分子醫(yī)學(xué)技能課件-實驗五-酶切鑒定-紫外分光光度法-()

1.重組質(zhì)粒的酶切鑒定(P82)2.紫外分光光度法檢測DNA含量(P39)實驗五原理在pH8.0（堿性）的環(huán)境中DNA的磷酸基團(tuán)解離,使DNA在該環(huán)境中帶負(fù)電荷,在電場中向正極方向泳動,因為各種DNA分子的電荷數(shù)、分子量、構(gòu)象不同,它們在通過凝膠立體網(wǎng)格時所受的動力和阻力不同,所以泳動的速度有差異,以此達(dá)到分離的目的。DNA顯色劑多用EB替代物,它能和堿基間的氫鍵結(jié)合,在紫外光照射下呈橘紅色（530nm）的熒光。21.酶切質(zhì)粒DNA后的瓊脂糖凝膠電泳①超螺旋DNA(SupercoilDNA,SCDNA)質(zhì)粒的三種構(gòu)型3②開環(huán)DNA(opencircularDNA,OCDNA)如果兩條鏈中有一條的一處或多處斷裂,分子就發(fā)生旋轉(zhuǎn)而消除鏈的張力,形成松弛型的環(huán)狀分子。4③線狀DNA(linearDNA,LCDNA):

如果兩條鏈均斷開,即為線狀DNA。電泳時,三者泳動速度大小關(guān)系SC>LC>OC5未酶切質(zhì)粒的電泳

對于未進(jìn)行酶切的質(zhì)粒來說:

常會出現(xiàn)兩條電泳帶,一條是（松弛）螺旋狀質(zhì)粒DNA帶,另一條是超螺旋狀質(zhì)粒DNA的帶,以超螺旋狀質(zhì)粒DNA居多,移動速度也最快。

有時還會出現(xiàn)三條帶,其中一條是因為有一些質(zhì)粒DNA在提取過程中遭到損傷而線性化,其移動速度介于螺旋狀和超螺旋狀質(zhì)粒DNA之間。如果提取的質(zhì)粒很好時,這條帶會很弱,有時看不到。實驗步驟1、灌膠；3、待膠凝固后將制膠板放在電泳槽中，輕輕的拔掉梳子；4、加樣：每排第一個孔加DNAmarker8μl（酶切組：酶切質(zhì)粒20ul和4μlloadingbuffer混勻全部上樣）(對照組：酶切前的質(zhì)粒10ul和2μlloadingbuffer在新的小管中混勻上樣,每組1個)；5、接通電源，開始電泳（150V，60min）;6.藍(lán)色條帶快到終點(diǎn)時停止電泳；7、觀察結(jié)果。7點(diǎn)樣孔細(xì)菌基因組DNAOC型質(zhì)粒DNAL型質(zhì)粒DNASC質(zhì)粒DNA細(xì)菌RNA質(zhì)粒電泳圖譜重組質(zhì)粒BamHIHindIII雙酶切電泳檢測5'-GAATTC-3‘3'-CTTAAG-5'BamHI5'-AAGCTT-3'3'-TTCGAA-5'

HindIIIU6基因片段256bp,載體片段3418bp10010001500200300400500600700800900M:Marker1:酶切樣品12:未酶切質(zhì)粒M21實驗小結(jié)結(jié)果分析與討論①酶切前后的對比？②質(zhì)粒構(gòu)型對結(jié)果的影響？③重組質(zhì)粒的濃度是多少？純度怎樣？11二、紫外分光光度法檢測DNA2.1分光光度技術(shù)2.1.1概念

分光光度技術(shù)是利用物質(zhì)特有的吸收光譜對其進(jìn)行定性、定量分析的實驗技術(shù)。122.1.2特點(diǎn)①靈敏度高:測定下限可達(dá)10－5～10－6mol/L②準(zhǔn)確度高:能夠滿足微量組分的測定要求，相對誤差2～5％;③操作簡便快速;④應(yīng)用廣泛。132.2原理2.2.1有關(guān)光學(xué)原理①光譜分區(qū)14遠(yuǎn)紫外近紫外可見光近紅外中紅外

遠(yuǎn)紅外（真空紫外）10nm~200nm200~380nm380~780nm780nm~2.5μm2.5μm~50μm50μm~300μm吸收光譜在光源和棱鏡之間放上某種物質(zhì)的溶液,發(fā)射光譜中某些波長的光因溶液吸收而消失,這種被溶液吸收后的光譜稱為該溶液的吸收光譜。15苯和甲苯在環(huán)己烷中的吸收光譜苯(254nm))甲苯(262nm)A

23025027016③入射光、透過光當(dāng)一束平行的單色光照射均勻的有色溶液時,光的一部分被吸收,一部分透過溶液,一部分被比色皿的表面反射。如果入射光的強(qiáng)度為I0,吸收光的強(qiáng)度為Ia,透過光的強(qiáng)度為It,反射光的強(qiáng)度為Ir,則:I0（入射光）＝Ia（吸收光）＋I(xiàn)t（透過光）＋I(xiàn)r（反射光）在吸光光度法中,由于采用同樣質(zhì)料的比色皿進(jìn)行測量,反射光的強(qiáng)度基本上相同,其影響可以相互抵消,上式可簡化為:I0（入射光）＝Ia（吸收光）＋I(xiàn)t（透過光）172.2.2光吸收基本定律:Lambert-Beer定律18朗伯定律:一束單色光通過溶液后，由于溶液吸收了一部分光能，光的強(qiáng)度就要減弱。若溶液的濃度不變，光通過的距離越長，光線減弱的程度就越大。D=kL比爾定律:當(dāng)一束單色光透過一定距離的溶液時，溶液的濃度越大，光線強(qiáng)度減弱就越顯著。D=kC

D為吸光度,k為消光系數(shù)Lambert-Beer定律

D＝KCL

吸光度摩爾消光系數(shù)光通過溶液的距離（cm）溶液濃度（mol/L）19將朗伯公式和比爾公式合并,就可以得到2.2.3分光光度法分析的依據(jù):①物質(zhì)對光是有選擇的吸收，其吸收光譜取決于物質(zhì)的結(jié)構(gòu)，這就是分光光度法定性分析的依據(jù)；②其吸收光譜的強(qiáng)度與物質(zhì)的濃度有關(guān)，這是分光光度法定量分析的依據(jù)。202.3分光光度計的基本部件光電212.3.1光源分光光度計上常用的光源有兩種:近紫外光區(qū)可見光區(qū)鎢絲燈近紅外光

紫外光區(qū)氫燈、氘燈222.3.2單色器是把混合光波分解為單一波長光的裝置。①棱鏡:光波通過棱鏡時，不同波長的光折射率不同，折射率與波長成負(fù)相關(guān)。②衍射光柵:在石英或玻璃的表面刻劃許多平行線，通過光的干涉和衍射，形成光譜。③狹縫:由一對隔板在光通路上形成的縫隙，通過調(diào)節(jié)縫隙的大小調(diào)節(jié)入射單色光的強(qiáng)度，以適應(yīng)檢測器的需要。232.3.3吸收池或稱比色杯、比色皿、比色池，是用來盛裝被測溶液和決定透光液層厚度的器件。一般由玻璃或石英制成，注意:a.與光束垂直；b.規(guī)格相同；c.清潔。242.3.4檢測器光電,并逐級放大。2.3.5測量裝置電流表、記錄器和數(shù)字示值讀數(shù)單元。25紫外分光光度法檢測DNA26實驗原理核酸、核苷酸及其衍生物都具有共軛雙鍵,具有紫外吸收。RNA和DNA的紫外吸收峰為260nm。蛋白質(zhì)由于含有芳香氨基酸,因此也能吸收紫外光。通常蛋白質(zhì)的吸收高峰在280nm處,在260nm處的吸收值僅為核酸的十分之一或更低,故核酸樣品中蛋白質(zhì)含量較低時對核酸的紫外測定影響不大。

DNA溶液A260/A280≥1.8。RNA溶液A260/A280≥2。當(dāng)樣品中蛋白質(zhì)含量較高時,比值即下降。產(chǎn)生誤差的原因:1.雜散光的影響；2.比色皿的影響；3.溫度、pH值的影響；4.吸光度讀數(shù)時的誤差。28紫外分光光度法優(yōu)點(diǎn):簡單、快速、靈敏、樣品可以回收。缺點(diǎn):有一定的誤差（原因）；受蛋白類物質(zhì)干擾。實驗步驟:0.1×TE作為空對照,在波長260nm、280nm、310nm處分別測標(biāo)準(zhǔn)DNA樣品的OD值根據(jù)OD值計算DNA濃度（g/ml）雙鏈DNA[dsDNA]=50×(OD26