DB52T 1501.16-2020 農(nóng)作物抗病性鑒定技術(shù)規(guī)范 第16部分：白菜抗蕪菁花葉病毒病

農(nóng)作物抗病性鑒定技術(shù)規(guī)范第16部分：白菜抗蕪菁花葉病毒病I 1 1 1 2 3附錄A(資料性附錄)蕪菁花葉病毒病原、癥狀及發(fā)生流行規(guī)律 4附錄B(資料性附錄)蕪菁花葉病毒病原鑒定及保存方法 5 81農(nóng)作物抗病性鑒定技術(shù)規(guī)范第16部分：白菜抗蕪菁花葉病毒病24鑒定方法4.1接種體的準(zhǔn)備將準(zhǔn)確鑒定的蕪菁花葉病毒(TuMV)儲(chǔ)藏于-80℃冰箱備用(接種體的鑒定及保存方法見(jiàn)附錄B)。4.2材料培養(yǎng)白菜種子直播于營(yíng)養(yǎng)缽中，每缽直播1～2粒種，育苗土為專用育苗基質(zhì)，設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20株。人工氣候室溫度設(shè)置為白天25℃,夜間20℃;光照設(shè)置為每天12h。定期澆水和防治蚜蟲。4.3接種4.3.1接種時(shí)期4.3.2接種方法采用人工摩擦接種法，參考NY/T2060.4并做修菌過(guò)的研缽中，加入5倍體積的磷酸緩沖液(0.05mol/L,PH=7.2)研磨勻漿，兩層紗布過(guò)濾，立即用回摩擦2～4次，摩擦后用雙蒸水立即沖洗葉面；接種后，黑暗24h再恢復(fù)光照。4.4.1調(diào)查時(shí)間待鑒定材料長(zhǎng)至6葉期(一般接種后21d～30d)進(jìn)行抗病性調(diào)查。4.4.2調(diào)查和計(jì)算方法共調(diào)查2次，接種后21d調(diào)查1次病毒病發(fā)病情況，28d調(diào)查第2次。用公式1計(jì)算病情指數(shù)，根據(jù)2次的病情指數(shù)結(jié)果進(jìn)行校正，以消除待鑒定材料因生育期不同4.4.3病情分級(jí)3病情級(jí)別0植株正常生長(zhǎng)，無(wú)任何癥狀。1接種葉和心葉初現(xiàn)癥狀。3感病葉片數(shù)占全株葉片數(shù)1/3以下。5感病葉片數(shù)占全株葉片數(shù)的1/3～1/2。7感病葉片數(shù)占全株葉片數(shù)1/2以上。9多數(shù)葉片重花葉，皺縮，畸形或有壞死斑，植株嚴(yán)重矮化，甚至死亡。5抗病性評(píng)價(jià)情指數(shù)達(dá)50時(shí)，視為該批次鑒定有效?？共⌒栽u(píng)價(jià)分級(jí)見(jiàn)表2。蕪菁花葉病毒抗病性級(jí)別0免疫(I)1抗病(R)35中感(MS)7感病(S)9高感(HS)4A.1病原5i)加入500μL漂洗液(檢查加入無(wú)水乙醇),12,000rpm離心1min,棄掉廢液；j)重復(fù)步驟9一次；1)取出吸附柱，放入一個(gè)RNasefree離心管中，加50μL～80μ總體積6GoScripTM5×ReactionGoScripTMReverseTranscriptase總體積a)TuMV-F:5’-TAAACGGAATGTGGGTGATGATGG-3';b)TuMV-R:5'-GTCCTCGGTCGTATGCCTTTC時(shí)間94℃(預(yù)變性)94℃(變性)55℃(退火)72℃(延伸)72℃(徹底延伸)7B.1.4.1統(tǒng)計(jì)好需檢測(cè)樣品的個(gè)數(shù)，選擇合適的梳子和板子。B.1.4.2準(zhǔn)備1個(gè)量程為250mL的三角瓶，稱取0.25g瓊脂糖(Agarose)至三角瓶B.1.4.3混勻后將三角瓶置于微波爐B.1.4.4將三角瓶?jī)?nèi)的液體全部倒入已插好梳子的板子中。B.1.4.5等30min后瓊脂糖將會(huì)完全冷卻并凝固，再小心拔下梳子，準(zhǔn)備進(jìn)行核酸電泳。B.1.4.6清洗干凈核酸電泳槽之后，往電泳槽內(nèi)倒入適量的1×rans2KTMPlusIIDNAMark種緩沖液，摩擦接種到枯斑三生煙(或心葉煙),7d～10d待煙葉上長(zhǎng)出枯斑，挑取單個(gè)枯斑再次接種到煙葉，重復(fù)2次。純化后TuMV接種到易感病白菜活體保存或?qū)⒓兓笫忀蓟ㄈ~病毒的樣品儲(chǔ)藏于將純化的TuMV毒源接種到感病品種的白菜(如和美五號(hào)，經(jīng)室內(nèi)和田間鑒定為感病),顯癥后用