《酶的蛋白質(zhì)工程》課件

精品醫(yī)學(xué)1第九章

酶的蛋白質(zhì)工程

精品醫(yī)學(xué)2蛋白質(zhì)工程蛋白質(zhì)工程:是以蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)及其與生物學(xué)功能的關(guān)系為基礎(chǔ)，通過(guò)分子設(shè)計(jì)和由設(shè)計(jì)結(jié)果所指導(dǎo)的特定的基因修飾，而實(shí)現(xiàn)的對(duì)天然蛋白質(zhì)的定向改造。目的:是為構(gòu)造并生產(chǎn)性能比現(xiàn)有蛋白質(zhì)更加符合人類(lèi)需要的蛋白質(zhì)新品種提供科學(xué)依據(jù)和技術(shù)途徑，同時(shí)，為分子生物學(xué)的基礎(chǔ)理論研究提供強(qiáng)有力的新手段。精品醫(yī)學(xué)3蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)1952年丹麥生物化學(xué)家Linderstrom-Lang首次提出蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的概念:一級(jí)結(jié)構(gòu):指多肽鏈中氨基酸的一定的順序，靠共價(jià)鍵維持多肽鏈的連接，而不涉及其空間排列。二級(jí)結(jié)構(gòu):指多肽鏈骨架的局部空間結(jié)構(gòu)，不考慮側(cè)鏈的構(gòu)象及整個(gè)肽鏈的空間排列。三級(jí)結(jié)構(gòu):指整個(gè)肽鏈的折疊情況，包括側(cè)鏈的排列，也就是蛋白質(zhì)分子的空間結(jié)構(gòu)或三維結(jié)構(gòu)。1958年英國(guó)晶體學(xué)家Bernal提出四級(jí)結(jié)構(gòu)概念:四級(jí)結(jié)構(gòu):指蛋白質(zhì)亞基的排列。精品醫(yī)學(xué)4蛋白質(zhì)的超二級(jí)結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域超二級(jí)結(jié)構(gòu):1973年Rossman提出，指二級(jí)結(jié)構(gòu)的組合物。結(jié)構(gòu)域:由Porter提出，是指蛋白質(zhì)分子中那些明顯分開(kāi)的球狀部分。精品醫(yī)學(xué)5蛋白質(zhì)工程就是對(duì)自然界存在的蛋白質(zhì)加以改造,改造的目的是得到性能更符合人類(lèi)要求的非天然蛋白質(zhì),以用于工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥衛(wèi)生等各領(lǐng)域。精品醫(yī)學(xué)6蛋白質(zhì)改造的方法:通過(guò)改造它們的基因，再用基因工程的方法由工程菌種來(lái)生產(chǎn)新的蛋白質(zhì)。與藥物設(shè)計(jì)的關(guān)系:近年來(lái)隨著藥物設(shè)計(jì)發(fā)展的需要，基于生物大分子結(jié)構(gòu)知識(shí)的藥物設(shè)計(jì)已成為藥物發(fā)展中的重要領(lǐng)域，由于這種設(shè)計(jì)途徑在很大程度上與蛋白質(zhì)工程有著深刻和廣泛的聯(lián)系，因此往往在學(xué)術(shù)上與蛋白質(zhì)工程一起討論。精品醫(yī)學(xué)7三類(lèi)專(zhuān)家:①蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)測(cè)定的專(zhuān)家；②蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)的專(zhuān)家；③基因工程的專(zhuān)家。精品醫(yī)學(xué)8空間結(jié)構(gòu)測(cè)定的專(zhuān)家:主要應(yīng)用X射線晶體結(jié)構(gòu)分析的方法與技術(shù)對(duì)蛋白質(zhì)分子的空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)測(cè)定。精品醫(yī)學(xué)9分子設(shè)計(jì)專(zhuān)家:在了解了需要改造的蛋白質(zhì)的性能及其相應(yīng)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)之后，主要通過(guò)理論的方法，提出蛋白質(zhì)改性的設(shè)計(jì)方案，這一方案將提供改性后的蛋白質(zhì)哪些部分的氨基酸順序與天然蛋白質(zhì)不同，這些新的序列可以導(dǎo)致怎樣的空間結(jié)構(gòu)和電子結(jié)構(gòu)的變化，從而能賦予新蛋白質(zhì)什么樣的特性。精品醫(yī)學(xué)10當(dāng)前的分子設(shè)計(jì)主要以能顯示圖形圖象的計(jì)算機(jī)為工具,采用基于物理學(xué)原理的各種模擬方法和基于蛋白質(zhì)的改性分子結(jié)構(gòu)知識(shí)的模型構(gòu)建方法,或兼用這兩類(lèi)方法。精品醫(yī)學(xué)11基因工程專(zhuān)家:在得到了新的蛋白質(zhì)的改性設(shè)計(jì)方案之后，就用一套分子生物學(xué)的技術(shù)，先合成相應(yīng)的基因模板，再經(jīng)過(guò)克隆與表達(dá)，得到新蛋白質(zhì)的產(chǎn)物，最后通過(guò)分離、純化，提取出足夠純的新蛋白質(zhì)以研究它的性質(zhì)。精品醫(yī)學(xué)12蛋白質(zhì)工程的這一程序不是一次就能實(shí)現(xiàn)的,往往要經(jīng)過(guò)多次的循環(huán),不斷改進(jìn)設(shè)計(jì)方案才能發(fā)現(xiàn)一個(gè)理想的新改性蛋白。精品醫(yī)學(xué)13當(dāng)前蛋白質(zhì)工程研究的熱點(diǎn):一方面是對(duì)具有明顯生物學(xué)功能的天然蛋白質(zhì)分子；另一方面是基于生物大分子結(jié)構(gòu)知識(shí)的藥物設(shè)計(jì)。精品醫(yī)學(xué)14蛋白質(zhì)人為進(jìn)化

定向進(jìn)化隨機(jī)突變精品醫(yī)學(xué)15生物體系之所以能夠相對(duì)獨(dú)立地存在于自然界中,并維持其獨(dú)立性和生命的延續(xù)性,都是因?yàn)樯矬w內(nèi)的一系列酶在發(fā)揮著作用。酶保證了生物體內(nèi)組成生命活動(dòng)的大量生化反應(yīng)得以按照預(yù)定的方向有序、精確而順利地進(jìn)行,幾乎所有生物的生理現(xiàn)象都與酶的作用緊密相關(guān),可以這樣說(shuō),沒(méi)有酶的存在,就沒(méi)有生物體的一切生命活動(dòng)。天然酶的作用精品醫(yī)學(xué)16

利用酶作為催化劑進(jìn)行生物催化與生物轉(zhuǎn)化,已成為生產(chǎn)精細(xì)化學(xué)品、手性藥物、食品添加劑等的重要工具,獲得了廣泛應(yīng)用。精品醫(yī)學(xué)17隨著酶催化應(yīng)用范圍的不斷擴(kuò)大和研究的逐步深入,研究者發(fā)現(xiàn),酶催化的精確性和有效性常常不能很好地滿足酶學(xué)研究和工業(yè)化應(yīng)用的要求,而且天然酶的穩(wěn)定性差、活性低使催化效率很低,還缺乏有商業(yè)價(jià)值的催化功能天然酶的局限

天然酶的局限性源于酶的自然進(jìn)化過(guò)程。精品醫(yī)學(xué)18現(xiàn)代生物工程對(duì)酶的要求提高Vmax,減少Km,改變最適pH能具備長(zhǎng)期穩(wěn)定性和活性能適用于水及非水相環(huán)境能接受不同的底物甚至是自然界不存在的合成底物能夠在特殊環(huán)境中合成和拆分制作新藥物或藥物的原材料精品醫(yī)學(xué)19

如何利用相對(duì)簡(jiǎn)單的方法以達(dá)到對(duì)天然酶的改造或構(gòu)建新的非天然酶就顯得非常有研究意義和應(yīng)用前景。精品醫(yī)學(xué)201993年,美國(guó)科學(xué)家ArnoldFH（加州理工大學(xué),生物化學(xué)家）首先提出酶分子的定向進(jìn)化的概念,并用于天然酶的改造或構(gòu)建新的非天然酶。蛋白質(zhì)定向進(jìn)化概念的提出精品醫(yī)學(xué)21人為地創(chuàng)造特殊的進(jìn)化條件,模擬自然進(jìn)化機(jī)制,在體外對(duì)基因進(jìn)行隨機(jī)突變,從一個(gè)或多個(gè)已經(jīng)存在的親本酶（天然的或者人為獲得的）出發(fā),經(jīng)過(guò)基因的突變和重組,構(gòu)建一個(gè)人工突變酶庫(kù),通過(guò)一定的篩選或選擇方法最終獲得預(yù)先期望的具有某些特性的進(jìn)化酶。定向進(jìn)化技術(shù)精品醫(yī)學(xué)22定向進(jìn)化的原理精品醫(yī)學(xué)23定向進(jìn)化＝隨機(jī)突變＋選擇精品醫(yī)學(xué)24隨機(jī)突變的策略易錯(cuò)PCR技術(shù)(error-pronePCR)DNA改組(DNAshuflling):由美國(guó)Stemmer于1994年首次提出一項(xiàng)體外重組技術(shù)隨機(jī)引發(fā)重組(RPR)1998年,Arnold提出了一種有效的新方法交錯(cuò)延伸技術(shù)(StEP):由Zhao等提出,是一種簡(jiǎn)化的DNAshuffling技術(shù)精品醫(yī)學(xué)25易錯(cuò)PCR易錯(cuò)PCR（errorpronePCR）是指在擴(kuò)增目的基因的同時(shí)引入堿基錯(cuò)配,導(dǎo)致目的基因隨機(jī)突變。連續(xù)易錯(cuò)PCR(sequentialerrorpronePCR)策略。即將一次PCR擴(kuò)增得到的有用突變基因作為下一次PCR擴(kuò)增的模板,連續(xù)反復(fù)地進(jìn)行隨機(jī)誘變。精品醫(yī)學(xué)26易錯(cuò)PCR:是一種簡(jiǎn)單、快速、廉價(jià)的隨機(jī)突變方法。原理:通過(guò)改變PCR的條件，通常降低一種dNTP的量（降至5%-10%）使PCR易于出錯(cuò)，達(dá)到隨機(jī)突變的目的。還可以加入dITP來(lái)代替被減少的dNTP，又會(huì)使下一輪循環(huán)中出現(xiàn)更多的錯(cuò)誤。在PCR緩沖液中另加入Mn2+，亦有利于提高突變率。精品醫(yī)學(xué)27DNA改組DNA改組(DNAshuffling)又稱(chēng)有性PCR(sexualPCR),即將DNA拆散后重排。它是模仿自然進(jìn)化的一種DNA體外隨機(jī)突變方法。這種方法不僅可以對(duì)一種基因人為進(jìn)化,而且可以將具有結(jié)構(gòu)同源性的幾種基因進(jìn)行重組,共同進(jìn)化出一種新的蛋白質(zhì)。精品醫(yī)學(xué)281.目的基因片段的準(zhǔn)備:根據(jù)不同的需要選擇一個(gè)基因或其片段，也可以是幾個(gè)序列上具有較高同源性的基因；2.DNaseI酶切:將基因隨機(jī)切割成約10-50bp或300bp左右的小片段；3.不加引物的PCR:在Taq酶的作用下將切割后的DNA重疊小片段重新連接起來(lái)，在這個(gè)過(guò)程中可能發(fā)生許多突變和重組；4.加引物的PCR:加入目的基因片段兩端的引物，使連接好的DNA得到擴(kuò)增，篩選正突變,得到的正突變子又可以重復(fù)進(jìn)行DNAshuffling。DNAshuffling基本過(guò)程包括四個(gè)步驟:精品醫(yī)學(xué)29體外隨機(jī)引發(fā)重組體外隨機(jī)引發(fā)重組(randompriminginvitrorecombination,RPR)以單鏈DNA為模板,配合一套隨機(jī)序列引物,先產(chǎn)生大量互補(bǔ)于模板不同位點(diǎn)的短DNA片段,由于堿基的錯(cuò)配和錯(cuò)誤引發(fā),這些短DNA片段中也會(huì)有少量的點(diǎn)突變,在隨后的PCR反應(yīng)中,它們互為引物進(jìn)行合成,伴隨組合,再組裝成完整的基因長(zhǎng)度。精品醫(yī)學(xué)30交錯(cuò)延伸交錯(cuò)延伸(staggerextensionprocess,StEP)PCR是在PCR反應(yīng)中把常規(guī)的退火和延伸合并為一步,縮短其反應(yīng)時(shí)間,從而只能合成出非常短的新生鏈,經(jīng)變性的新生鏈再作為引物與體系內(nèi)同時(shí)存在的不同模板退火而繼續(xù)延伸。此過(guò)程反復(fù)進(jìn)行,直到產(chǎn)生完整的基因長(zhǎng)度。精品醫(yī)學(xué)31定向進(jìn)化的篩選策略瓊脂板涂布法在特殊條件下培養(yǎng)突變菌,通過(guò)宿主菌的生長(zhǎng)情況、培養(yǎng)基顏色、特定反應(yīng)的出現(xiàn)等判斷是否具有目的基因。微孔板懸浮法在含生色底物平板上培養(yǎng),挑取具有活性的克隆接種到96孔板上檢測(cè)吸光度。使用微流控芯片。微球細(xì)胞固定法與數(shù)字成像系統(tǒng)結(jié)合,將單個(gè)細(xì)胞附著在單個(gè)固體珠上,突變體進(jìn)行分離和篩選。流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法細(xì)胞經(jīng)熒光染色后,通過(guò)高速流動(dòng)系統(tǒng),排成單行,逐個(gè)通過(guò)流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行測(cè)定。突變體分離精品醫(yī)學(xué)32通過(guò)酶促反應(yīng)的特征加入底物顯色熒光共振能量轉(zhuǎn)移同位素標(biāo)記底物通過(guò)檢測(cè)底物消耗或產(chǎn)物生成進(jìn)行終點(diǎn)檢測(cè)酶檢測(cè)信號(hào)探測(cè)分光光度計(jì)和熒光酶標(biāo)儀氣相色譜和高效液相色譜質(zhì)譜和核磁精品醫(yī)學(xué)33定向進(jìn)化與自然進(jìn)化的異同點(diǎn)定向進(jìn)化的實(shí)質(zhì)是達(dá)爾文進(jìn)化論在分子水平上的延伸和應(yīng)用。定向進(jìn)化是在體外模擬突變、重組和選擇的自然進(jìn)化，使進(jìn)化朝著人們需要的方向發(fā)展。兩者的不同:進(jìn)化動(dòng)力不同:保守突變非保守取代；進(jìn)化方向不同:適應(yīng)突變的積累；進(jìn)化速度不同:非常漫長(zhǎng)只需幾年、甚至幾天；進(jìn)化目標(biāo)不同:適應(yīng)環(huán)境超越生物學(xué)意義的要求，探索所希望的蛋白質(zhì)在順序空間的可及性。精品醫(yī)學(xué)34定向進(jìn)化技術(shù)目標(biāo)酶所需功能方法結(jié)果實(shí)施菌種卡那霉素核苷基轉(zhuǎn)移酶熱穩(wěn)定性定位誘變+選擇在60-50℃酶半衰期增加200倍耐熱脂肪芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶作用于有機(jī)溶劑易錯(cuò)PCR+選擇在60％二甲基亞砜主仆女冠活力增強(qiáng)170倍枯草桿菌β-內(nèi)酰胺酶作用于新底物DNA改組+選擇對(duì)cefotaxime的抗性增加32000倍大腸桿菌對(duì)硝基苯酯酶有機(jī)溶劑中的底物特異性和活性易錯(cuò)PCR+重組活力增加60-150倍大腸桿菌胸苷激酶第五特異性基因理療交錯(cuò)延伸+選擇活力增加43倍大腸桿菌β-半乳糖苷酶底物特異性DNA改組+選擇活力增加66倍特異性增加1000倍大腸桿菌定向進(jìn)化的應(yīng)用精品醫(yī)學(xué)36蛋白質(zhì)工程改造的實(shí)際應(yīng)用枯草芽孢桿菌蛋白酶:一種絲氨酸蛋白酶,是工業(yè)上應(yīng)用很廣的酶,在洗滌劑、制革、絲綢等多種行業(yè)上有廣泛的用途。分子量較小,27.5kDa,功能研究的比較清楚,產(chǎn)生菌的基因也已經(jīng)被克隆,并已建立合適的表達(dá)載體系統(tǒng),是蛋白質(zhì)工程的理想的研究對(duì)象。精品醫(yī)學(xué)37精品醫(yī)學(xué)38精品醫(yī)學(xué)39精品醫(yī)學(xué)40精品醫(yī)學(xué)41(succinyl)-Ala-Al