白菜根腫病流行監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)范

1白菜根腫病流行監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)范本標(biāo)準(zhǔn)適用于引起白菜根腫病的蕓薹根腫菌的核酸、菌體及土壤帶菌檢測(cè)，用于根腫病的診斷監(jiān)測(cè)與流行預(yù)警。本標(biāo)準(zhǔn)適用于十字花科作物白菜根腫病的檢測(cè)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T3101有關(guān)量、單位和符號(hào)的一般原則GB/T1.1-2020第一部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則DB53/T442-2012油菜根腫病抗性鑒定技術(shù)規(guī)程DB34/T2785-2016油菜抗根腫病人工接種鑒定技術(shù)規(guī)程3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義均適用于本標(biāo)準(zhǔn)。3.1根腫病根腫病是由蕓薹根腫菌（PlasmodiophorabrassicaeWorn.）引起的一種世界性的土傳病害，主要癥狀表現(xiàn)為植株主根或側(cè)根上數(shù)目和大小不等的腫瘤，形如短棒狀或球形，地上部萎蔫、矮化，植株生長不良，影響十字花科作物產(chǎn)量和品質(zhì)。3.2蕓薹根腫菌屬于原生動(dòng)物界（Protozoa根腫菌綱（Plasmodiophoromycetes根腫菌目（Plasmodiophorales根腫菌科（Plasmodiophoraceae根腫菌屬（Plasmodiophora）的一種專性寄生菌。引起白菜根腫病的病原物。3.3流行植物病原物大量傳播，在一定環(huán)境下誘發(fā)植物群體發(fā)病并且造成嚴(yán)重?fù)p失的過程和現(xiàn)象。3.4檢測(cè)一種通過特定的方法和工具檢測(cè)病原物的核酸來確定侵染的方法。3.5聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）2一種用于擴(kuò)增特定DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)。3.6定量PCR反應(yīng)一種在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中，以熒光化學(xué)物質(zhì)檢測(cè)每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）循環(huán)的產(chǎn)物總量的方法。通過內(nèi)參法或者外參法對(duì)待測(cè)樣品中的特定DNA序列進(jìn)行定量分析的方法。qPCR是在PCR擴(kuò)增過程中，通過熒光信號(hào)對(duì)PCR進(jìn)程進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)。3.7病原菌從植物發(fā)病部位通過人工培養(yǎng)、純化，再接種和分離等方法獲得的病原菌的分離培養(yǎng)物。3.8孢子懸浮液病菌孢子均勻分散于水中不下沉，與水混合形成孢子懸浮液。3.9接種濃度用于人工接種的單位體積內(nèi)根腫菌休眠孢子的數(shù)量。3.10病情級(jí)別人為定量植物個(gè)體或群體發(fā)病程度的數(shù)值化描述。3.11發(fā)病率發(fā)病植株或植物器官占調(diào)查的植株總數(shù)或器官總數(shù)百分率，用以表示發(fā)病的普遍程度。3.12病情指數(shù)通過對(duì)植株個(gè)體發(fā)病程度（病情級(jí)別）數(shù)值的計(jì)算所獲得的群體發(fā)病程度的數(shù)值化描述形式。4樣品采集土壤和植物樣品。樣品具有真實(shí)性和代表性。樣品采集后置于-80oC環(huán)境內(nèi)冷凍保存。5主要儀器及用具生物顯微鏡、血球計(jì)數(shù)板、育苗盤、低溫保存箱、電子天平（感量0.01g）、高速冷凍離心機(jī)、破壁機(jī)、移液器、離心管、高溫滅菌鍋。6主要試劑蔗糖、70%乙醇、0.05%苯胺藍(lán)、ddH2O、2×ChamQSYBRqPCRMasterMix、10×PCRbuffer、10×6.1檢測(cè)方法取混勻的孢子懸浮液900微升與100微升的苯胺藍(lán)染色劑混勻，5分鐘后用顯微鏡觀察并判斷根腫菌的有無。根腫菌休眠孢子成球形，大小約3-5微米，可以被苯胺藍(lán)染色劑染成藍(lán)色。用血球計(jì)數(shù)器定量評(píng)3估根腫菌孢子懸浮液濃度。根據(jù)最終獲得的根腫菌孢子懸浮液液體積及濃度，計(jì)算根腫菌休眠孢子量（個(gè)孢子/克并在根腫病鑒定數(shù)據(jù)、圖片采集報(bào)告單中記錄。7孢子收集冷凍的根腫病根瘤在室溫下解凍，使用無菌水反復(fù)清洗表面，使用70%酒精進(jìn)行表面消毒3分鐘，然后在室溫下風(fēng)干10分鐘。稱取根腫病根50g，與300mL無菌水按照1：6混合，用榨汁機(jī)打碎，得到病根勻漿液。將勻漿液經(jīng)8層滅菌紗布過濾，分裝至50mL離心管，獲得孢子懸濁液。將孢子懸濁液，離心2000×g，10分鐘，4oC離心，棄去上清液。在沉淀中加入5mL的40%蔗糖溶液，懸浮震蕩，再次離心2000×g，10分鐘，4oC。兩個(gè)離心管中的上清液轉(zhuǎn)移到另一個(gè)新的50mL離心管，加30mL無菌水，離心4000×g，10分鐘，4oC，棄去上清液。沉淀中加入5mL無菌水，懸浮震蕩，離心4000×g，10分鐘，4oC，棄去上清液。將沉淀與1mL無菌水混勻，獲得孢子懸浮液。-20oC冰箱保存。8懸浮液濃度采用血球計(jì)數(shù)法。將提取的孢子懸浮液梯度稀釋，吸取10μL的孢子懸浮液樣品放置于血球計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)區(qū)域，輕覆蓋玻片于血球計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)室，顯微鏡下觀察根腫菌孢子，每個(gè)樣品重復(fù)3次，計(jì)算樣品孢子濃度。9土壤接種將細(xì)沙和土壤重復(fù)滅菌，將根腫菌孢子懸液（1×102、1×103、1×104、1×105、1×106、1×107）均勻混入細(xì)沙，再將含有根腫菌孢子的細(xì)沙與無菌土以1:3比例混合，制成濃度為1×102、1×103、1×104、1×105、1×106、1×107個(gè)孢子每克沙土混合物，無菌水作為對(duì)照。10病情調(diào)查10.1調(diào)查時(shí)間10.2調(diào)查方法調(diào)查3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)不小于20株。調(diào)查時(shí)將植株根部與土壤中分開，采用自來水沖洗干凈后，調(diào)查發(fā)病率并計(jì)算病情指數(shù)。結(jié)果計(jì)入附錄表A.1。10.3發(fā)病率和病情指數(shù)計(jì)算發(fā)病率和病情指數(shù)調(diào)查公式，以及不同病情級(jí)別癥狀描述。0級(jí)為根部無腫瘤；1級(jí)為僅側(cè)根有小腫瘤；1級(jí)為側(cè)根有大腫瘤，主根有小腫瘤；1級(jí)為主根有大腫瘤。發(fā)病率（%）=發(fā)病總株數(shù)/調(diào)查總株數(shù)×100%。病情指數(shù)=Σ（發(fā)病等級(jí)×各級(jí)植株數(shù)）/（調(diào)查總株數(shù)×最高級(jí)數(shù)值）。11定量檢測(cè)411.1核酸提取利用土壤基因組DNA和植物基因組DNA提取試劑盒，提取樣品總DNA，獲得DNA濃度應(yīng)在20ng/μL11.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)設(shè)定程序建立反應(yīng)體系，通過特異性引物，對(duì)根腫菌特異性片段擴(kuò)增，經(jīng)定量PCR儀檢測(cè)，評(píng)估擴(kuò)增效果。11.2.1反應(yīng)引物命名為PbITS591（PbITS591F：5'-CGACACTGTTAAATTGCGGGGAC-3'；PbITS591R：5'-ACGAGACCGACTATATCTTAAGCGAC-3'）。11.2.2反應(yīng)程序95℃3min；95℃20秒，40個(gè)循環(huán)，60℃30秒，72℃30秒。11.2.3反應(yīng)體系終體積為10μL，包括5μL2×ChamQSYBRqPCRMasterMix，PbITS591-F(2.5μM)1.5μL，PbITS591-R(2.5μM)1.5μL，DNA模板2μL。11.2.4定量分析11.2.4.1標(biāo)準(zhǔn)回歸線性方程建立根據(jù)孢子DNA模板濃度的對(duì)數(shù)作為橫坐標(biāo)和相應(yīng)的定量循環(huán)值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)方程，通過不同孢子濃度的Ct值進(jìn)行Boxplot分析，建立標(biāo)準(zhǔn)線性回歸方程y=–3.19079x+38.37479（R2=0.9958說明根腫菌不同孢子濃度的DNA定量PCR擴(kuò)增與Ct值呈線性正相關(guān)關(guān)系。11.2.4.2土壤中根腫菌的定量檢測(cè)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)線性方程結(jié)果，利用定量PCR反應(yīng)，檢測(cè)制備的含有不同根腫菌孢子濃度的土壤樣品Ct值，建立土壤中孢子密度與Ct值線性關(guān)系。結(jié)果表明，土壤中根腫菌孢子密度與Ct值也呈線性正相關(guān)關(guān)系，線性回歸方程y=–3.19629x+41.32057（R2=0.9961）。此外，標(biāo)準(zhǔn)線性回歸方程與土壤孢子線性回歸方程比較發(fā)現(xiàn)，斜率基本相同，截距有所差異，說明定量PCR擴(kuò)增效率不受土壤影響，土壤中根腫菌的定量PCR擴(kuò)增效率較高。此外，將根據(jù)線性回歸方程的檢測(cè)結(jié)果與對(duì)應(yīng)制備的土壤樣品的根腫菌孢子密度比較，發(fā)現(xiàn)定量檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性較高，變量偏差在5%以內(nèi)。12根腫病流行危害等級(jí)通過對(duì)土壤中根腫菌密度與根腫病的發(fā)病率和病情指數(shù)相關(guān)性PCA分析表明，將根腫病流行危害程度劃分為三個(gè)水平：孢子密度在1×104個(gè)孢子/g土或以下時(shí)，為輕度；孢子的密度在1×105個(gè)孢子/g土?xí)r，為中度；孢子密度達(dá)到1×106個(gè)孢子/g土或更高時(shí)，為重度。13數(shù)據(jù)收集與結(jié)果判定收集整理白菜根腫病流行檢測(cè)過程中的各類信息、圖片和資料，建立專門檔案，妥善保管。最終5結(jié)果記錄表見表A.1。通過土壤樣品的定量檢測(cè)，評(píng)估土壤中根腫菌孢子密度，實(shí)現(xiàn)對(duì)根腫病流行危害等級(jí)評(píng)價(jià)。同時(shí)，注意鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性、精確性和有效性，對(duì)檢測(cè)存在的問題、需要注意的事項(xiàng)和改進(jìn)的要求做出分析報(bào)告。6白菜根腫病流行檢測(cè)結(jié)果記錄表白菜根腫病流行檢測(cè)結(jié)果記錄表見