分子生物學(xué)常用技術(shù)下

.分子生物學(xué)常用技術(shù).NCBI/Blast/Nucleotideblast1.核酸的分離純化和鑒定:基因組DNA.總RNA.質(zhì)粒2.基因的克隆與鑒定方法待查序列....3.外源基因轉(zhuǎn)移技術(shù)和表達(dá)體系4.檢測方法：電泳技術(shù)：agarose、SDS分子雜交:SB.NB.WB.基因芯片技術(shù)DNA序列測定生物信息學(xué)分析技術(shù)5.基因功能研究的方法6.組學(xué)研究技術(shù)：基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué).三、外源基因轉(zhuǎn)移技術(shù)和表達(dá)體系1.外源基因轉(zhuǎn)入技術(shù)細(xì)菌:熱激法，電轉(zhuǎn)化熱激法轉(zhuǎn)化試劑配制：？LB培養(yǎng)液LB-Amp平板LB-Kan平板a.加入連接產(chǎn)物/質(zhì)粒，冰浴b.42℃90sec，冰浴c.培養(yǎng):LB培養(yǎng)液d.涂板.生物學(xué)方法:農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)花粉管通道法介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化體外包裝轉(zhuǎn)染法共轉(zhuǎn)化生殖細(xì)胞浸泡法介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化化學(xué)方法:PEG介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化磷酸鈣沉淀法真核細(xì)胞.生物化學(xué)方法:脂質(zhì)體法:Kit生物物理方法:胚胎干細(xì)胞法電轉(zhuǎn)化法:電轉(zhuǎn)儀物理學(xué)方法:基因槍法顯微注射介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化胚囊、子房注射法介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化激光微束介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化超聲波介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化碳化硅纖維介導(dǎo)法.2.原核細(xì)胞表達(dá)體系:大腸桿菌優(yōu)點:遺傳背景清楚、繁殖快、成本低、表達(dá)量高、表達(dá)產(chǎn)物容易純化、穩(wěn)定性好、抗污染能力強(qiáng)和適用范圍廣。缺點:表達(dá)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物不能進(jìn)行翻譯后修飾、高表達(dá)時容易發(fā)生折疊錯誤、Ecoli本身內(nèi)毒素和毒性蛋白可能混雜在終產(chǎn)物中。成功例子:β-干擾素.組成

啟動子：lac、trp、tac、PL啟動子目的基因編碼序列終止子：受體細(xì)胞表達(dá)載體表達(dá)方式非融合蛋白：pBV220融合蛋白分泌表達(dá):含有信號肽序列，OmpA等帶純化標(biāo)簽的表達(dá)：GST、His6表面呈現(xiàn)表達(dá)帶伴侶的表達(dá)：GroEL、GroES等分離純化:親和層析.重組蛋白的制備:細(xì)菌重組表達(dá)載體Ni-親和膠GST-親和膠表達(dá)形式分析：可溶性/包涵體親和純化宿主菌:BL21轉(zhuǎn)化重組蛋白表達(dá)：SDS誘導(dǎo)劑重組蛋白WB鑒定.3.真核細(xì)胞表達(dá)體系(1)酵母表達(dá)體系畢赤酵母表達(dá)體系:表達(dá)水平高(外源蛋白占菌體總蛋白10-30%)，異源蛋白的表達(dá)有胞內(nèi)和分泌兩種形式。工藝成熟，分離純化簡單，糖基化方式更接近高等生物。成功例子:乙型肝炎病毒表面抗原釀酒酵母表達(dá)體系:遺傳背景清楚，容易操作，但表達(dá)的重組蛋白產(chǎn)量偏低(外源蛋白占菌體總蛋白10%)，且會被超糖基化。有胞內(nèi)表達(dá)和分泌性表達(dá)兩種，只有分泌性表達(dá)的蛋白質(zhì)才能被糖基化。成功例子:水蛭素.(2)昆蟲細(xì)胞桿狀病毒表達(dá)體系桿狀病毒主要感染昆蟲，利用昆蟲細(xì)胞生產(chǎn)重組蛋白。受體細(xì)胞:草地夜蛾細(xì)胞株sf9和sf21。優(yōu)點:昆蟲和哺乳動物細(xì)胞的翻譯后加工方式相似，重組蛋白的抗原性、免疫原性和功能與天然蛋白相似，表達(dá)水平較高(發(fā)酵液中目的產(chǎn)物含量1-500mg/L)。缺點:糖基化程度較低，形式較為單一。.(3)哺乳動物細(xì)胞表達(dá)體系調(diào)控序列啟動子:SV40、RSV、ADV、CMV、HSP、MCK終止子:SV40小t抗原基因、β珠蛋白基因、牛生長激素基因的轉(zhuǎn)錄終止信號。選擇性標(biāo)記基因:TK、APH、dhfr、XGPRT可調(diào)控表達(dá)體系:Tet-on和Tet-off體系pERV3和pEGSH誘導(dǎo)體系宿主細(xì)胞:CHO、COS、BHK、SP2/0、NIH3T3、HEK293等.優(yōu)點:產(chǎn)品的抗原性、免疫原性和功能與天然蛋白質(zhì)最接近，糖基化等翻譯后加工最準(zhǔn)確。缺點:表達(dá)水平低，發(fā)酵液中目的產(chǎn)物我國為0.2~1g/L，國際上多在1~2g/L以上。2007年,全球銷售額最高的6大類生物技術(shù)藥物中,有五類(腫瘤治療藥物、anti-TNF

α藥物、EPO、胰島素和凝血因子)都是經(jīng)哺乳動物細(xì)胞表達(dá)生產(chǎn)的。動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)是當(dāng)前生物藥物生產(chǎn)的主流方式。.四、檢測方法1.電泳技術(shù)核酸:完整性、分離、純化瓊脂糖凝膠電泳:agarose,水平,1XTAEEB(2ng),Gelred,Goldview,紫外燈試劑配制：？50XTAE..圖PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果1.DNA相對分子質(zhì)量DL2000;2.PCR產(chǎn)物;3.PCR空白對照。.聚丙烯酰胺凝膠電泳:PAGE(Acr+Bis)垂直,銀鹽染色非變性/變性.蛋白質(zhì):SDS.1.試劑配制：？30%丙烯酰胺-N,N亞甲雙丙烯酰胺1.5MpH8.8Tris-HCl1MpH6.8Tris-HCl10%SDS10%過硫酸銨電泳緩沖液：25mMTris-HCl(pH8.0),250mMGly,0.1%SDS(pH8.3)4X電泳加樣緩沖液考馬斯亮藍(lán)染色液脫色液2.濃縮膠和分離膠配制表：？10%分離膠.1.配膠:分離膠濃度，膠凝時間，儲存2.上樣:30μl/次/道3.電泳:90V120V4.染色5.脫色步驟:.1948年諾貝爾化學(xué)獎ArneWilhelmKaurinTiselius“發(fā)展了電泳和吸收分析等方法,發(fā)現(xiàn)了血清蛋白的組分”電泳、色譜、相分離、凝膠過濾.(1)原理:變性和復(fù)性2.核酸分子雜交堿基互補(bǔ)配對兩條核酸單鏈(同源性)退火雙鏈條件(溫度及離子).(2)探針概念:特定的已知核苷酸片段,能與互補(bǔ)核酸序列退火雜交,用于待測核酸樣品中特定核酸順序的檢測..種類

基因組DNA:外顯子

cDNA:理想，非特異性少，獲得困難

cRNA：理想，雜合體穩(wěn)定，雜交溫度高雜交效率高非特異性少寡核苷酸片段：15-30bp，雜交時間短.標(biāo)記物特性高度靈敏性不影響堿基配對不影響探針分子的主要理化特性使用酶促方法時,不影響酶活性檢測方法的靈敏性和特異性高化學(xué)穩(wěn)定性高操作的安全性.放射性同位素:32P,3H,35S非放射性標(biāo)記物:生物素、地高辛、熒光素.標(biāo)記方法內(nèi)標(biāo)記末端標(biāo)記

切口平移法隨機(jī)引物法單鏈DNA探針cRNA探針標(biāo)記.切口平移法:dsDNA，摻入率高，最常用[α-32P]dATP37℃15min限速步驟37℃2～3h.dsDNA+隨機(jī)引物變性:沸水3min冰浴:1minKlenow大片段:RT≤3h5’3’聚合酶活性3’5’外切酶活性[α-32P]dATP隨機(jī)引物法:dsDNA，摻入率高，常用.單鏈DNA探針標(biāo)記:M13噬菌體的DNA片段標(biāo)記.dsDNA3’端GAATTCCTTAAGGCTTAAAATTCG+EcoRⅠ方法1:內(nèi)切酶切出粘末端＋Klenow大片段適當(dāng)種類的[α-32P]dNTP末端標(biāo)記:.方法2:3’端填充標(biāo)記法T4噬菌體DNA聚合酶、T7噬菌體DNA聚合酶、Klenow片段dNTP-:3’5’外切酶dNTP+:5’3’聚合酶.5’末端：T4多核苷酸激酶(T4PNK)，DNA.RNA[γ-32P]dATP5’-OH末端寡核苷酸的磷酸化磷酸基團(tuán)的交換.純化凝膠過濾層析:SephadexG-50乙醇沉淀法.液相雜交:待檢物在液體中，速度快，與核酸電鏡技術(shù)結(jié)合在一起，研究不同DNA的同源性mRNA與染色體DNA間的關(guān)系固相雜交:待檢物在一定支持物上，檢測方便，應(yīng)用廣泛。膜固相印跡雜交細(xì)胞原位雜交(3)分類.固相支持物結(jié)合核酸類型ssDNAssDNAssDNARNAdsDNAdsDNARNARNA荷載能力(μg/cm2)80~100400~600400~600膜強(qiáng)度差好好結(jié)合核酸的方式非共價結(jié)合共價結(jié)合共價結(jié)合結(jié)合核酸最小長度500nt50nt/bp50nt/bp固定方法80℃烘烤2h80℃烘烤2h80℃烘烤2h

或紫外交聯(lián)或紫外交聯(lián)

硝酸纖維素膜普通尼龍膜帶正電荷尼龍膜.固相雜交Southern-blotNorthern-blotDot-blot原位雜交菌落原位雜交.(4)過程檢測核酸(單鏈或雙鏈)固定在膜上(雙鏈變性為單鏈)探針的制備和標(biāo)記預(yù)雜交封閉膜上的非特異結(jié)合位點降低雜交本底雜交雜交溫度和離子強(qiáng)度洗膜離子強(qiáng)度和溫度洗去非特異性結(jié)合的探針放射自顯影化學(xué)顯色法.SouthernblotdsDNA內(nèi)切酶dsDNA片段-+電泳+************標(biāo)記的探針*******雜交轉(zhuǎn)膜**放射自顯影洗膜.印跡方法:毛細(xì)管轉(zhuǎn)移法、電轉(zhuǎn)移法和真空轉(zhuǎn)移法.Bio-Rad電轉(zhuǎn)儀.Agarose電泳SouthernblotNorthernblot基因組DNA總RNA限制性內(nèi)切酶尼龍膜甲醛變性電泳變性PAGE基因酶切圖譜基因組基因定性及定量基因突變探針特定RNA定性定量大小探針

轉(zhuǎn)移NaOH濾膜再次使用.Southern印跡雜交1、處理樣品2、凝膠電泳及轉(zhuǎn)移前處理3、核酸轉(zhuǎn)移及固定4、預(yù)雜交5、雜交6.洗膜7、雜交結(jié)果的檢測8、雜交膜的重復(fù)使用.1實驗準(zhǔn)備:創(chuàng)造一個無RNA酶的環(huán)境2制備凝膠3樣品的處理:在雜交之前，應(yīng)該確定所用的核酸樣品具有相當(dāng)?shù)募兌群屯暾?RNA電泳及轉(zhuǎn)移5核酸的固定、預(yù)雜交、雜交、洗膜及雜交結(jié)果的檢測均同Southern印跡雜交Northern印跡雜交.斑點雜交與狹縫雜交

概念:將DNA或RNA樣本變性后直接點于膜上,用于基因組中特定基因表達(dá)的定性和定量分析,簡單快速,一張膜可同時檢測多個樣本。.組織或細(xì)胞經(jīng)適當(dāng)處理后,細(xì)胞通透性增加,探針能與細(xì)胞內(nèi)DNA或RNA雜交,可以確定探針互補(bǔ)序列在胞內(nèi)位置,具有重要的生物學(xué)和病理學(xué)意義。原位雜交:.菌落的原位雜交:篩選含有陽性重組子的菌落。菌落轉(zhuǎn)印到膜上原位溶菌和變性雜交.蛋白質(zhì)雜交:WB.1.樣品處理:RIPA裂解，超聲，離心，總蛋白濃度2.SDS:分離膠濃度3.轉(zhuǎn)膜:-濾紙-膠-NC膜-濾紙+，條件4.麗春紅染色:麗春紅5.封閉:5％脫脂奶粉-TBST，RT1h搖床6.Ab1:1:50~1:3000(封閉液)，RT1h/4℃過夜7.洗膜:TBST，RT1h，換液，搖床8.Ab2:1:3000(封閉液)，RT40min，搖床9.洗膜:同前10.ECL顯色:RT5min，暗室，X-光片.生物芯片:包括基因芯片、蛋白質(zhì)芯片和組織芯片三類芯片:在有限的材料表面固定大量的樣品，一次試驗可對很多的基因或蛋白進(jìn)行檢測?；蛐酒?又稱DNA微陣列或DNA芯片，是在基片上面積很小的區(qū)域內(nèi)有序地固定大量的基因探針組成。種類:寡核苷酸芯片和cDNA芯片制備方法:直接點樣法:寡核苷酸芯片和cDNA芯片原位合成法:寡核苷酸芯片.基因芯片a.探針(DNA或cDNA)固定:以高密度點陣的形式按一定順序固定排列在硅片(玻片、尼龍膜等)表面上b.待測樣品標(biāo)記:DNA.RNA或cDNA用熒光標(biāo)記c.雜交d.檢測:讀片儀

一次實驗，DNA芯片便能記錄成千上萬的基因表達(dá)圖譜。..應(yīng)用:a.基因表達(dá):直接檢測mRNA的種類及豐度，是研究基因表達(dá)的有力工具。b.基因突變和基因診斷:大規(guī)模地篩查由基因突變引起的疾病，輔助疾病的診斷。c.基因測序d.功能基因組研究.3.DNA序列測定化學(xué)裂解法:Maxam和Gilbert，1977，可用于補(bǔ)充DNA測序結(jié)果，常用于難以用酶末端終止法測序的特殊DNA序列及結(jié)構(gòu)。酶末端終止法:Sanger和Nicklen，1977，又稱為雙脫氧鏈終止法。自動化程度高，且在技術(shù)上不斷進(jìn)步。如熒光標(biāo)記DNA測序技術(shù)、毛細(xì)管測序儀等。全基因組鳥槍測序法:用于大規(guī)?；蚪M測序，不需要預(yù)先構(gòu)建基因組的物理圖譜，CeleraGenomics公司用以人類基因組測序。逐個克隆鳥槍測序法:用于大規(guī)?；蚪M測序，需預(yù)先構(gòu)建基因組的物理圖譜，人類基因組計劃公共聯(lián)盟采用這個方法用于人類基因組測序。雜交測序:借助于基因芯片.(1)化學(xué)裂解法a.先將DNA的末端之一進(jìn)行標(biāo)記(32P)；b.在多組互相獨立的化學(xué)反應(yīng)中分別進(jìn)行特定堿基的化學(xué)修飾；c.在修飾堿基位置化學(xué)法斷開DNA鏈；d.聚丙烯酰胺凝膠電泳將DNA鏈按長短分開；e.根據(jù)放射自顯影顯示區(qū)帶,直接讀出DNA的核苷酸序列。

.(2)Sanger雙脫氧鏈終止法...PaulBerg

WalterGilbert

FrederickSanger

“在核酸堿基序列測定的貢獻(xiàn)”1980年諾貝爾化學(xué)獎“在核酸生化,尤其是DNA重組的基礎(chǔ)研究”.逐個克隆鳥槍法測序.全基因組鳥槍法測序.(3)雜交測序:是以基因芯片為基礎(chǔ)的一種測序方法，將一段DNA片段分解為一系列相差一個堿基的八聚體，將這些八聚體做成基因芯片與待測DNA雜交，根據(jù)雜交結(jié)果拼湊出所測DNA序列。.4.生物信息學(xué)分析技術(shù)概念:是生物學(xué)和信息技術(shù)的結(jié)合，利用計算機(jī)對大量生物數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。組成:數(shù)據(jù)庫:數(shù)據(jù)采集，包括DNA/RNA/蛋白質(zhì)測序，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，基因/蛋白質(zhì)表達(dá)數(shù)據(jù)，蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)。算法和統(tǒng)計方法:確定大數(shù)據(jù)集中各成員的關(guān)系對生物數(shù)據(jù)的分析和解釋:生物數(shù)據(jù)的檢索Entrez,NCBI,BLAST.1.動物模型2.蛋白質(zhì)相互作用3.定點突變技術(shù)4.基因表達(dá)譜和表型變化線索:生物信息學(xué)五、基因功能研究的方法.方法直接轉(zhuǎn)染或用反轉(zhuǎn)錄病毒感染胚胎干細(xì)胞,然后將這些細(xì)胞移植到囊胚發(fā)育階段的胚胎中；b.用反轉(zhuǎn)錄病毒感染早期胚胎；c.將包含目的基因的DNA顯微注射到卵母細(xì)胞、受精卵或早期胚胎細(xì)胞中；d.雄配子介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移；e.將目的基因轉(zhuǎn)移到未受精的卵細(xì)胞中；f.通過基因槍和電融合等物理方法進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移。1.轉(zhuǎn)基因動物.2007年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎MarioR.CapecchiSirMartinJ.EvansOliverSmithies“發(fā)現(xiàn)利用胚胎干細(xì)胞在小鼠中引起特定基因修飾的原則”.基因敲除:又稱為胚胎干細(xì)胞基因打靶技術(shù)。動物模型:小鼠，ES細(xì)胞核型為40XY打靶載體:置換型和插入型數(shù)據(jù)庫:1995年建立MKMD(MouseKnockout&MutationDatabase)/mkmd.鑒別純合的基因敲除動物打靶載體的構(gòu)建ES細(xì)胞的體外培養(yǎng)將打靶載體導(dǎo)入ES細(xì)胞通過抗性標(biāo)記篩選目的基因已被破壞的干細(xì)胞克隆基因敲除ES細(xì)胞的胚胎移植鑲嵌個體與正常純合個體雜交鑒別出的雜合體后代相互雜交.外源基因過表達(dá):將外源基因的載體注入受精卵細(xì)胞篩選帶有外源基因的個體帶有外源基因的個體雜交,以保持性狀受精卵移入帶孕小鼠.概念:真核生物中，雙鏈RNA誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性基因沉默的現(xiàn)象。是一種序列特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默過程，它通過雙鏈RNA分子引起具有相同序列的mRNA發(fā)生降解來關(guān)閉基因表達(dá)活性，能夠產(chǎn)生功能缺失表型，是功能基因組學(xué)研究的重要工具。生物學(xué)意義:遺傳監(jiān)視器監(jiān)控異常的或外源遺傳物質(zhì)在機(jī)體內(nèi)的水平，調(diào)控基因的表達(dá)

2.RNA干涉:RNAinterference,RNAi..2006年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎AndrewZ.FireCraigC.Mello“發(fā)現(xiàn)RNA干涉作用雙鏈RNA引起的基因沉默”.機(jī)制dsRNA的形成短干擾RNA的產(chǎn)生靶mRNA的降解.靶序列的選擇:a.基因外顯子編碼區(qū)的dsRNA能產(chǎn)生特異和高效的抑制作用，對應(yīng)于內(nèi)含子序列的dsRNA不能產(chǎn)生可檢測的抑制效應(yīng)。b.在構(gòu)建載體時，應(yīng)選擇cDNA分子中的可讀框序列c.避免起始密碼子下游和終止密碼子上游50～100nt范圍內(nèi)序列d.避開多個串聯(lián)的G、T或A堿基的區(qū)域e.GC含量應(yīng)該小于50％f.與其他基因無同源性g.同時構(gòu)建兩個以上對同一基因不同靶區(qū)域的dsRNA表達(dá)載體.方法化學(xué)合成。體外轉(zhuǎn)錄。RNaseIII家族的酶（例如:Dicer，RNaseIII）切割長鏈dsRNA。用PCR法合成siRNA表達(dá)結(jié)構(gòu)，并在細(xì)胞中表達(dá)。向細(xì)胞中導(dǎo)入可表達(dá)siRNA的質(zhì)粒載體或病毒載體，并使之表達(dá)。向細(xì)胞中轉(zhuǎn)染siRNA..步驟:a.設(shè)計并合成siRNA;b.利用脂質(zhì)體將siRNA導(dǎo)入細(xì)胞c.具有相同序列的mRNA降解d.細(xì)胞或個體不能合成相應(yīng)的蛋白質(zhì)，表現(xiàn)出功能缺失表型檢測:RT-PCR，WB對照:陰性，陽性，空白.3.反義核酸技術(shù):根據(jù)核酸雜交原理設(shè)計的選擇性抑制特定基因表達(dá)的實驗技術(shù)。1)種類：反義DNA(oligodeoxymucleotide,ODNs)、反義RNA.核酶（ribozyme)、DNAzyme2)生物學(xué)作用：抑制靶基因的表達(dá)3)設(shè)計：隨機(jī)篩選靶點4)長度:15~20nt.5)機(jī)理:空間位阻:與mRNA或DNA雙鏈形成的RNA/DNA雜交體激活RNaseH活性阻止mRNA的拼接阻止靶基因的復(fù)制或轉(zhuǎn)錄6)修飾改變立體構(gòu)型:由天然的β型糖苷鍵改為α型化學(xué)修飾:即ODNs磷酸糖骨架的磷酸二酯鍵被一些化學(xué)基因取代ODNs末端修飾肽核酸.7)問題非反義效應(yīng)靶mRNA的不可接近性反義核酸進(jìn)入細(xì)胞后可與其它分子如蛋白相互作用，可能引起一系列的副作用RNaseH作用特性的影響反義核酸的劑量-效應(yīng)曲線局限的范圍非常窄8)應(yīng)用前景:反義藥物，基因功能研究.4.蛋白質(zhì)的相互作用基于文庫篩選的方法:酵母雙雜交、表面展示技術(shù)生物物理方法:免疫共沉淀、蛋白質(zhì)親和層析、交聯(lián)技術(shù)和熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)遺傳學(xué)方法:基因外抑制子、合成致死篩選.(1)酵母雙雜交:通過鑒定報告基因的轉(zhuǎn)錄活性檢測蛋白質(zhì)。LexA=BD+AD.步驟:a.構(gòu)建誘餌質(zhì)粒誘餌基因亞克隆至BD表達(dá)載體誘餌蛋白在酵母中表達(dá)的鑒定:Western-blot誘餌質(zhì)粒自激活作用的檢測b.構(gòu)建至AD表達(dá)載體cDNA文庫的擴(kuò)增:庫容108c.篩庫:將重組BD和AD質(zhì)粒分別或同時轉(zhuǎn)染酵母報告菌株，利用報告基因篩選陽性克隆d.PCR反應(yīng)鑒定e.測序f.蛋白相互作用的驗證:g.功能研究體系：Gal4(最常用)、LexA/Gal4.LexA/VP16.優(yōu)點:高敏感性，適用于細(xì)胞核內(nèi)外多種蛋白質(zhì)之間相互作用的研究。缺點:a.不適宜于轉(zhuǎn)錄因子相互作用蛋白質(zhì)的篩選b.酵母細(xì)胞中蛋白質(zhì)翻譯后修飾比較簡單c.通過酵母雙雜交篩選獲得的多為EST片段d.存在假陽性與假陰性的問題.應(yīng)用根據(jù)研究目的可分為三類:a.明確兩種已知蛋白之間有無相互作用；b.鑒定已明確有相互作用的蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用所必須的功能域以及特定氨基酸的改變對相互作用的影響；c.尋找與某一特定蛋白質(zhì)有相互作用的未知蛋白.其他雜交體系反向雜交體系:蛋白質(zhì)相互作用－報告基因產(chǎn)生特殊物質(zhì)－細(xì)胞死亡蛋白質(zhì)無相互作用－報告基因不產(chǎn)生特是物質(zhì)－細(xì)胞存活應(yīng)用:鑒別不同突變對蛋白質(zhì)相互作用的影響，篩選阻止某些蛋白質(zhì)相互作用的肽或小分子物質(zhì)單雜交體系:研究DNA與蛋白質(zhì)相互作用，分離能與DNA序列結(jié)合的蛋白質(zhì)的基因.RNA蛋白質(zhì)小分子蛋白質(zhì)三雜交體系:研究RNA與蛋白質(zhì)之間相互作用關(guān)系以及小分子與蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系。.(2)表面展示技術(shù)噬菌體表面展示技術(shù):最常用，在噬菌體顆粒的表面通過衣殼蛋白定位表達(dá)與之融合的外源蛋白質(zhì)或多肽，可用于篩選和改造功能性多肽，研究基因功能。酵母表面展示技術(shù):通過將酵母自身分泌到細(xì)胞外的蛋白質(zhì)編碼基因與外源蛋白質(zhì)基因融合，將外源蛋白質(zhì)展示于酵母表面，用于篩選具有高親和力的多肽。動物病毒展示技術(shù)核糖體展示技術(shù).(3)免疫共沉淀技術(shù):概念:是分析確定生理條件下完整細(xì)胞內(nèi)兩種蛋白質(zhì)是否存在相互作用的有效方法。原理:是利用標(biāo)簽抗體與融合蛋白攜帶的標(biāo)簽之間的高親和力特性純化和檢出溶液中的靶分子。注意:抗原的豐度抗體對抗原的親和力，最好選用單抗。免疫共沉淀:真核細(xì)胞

X-HA+Y-myc共轉(zhuǎn)染Cos7/293細(xì)胞

IP:HAIB:mycIP:mycIB:HA共定位:真核細(xì)胞X-GFP+Y-RFP共轉(zhuǎn)染Cos7/293細(xì)胞，熒光顯微鏡.EMSA(electromobilityshiftassay):蛋白質(zhì)-DNA間的相互作用將DNA進(jìn)行放射性標(biāo)記(<50bp)與細(xì)胞/細(xì)胞核提取物反應(yīng)非變性PAGE與蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA遷移率降低問題:蛋白質(zhì)是否與DNA結(jié)合?.(4)蛋白質(zhì)親和層析技術(shù):將特定蛋白質(zhì)固定于固相載體上用于吸附能與之特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)，用于蛋白質(zhì)的純化和推測功能未知目的蛋白的功能。CIPM66.2kDHis6-TRF1可溶性.(5)抗原表位的鑒定與分析方法抗原和抗體的識別與結(jié)合是最典型的蛋白質(zhì)之間的相互作用對位:指抗體參與結(jié)合的部位表位:指抗原參與結(jié)合的部位鑒定方法:計算機(jī)軟件對抗原氨基酸序列的結(jié)構(gòu)分析，準(zhǔn)確率達(dá)75％，包括親水性、可及性、抗原性、可塑性、電荷分布和二級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析。實驗方法:酶促/化學(xué)裂解片段分析法、蛋白質(zhì)印跡法、肽掃描、表面呈現(xiàn)肽庫/隨機(jī)片段表達(dá)庫篩選、化學(xué)修飾/突變分析、X射線衍射、表面等離子共振和核磁共振等。應(yīng)用:合成多肽疫苗、制備診斷試劑和篩選高效價抗體；利用定點突變技術(shù)改造蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)以降低蛋白質(zhì)藥物免疫原性。.5.基因表達(dá)譜和表型變化基因表達(dá)差異蛋白質(zhì)水平:雙向凝膠電泳和質(zhì)譜技術(shù)基因芯片技術(shù)(主流)代表性差異分析抑制性減法雜交技術(shù)mRNA減法雜交技術(shù)基因表達(dá)系列分析法基因組錯配篩選技術(shù)。表型變化抑制基因的表達(dá):反義寡核苷酸、核酶、負(fù)顯性突變體、轉(zhuǎn)基因、RNAi增強(qiáng)基因表達(dá):即功能增益，增加基因拷貝數(shù)或采用強(qiáng)啟動子促使基因過量表達(dá)。RNA水平.六、組學(xué)研究技術(shù)1.基因組學(xué)轉(zhuǎn)錄組分析:即mRNA的定性和定量分析，分類: