克羅諾氏菌檢測(cè)甘辛

食品中克羅諾桿菌屬（

Cronobacter,原阪崎腸桿菌）檢測(cè)命名演變阪崎克羅諾桿菌（C.sakazakii）丙二酸鹽克羅諾桿菌（C.malonaticus）蘇黎世克羅諾桿菌（C.turicensis）莫金斯克羅諾桿菌（C.muytjensii）克羅諾桿菌基因種1（C.genomospecies

1）都柏林克羅諾桿菌（C.dublinensis）都柏林亞種（C.dublinensissubsp.dublinensis）洛桑亞種（

C.dublinensissubsp.lausannensis）奶粉亞種（

C.dublinensis

subsp.lactaridi）阪崎克羅諾桿菌（C.sakazakii）丙二酸鹽克羅諾桿菌（C.malonaticus）蘇黎世克羅諾桿菌（C.turicensis）莫金斯克羅諾桿菌（C.muytjensii）尤尼沃斯克羅諾桿菌（C.universalis）都柏林克羅諾桿菌（C.dublinensis）都柏林亞種（C.dublinensissubsp.dublinensis）洛桑亞種（C.dublinensissubsp.lausannensis）奶粉亞種（C.dublinensissubsp.lactaridi）康帝蒙提克羅諾桿菌(C.condimenti)分類變化2008年2011年兼性厭氧的革蘭氏陰性桿菌周生鞭毛、能運(yùn)動(dòng)無芽孢隸屬于腸桿菌科克羅諾桿菌屬簡(jiǎn)介克羅諾桿菌屬及親緣關(guān)系較近的腸桿菌生化反應(yīng)比較生化反應(yīng)試驗(yàn)克羅諾桿菌屬陰溝腸桿菌產(chǎn)氣腸桿菌成團(tuán)腸桿菌日勾維腸桿菌賴氨酸脫羧酶——＋—＋精氨酸雙水解酶＋＋———鳥氨酸脫羧酶＋＋＋—＋KCN生長(zhǎng)＋＋＋v＋發(fā)酵:蔗糖＋＋＋(＋)＋衛(wèi)矛醇—(－)—(－)—核糖醇—(－)＋——棉子糖＋＋＋v＋D-山梨醇—＋＋v—χ-甲基-葡萄糖甙＋(＋)———D-阿拉伯糖醇—(－)＋—＋注黃:色＋素:90-100％；(＋):7＋5-89%；V:－25-74％；－(－):10-(2＋4％)；－:0-－-－9％分布及致病性乳品安全標(biāo)準(zhǔn)（報(bào)批稿）嬰兒配方食品特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品0-6個(gè)月齡我國(guó)對(duì)嬰幼兒食品中該菌的規(guī)定1988年,Muytjens檢測(cè)了35個(gè)國(guó)家的141種嬰兒配方粉,其中13個(gè)國(guó)家的20種抽檢樣品中分離到克羅諾桿菌,占全部樣品的14.2%。2001年4月美國(guó)田納西州發(fā)生克羅諾氏菌感染來自于嬰幼兒配方粉。2004年Iversen等調(diào)查了82個(gè)嬰幼兒配方乳粉和404個(gè)其他的食品中存在克羅諾氏菌、沙門氏菌和其他腸桿菌的情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在嬰幼兒配方乳粉、干嬰兒食品、奶粉、干酪和其他產(chǎn)品中,克羅諾桿菌檢出率分別為2.4%、10.2%、4.1%、和3.2%2002年香港食物環(huán)境衛(wèi)生署從德國(guó)美樂寶HN25奶油粉檢出克羅諾桿菌2002年美國(guó)FDA從費(fèi)蒙特工廠生產(chǎn)的嬰幼兒配方粉中檢出克羅諾桿菌克羅諾桿菌在乳粉中的分布2004年,安徽阜陽發(fā)生劣質(zhì)奶粉引發(fā)“大頭娃娃”事件,從87份阜陽劣質(zhì)奶粉樣品中檢測(cè)到11例克羅諾桿菌陽性產(chǎn)品,污染率為12.6%。2010-2011年各地疾控中心的食源性致病菌監(jiān)測(cè)報(bào)告中克羅諾桿菌屬的檢出情況為,廣西梧州市監(jiān)測(cè)的175份食品中檢出率為5.26%,江蘇宿遷市的891份樣品中檢出率為2.6%,甘肅定西市對(duì)321份市售食品監(jiān)測(cè)中檢出率為0.31%,湖南長(zhǎng)沙市監(jiān)測(cè)的286份食品中檢出率為6.3%。2013年董曉暉等對(duì)300份奶粉和50份非奶粉食品中克羅諾桿菌屬進(jìn)行定量檢測(cè),檢出率達(dá)到6.6%,23個(gè)污染樣品中有4個(gè)樣品的菌量大于100MPN/100g。我國(guó)克羅諾桿菌污染情況新生兒（低出生體重等免疫力低下）早產(chǎn)兒老年人免疫功能低下的成年人克羅諾桿菌屬的易感人群1961年Franklin首次報(bào)道了2例新生兒感染克羅諾桿菌導(dǎo)致腦膜炎并死亡1965年丹麥報(bào)道了1例新生兒感染克羅諾桿菌引發(fā)腦膜炎1979年Monroe報(bào)道了1例新生兒感染克羅諾桿菌引發(fā)菌血癥1981年美國(guó)印第安納州1名嬰兒感染克羅諾桿菌引發(fā)腦膜炎1983年Muytjens報(bào)道了8例嬰兒感染克羅諾桿菌引發(fā)腦膜炎,6例死亡1984年Arseni報(bào)道了12例 產(chǎn)兒感染克羅諾桿菌引發(fā)菌血癥,4例死亡1985年Naqvi報(bào)道了1例嬰兒感染克羅諾桿菌1990年Clark報(bào)道了2起不相關(guān)的院內(nèi)暴發(fā)的新生兒克羅諾氏菌感染事件1994年法國(guó)爆發(fā)克羅諾桿菌感染,17例新生兒中8例無臨床癥狀、7例壞死性結(jié)腸炎、1例腦膜炎、1例敗血癥,共3例死亡2001年4月美國(guó)田納西州發(fā)生克羅諾氏菌感染事件2001年比利時(shí)一家醫(yī)院報(bào)道1例新生兒感染克羅諾桿菌引發(fā)壞死性小腸結(jié)腸炎2002年耶路撒冷一家醫(yī)院發(fā)生了1例克羅諾桿菌感染事件2004年法國(guó)發(fā)生嬰幼兒感染克羅諾桿菌,9例病例中2例死亡2006年美國(guó)新生兒感染克羅諾桿菌的比率為8.7/1000002010年日本報(bào)道了1例克羅諾桿菌導(dǎo)致的新生兒死亡WHO統(tǒng)計(jì)1961-2008年共有120例0-3歲感染克羅諾桿菌的病例,目前國(guó)內(nèi)克羅諾桿菌臨床感染病例罕見報(bào)道,與我們監(jiān)測(cè)覆蓋不夠全面有很大關(guān)系。新生兒感染克羅諾桿菌病例1982年Gimenez報(bào)道1名76歲老人感染克羅諾桿菌引起尿膿血癥1985年P(guān)ribyl從1名糖尿病患者足部潰瘍部分分離出克羅諾桿菌1991年Hawkins報(bào)道了1例克羅諾桿菌引起的成人菌血癥2001年Lai報(bào)道了馬薩諸塞州立大學(xué)醫(yī)學(xué)中心1995年~1996年4例成人感染克羅諾桿菌,其中3名死亡2002年Dennison從1名64歲的外周血管病患者的傷口分離了克羅諾桿菌2002年Ongradi報(bào)道了1名26歲女性感染克羅諾桿菌成年人感染克羅諾桿菌病例新生兒:腦膜炎、壞死性小腸結(jié)腸炎和菌血癥死亡率高達(dá)40%—80%長(zhǎng)期的并發(fā)癥包括遲發(fā)型神經(jīng)發(fā)育、腦積水和永久性的神經(jīng)損傷等成年人:腦卒中、骨髓炎、腹瀉、急性膽囊炎、傷口感染以及膿樣伴隨有導(dǎo)尿管留置和尿路感染患者出現(xiàn)膿毒癥、結(jié)膜炎和吸入性肺炎臨床表現(xiàn)2002年國(guó)際食品微生物標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)（(InternationalCommissionofMicrobiologicalSpecializationsonFood,ICMSF）將阪崎腸桿菌列為“嚴(yán)重危害特定人群生命、引起長(zhǎng)期慢性實(shí)質(zhì)性后遺癥的一種致病菌”。2004年世界糧農(nóng)組織和WHO經(jīng)過風(fēng)險(xiǎn)性評(píng)估將阪崎腸桿菌和沙門氏菌共同列為嬰幼兒配方粉A類致病菌。1、GB4789.40-2010食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)阪崎腸桿菌檢驗(yàn)2、SN/T1632-2013中華人民共和國(guó)進(jìn)出口商品檢驗(yàn)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)出口奶粉中阪崎腸桿菌（克羅諾桿菌屬）檢驗(yàn)方法—SN/T1632.1-2013分離與計(jì)數(shù)—SN/T1632.1-2013PCR方法—SN/T1632.1-2013熒光PCR方法3、ISO/TS22964Milkandmilkproducts—DetectionofEnterobactersakazakii20064.USFDABacteriologicalAnalyticalManual,Chapter29:Cronobacter國(guó)內(nèi)外檢測(cè)方法USFDA

Bacteriological

Analytical

Manual,

Chapter

29:CronobacterISO/TS

22964

Milk

and

milk

products—Detection

of

Enterobacter

sakazakii

2006SN/T

1632.1-2013分離與計(jì)數(shù)GB4789.40-2010第一法:阪崎腸桿菌的檢驗(yàn)第二法:阪崎腸桿菌的計(jì)數(shù)第一法阪崎腸桿菌的檢驗(yàn)檢驗(yàn)程序報(bào)告生化鑒定1mL+mLST-Vm10mL44℃±0.5℃,24h±2h檢樣100g/mL+稀釋液900mL36℃±1℃,18h±2h前增菌選擇性增菌生化鑒定DFI瓊脂36℃±1℃,24h±2h挑取藍(lán)綠色菌落選擇性分離TSA25℃±1℃,48h±4h挑取黃色菌落將袋裝奶粉用75%酒精棉球涂抹消毒袋口,無菌操作開封取樣,如使用剪刀和勺子需要提前高壓滅菌。稱取100g,加入提前預(yù)熱至45℃的BPW900mL,振蕩或拍打使奶粉充分溶解和混勻。一、樣品取樣左圖:未混合右圖:混合后1、將混勻后的樣品36℃±1℃培養(yǎng)18h±2h。2.將培養(yǎng)后的樣品充分混勻，取1mL至10mLmLST-Vm肉湯中，混勻，44℃±0.5℃培養(yǎng)24h±2h。二、前增菌和選擇性增菌100g900mL1mL10mL1、混勻mLST-Vm肉湯培養(yǎng)物，各取增菌液1環(huán)，分別劃線接種于兩個(gè)DFI平板，36℃±1℃培養(yǎng)24h±2h。2.從DFI培養(yǎng)基上挑取1個(gè)~5個(gè)藍(lán)綠色可疑菌落，劃線接種于TSA平板。25℃±1℃培養(yǎng)48h±4h。三、分離和鑒定mLst-Vm利用克羅諾桿菌屬耐滲透壓的能力通過0.5M的氯化鈉在保證克羅諾桿菌屬良好生長(zhǎng)的同時(shí),抑制其他腸桿菌科細(xì)菌?？肆_諾桿菌屬對(duì)萬古霉素天然耐藥,因此可以有效抑制G+菌的生長(zhǎng)。DFI平板利用克羅諾桿菌屬α-葡萄糖苷酶水解5-溴-4-氯-吲哚-α-D吡喃葡萄苷（Xa-GLC）,釋放的糖苷配基5-溴-4-氯-吲哚在氧存在時(shí)形成色素溴-氯-吲哚,從而使菌落呈現(xiàn)出特異性的藍(lán)綠色。TSA:25℃培養(yǎng)后典型菌落:黃色陰性對(duì)照E.coliATCC25922:白色菌落從TSA平板上挑取菌落接種生化鑒定培養(yǎng)基（國(guó)標(biāo)采用生化培養(yǎng)基）,保證無雜菌生長(zhǎng)后可以將菌落制備為0.5-0.62個(gè)麥?zhǔn)蠞舛鹊木鷳乙汉蟮渭?也可以直接穿刺接種,設(shè)置陽性對(duì)照。生化鑒定API20E和VITEK2GN鑒定卡:目前這兩種生化條已在國(guó)內(nèi)外得到廣泛應(yīng)用,在BAM中也收錄作為克羅諾桿菌屬鑒定的方法。API

20E反應(yīng)編碼API

20E結(jié)果評(píng)價(jià)3345

373Excellent

identification3305

173Excellent

identification3305

363Very

good

identification3305373 Goodidentification當(dāng)評(píng)價(jià)結(jié)果低于goodidentification時(shí),需要重復(fù)試驗(yàn)。對(duì)于結(jié)果的判定采用標(biāo)準(zhǔn)為非陰即陽,與陰性不同的都屬于陽性。第二法阪崎腸桿菌的計(jì)數(shù)100g10g1g900mL90mL9mL1mL1mL1mL10mL10mL10mLX

3第一法:綜合菌落形態(tài)和生化特征，報(bào)告每100g（mL）樣品中檢出或未檢出克羅諾桿菌屬。第二發(fā):綜合菌落形態(tài)和生化特征，根據(jù)證實(shí)為克羅諾桿菌屬的陽性管數(shù)，查MPN檢索表，報(bào)告每100g（mL）樣品中克羅諾桿菌屬的MPN值（見附錄B中的表B.1）。結(jié)果報(bào)告PCR法和熒光PCR法：1.從液體增菌肉湯中提取DNA：目前美國(guó)USFDABAM2012年版方法和SN/T1632.2-2013以及SN/T1632.3-2013都是將增菌肉湯離心后直接提取DNA。該方法的優(yōu)點(diǎn)是可以快速提示克羅諾桿菌屬陽性的樣品，但缺點(diǎn)因?yàn)镻CR法無法區(qū)別死菌和活菌，因此可能出現(xiàn)PCR結(jié)果陽性但無法分離出菌落的情況。四、快檢方法2.從菌落中提取DNA：從DFI平板接種TSA時(shí)同時(shí)接種BHA（腦心浸液瓊脂）平板，36℃±1℃培養(yǎng)24h±2h，挑取菌落提取DNA。該方法的優(yōu)點(diǎn)是在獲得菌落的同時(shí)快于生化鑒定法，另外有文獻(xiàn)報(bào)道個(gè)別克羅諾桿菌屬細(xì)菌在TSA上不產(chǎn)黃色素，因此容易漏報(bào)。缺點(diǎn)是增菌和分離所需時(shí)間無法縮短，同時(shí)PCR法均要避免污染造成的假陽性。抵抗力耐熱性耐酸性（pH0.9~2下存活與周身菌毛結(jié)構(gòu)有關(guān)）滲透壓、干燥（含有大量的海藻糖酶）形成生物膜克羅諾桿菌屬可以在干燥奶粉中長(zhǎng)期存活；一旦形成生物膜將很難徹底清除,同時(shí)更容易污染生產(chǎn)設(shè)備和環(huán)境?？肆_諾桿菌的防控增值能力6℃,21℃,37℃分別是13.7h,1.7h,19－21min?？肆_諾桿菌屬25℃放置6h該菌的相對(duì)危險(xiǎn)性可增加30倍；25℃放置10h可增加30000倍。2004年2月FAO/WHO在日內(nèi)瓦召開的嬰幼兒配方粉中克羅諾桿菌屬專家研討會(huì)上提出嬰幼兒配方粉中微量的該菌（＜3CFU/100g）污染也能導(dǎo)致感染的發(fā)生?？刂拼胧┛刂圃系馁|(zhì)量加工過程中滅菌防止滅菌后產(chǎn)品的二次污染生產(chǎn)設(shè)備的控制防止消費(fèi)環(huán)節(jié)被污染克羅諾桿菌的控制措施控制原料來源,避免受污染的原料流入生產(chǎn)環(huán)節(jié)。巴氏消毒法可以有效殺滅克羅諾桿菌屬,同時(shí)也需要根據(jù)乳粉組分含量調(diào)整溫度和時(shí)間。在嬰幼兒配方粉消毒后避免其他添加劑、機(jī)械、器具、包裝及人工等帶入的污染。生產(chǎn)設(shè)備使用堿洗時(shí)要注意濃度和時(shí)間,酒精涂抹時(shí)不能有遺漏點(diǎn)。選擇檢查合格的奶粉注意奶粉沖調(diào)環(huán)境衛(wèi)生狀況定期消毒沖調(diào)器具使用不低于70℃的熱水沖調(diào),并在2小時(shí)內(nèi)喂食預(yù)先沖調(diào)應(yīng)沖調(diào)后快速冷卻,存放在不超過5℃的冰箱里,24小時(shí)內(nèi)引用,喂食前需重新加熱消費(fèi)者如何避免克羅諾桿菌污染謝謝！命名演變?nèi)槠钒踩珮?biāo)準(zhǔn)（報(bào)批稿）嬰兒配方食品特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品0-6個(gè)月齡我國(guó)對(duì)嬰幼兒食品中該菌的規(guī)定1988年,Muytjens檢測(cè)了35個(gè)國(guó)家的141種嬰兒配方粉,其中13個(gè)國(guó)家的20種抽檢樣品中分離到克羅諾桿菌,占全部樣品的14.2%。2001年4月美國(guó)田納西州發(fā)生克羅諾氏菌感染來自于嬰幼兒配方粉。2004年Iversen等調(diào)查了82個(gè)嬰幼兒配方乳粉和404個(gè)其他的食品中存在克羅諾氏菌、沙門氏菌和其他腸桿菌的情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在嬰幼兒配方乳粉、干嬰兒食品、奶粉、干酪和其他產(chǎn)品中,克羅諾桿菌檢出率分別為2.4%、10.2%、4.1%、和3.2%2002年香港食物環(huán)境衛(wèi)生署從德國(guó)美樂寶HN25奶油粉檢出克羅諾桿菌2002年美國(guó)FDA從費(fèi)蒙特工廠生產(chǎn)的嬰幼兒配方粉中檢出克羅諾桿菌克羅諾桿菌在乳粉中的分布2004年,安徽阜陽發(fā)生劣質(zhì)奶粉引發(fā)“大頭娃娃”事件,從87份阜陽劣質(zhì)奶粉樣品中檢測(cè)到11例克羅諾桿菌陽性產(chǎn)品,污染率為12.6%。2010-2011年各地疾控中心的食源性致病菌監(jiān)測(cè)報(bào)告中克羅諾桿菌屬的檢出情況為,廣西梧州市監(jiān)測(cè)的175份食品中檢出率為5