血管內(nèi)凝血等嚴(yán)重后果，其內(nèi)毒素的磷脂部分，可導(dǎo)致輸血后不可逆的休克。3.微生物學(xué)檢驗(yàn)

熒光假單胞菌生化能力活躍，氧化酶陽性，觸酶陽性，能利用葡萄糖和果糖，有些菌株能從蔗糖合成果聚糖，液化明膠。在4℃生長和液化明膠(4～7d)，這兩個(gè)特性可與惡臭假單胞菌相鑒別，后者均陰性。一、假單胞菌屬的鑒定（二）熒光假單胞菌1.生物學(xué)特性（1）形態(tài)與染色：革蘭陰性桿菌，有些菌株為卵圓形，單端叢毛菌，運(yùn)動(dòng)活潑。（2）培養(yǎng)特性：專性需氧，最適生長溫度25～30℃，4℃和42℃均不生長，在血平板上形成光滑、濕潤、邊緣整齊的灰色菌落，不溶血，菌落與銅綠假單胞菌相似，但只產(chǎn)生熒光素，不產(chǎn)生綠膿素，借此可與銅綠假單胞菌相區(qū)別，其陳舊培養(yǎng)物有腥臭味。一、假單胞菌屬的鑒定（三）惡臭假單胞菌2.臨床意義

惡臭假單胞菌為魚的一種致病菌，常從腐敗的魚中檢出，可作為人類咽部的正常菌群，是人類少見的條件致病菌，偶從人類尿道感染、皮膚感染和骨髓炎標(biāo)本中分離出，分泌物有腥臭味。惡臭假單胞菌感染通常病情較重。

3.微生物學(xué)檢驗(yàn)

惡臭假單胞菌氧化酶、過氧化氫酶、枸緣酸利用陽性，精氨酸雙水解酶陽性，硝酸鹽還原、鳥氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶、明膠酶、尿素酶、V-P反應(yīng)、吲哚反應(yīng)陰性。一、假單胞菌屬的鑒定（三）惡臭假單胞菌1.生物學(xué)特性（1）形態(tài)與染色：革蘭氏陰性菌桿菌，直徑0.5μm×2～3μm；有極生單鞭毛。（2）培養(yǎng)特性：最適生長溫度35℃，專性需氧，在血平板上形成圓形，邊緣整齊，隆起，表面光滑，濕潤的菌落。一、假單胞菌屬的鑒定（四）產(chǎn)堿假單胞菌2.臨床意義

產(chǎn)堿假單胞菌為自然界腐生菌，廣泛存在于多種水源中，是醫(yī)療用水污染的主要原因，如污染新生兒溫箱濕化用水和氧氣濕化用水，極容易導(dǎo)致新生兒呼吸道感染甚至敗血癥等。還可引起化膿性腦膜炎、尿道炎、肺炎、心內(nèi)膜炎、新生兒敗血癥、膿胸眼部感染及膿腫等感染性疾病。3.微生物學(xué)檢驗(yàn)

產(chǎn)堿假單胞菌氧化酶陽性，O/F試驗(yàn)為產(chǎn)堿型，42℃不生長，不產(chǎn)色素，不分解尿素，不液化明膠。一、假單胞菌屬的鑒定（四）產(chǎn)堿假單胞菌二、不動(dòng)桿菌屬的鑒定項(xiàng)目二十三非發(fā)酵菌鑒定二、不動(dòng)桿菌屬的鑒定1.形態(tài)與染色

革蘭陰性桿菌，常成雙排列，多數(shù)有莢膜、無芽孢、無鞭毛。2.培養(yǎng)特性專性需要，營養(yǎng)要求不高，最適溫度35℃，鮑曼不動(dòng)桿菌42℃可生長。（一）生物學(xué)特性2.培養(yǎng)特性血平板上菌落圓形凸起，中等大小，光滑、邊緣整齊、灰白色的菌落，部分菌落呈粘液狀，不產(chǎn)色素；在麥康凱平板上形成粉紅色菌落。二、不動(dòng)桿菌屬的鑒定（一）生物學(xué)特性醋酸鈣不動(dòng)桿菌菌落（MAC）鮑曼不動(dòng)桿菌菌落（MAC）二、不動(dòng)桿菌屬的鑒定（一）生物學(xué)特性3.生化反應(yīng)

氧化酶陰性，觸酶陽性，硝酸鹽還原陰性，O/F為氧化型。動(dòng)力、甲基紅、V-P、H2S和硝酸鹽還原試驗(yàn)陰性。不同的菌種對(duì)糖的氧化分解能力不同，醋酸鈣不動(dòng)桿菌、鮑曼不動(dòng)桿菌氧化分解葡萄糖和乳糖產(chǎn)酸，多數(shù)菌種能利用枸櫞酸鹽。二、不動(dòng)桿菌屬的鑒定（一）生物學(xué)特性1.致病物質(zhì)

致病機(jī)制尚不完全清楚，未發(fā)現(xiàn)不動(dòng)桿菌能分泌毒素或細(xì)胞溶解素，其致病力主要由莢膜、菌毛、產(chǎn)物酶、脂質(zhì)及載體等組成。2.所致疾病

本屬細(xì)菌為條件致病菌，在非發(fā)酵菌中本菌的分離率僅次于銅綠假單胞菌，也是醫(yī)院感染的主要病原菌之一，常引起呼吸道、消化道及泌尿生殖道感染。3.藥物敏感性

對(duì)青霉素、氨芐西林和頭孢拉啶耐藥；多數(shù)菌株對(duì)氯霉素耐藥；對(duì)復(fù)方新諾明、哌拉西林/他唑巴坦、多西環(huán)素、和氟喹諾酮類較敏感。二、不動(dòng)桿菌屬的鑒定（二）臨床意義1.標(biāo)本采集

呼吸道、泌尿道及化膿感染的患者可采集尿液、痰液及膿液等標(biāo)本；對(duì)疑為菌血癥和腦膜炎的患者可采集血液和腦脊液標(biāo)本。2.檢驗(yàn)方法

（1）顯微鏡檢查：

涂片革蘭染色鏡檢，革蘭陰性球桿菌，常成雙排列，有莢膜，有菌毛。

（2）分離培養(yǎng)：在血瓊脂培養(yǎng)基上，醋酸鈣不動(dòng)桿菌菌落較大，洛菲不動(dòng)桿菌菌落較小，圓形、凸起、表面光滑、邊緣整齊、灰白色、有黏性的β溶血菌落。在麥康凱瓊脂平板上，醋酸鈣不動(dòng)桿菌形成粉紅色的菌落，而洛菲不動(dòng)桿菌形成黃色菌落。（3）生化反應(yīng)：一般不產(chǎn)生色素，少數(shù)菌株可產(chǎn)生色素，氧化酶陰性，動(dòng)力陰性，硝酸鹽還原試驗(yàn)陰性，觸酶陽性。

二、不動(dòng)桿菌屬的鑒定（三）微生物學(xué)檢驗(yàn)

醋酸鈣不動(dòng)桿菌鮑曼不動(dòng)桿菌溶血不動(dòng)桿菌瓊氏不動(dòng)桿菌約翰遜不動(dòng)桿菌洛菲不動(dòng)桿菌葡萄糖氧化＋＋＋／－－－－木糖氧化－＋＋／－－－－乳糖氧化＋＋－＋＋＋精氨酸雙水解酶＋＋＋＋－／＋－鳥氨酸脫羧酶＋＋－－－－苯丙氨酸脫氨酶＋＋－－－－丙二酸鹽利用試驗(yàn)＋＋＋－－／＋－檸檬酸鹽利用試驗(yàn)＋＋＋＋／－＋－明膠液化－－＋－－－37℃生長＋＋＋＋－＋42℃生長－＋－－－－不動(dòng)桿菌屬主要菌種的鑒別要點(diǎn)二、不動(dòng)桿菌屬的鑒定（三）微生物學(xué)檢驗(yàn)三、產(chǎn)堿桿菌屬的鑒定項(xiàng)目二十三非發(fā)酵菌鑒定1.形態(tài)與染色革蘭陰性短桿菌，成對(duì)或鏈狀排列，有周鞭毛，無芽胞，多數(shù)無莢膜。三、產(chǎn)堿桿菌屬的鑒定（一）生物學(xué)特性2.培養(yǎng)特性專性需氧，最適生長溫度25～35℃，營養(yǎng)要求不高，在普通培養(yǎng)基上生長良好，麥康凱和SS平板亦可生長。三、產(chǎn)堿桿菌屬的鑒定（一）生物學(xué)特性1.致病物質(zhì)

本屬中臨床分離最常見的是糞產(chǎn)堿桿菌，大部分感染是條件致病，主要來自潮濕環(huán)境，如霧化器、呼吸機(jī)和灌洗液等，血、痰、尿、腦脊液等是常見的發(fā)現(xiàn)部位，是醫(yī)院感染的病原菌之一。其致病物質(zhì)主要是菌體成分如內(nèi)毒素等。2.所致疾病

可致抵抗力低下的患者發(fā)生菌血癥，也可引起呼吸道、泌尿道及中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染。3.藥物敏感性

藥物敏感試驗(yàn)的藥物選擇與假單胞菌相同。臨床治療可用哌拉西林及替卡西林。三、產(chǎn)堿桿菌屬的鑒定（二）臨床意義1.標(biāo)本采集

根據(jù)臨床疾病不同采集不同的標(biāo)本，如血液、尿液、痰液、膿汁、腦脊液等。2.檢驗(yàn)方法（1）顯微鏡檢查：

腦脊液、尿液離心取沉淀涂片，膿汁和痰液可直接涂片革蘭染色鏡檢，為革蘭陰性短桿菌，有周鞭毛.（2）分離培養(yǎng)：在血平板上可形成大小不等、灰白色、扁平、邊緣稍薄的濕潤菌落，糞產(chǎn)堿桿菌部分菌株有水果香味；在麥康凱和SS平板上形成無色透明菌落。（3）生化反應(yīng)：不分解任何糖類，O/F不分解糖類呈堿性，氧化酶陽性，觸酶陽性，分解胺類產(chǎn)堿。三、產(chǎn)堿桿菌屬的鑒定（三）微生物學(xué)檢驗(yàn)

糞產(chǎn)堿桿菌皮喬特產(chǎn)堿桿菌糞產(chǎn)堿桿菌Ⅱ型木糖氧化產(chǎn)堿桿菌42℃生長－－－＋亞硝酸鹽還原＋－－＋硝酸鹽還原－＋－＋丙二酸鹽＋＋－＋木糖－－－＋常見產(chǎn)堿桿菌的特性