分子生物學(xué)第五章

第五部分分子克隆技術(shù)大腸桿菌基因組人類基因組真核細(xì)胞的基因及cDNAcDNADNA目的DNA片段分子克隆(Molecularcloning):產(chǎn)生許多相同的DNA分子的過程。分子克隆(Molecularcloning)基因組DNA載體限制性內(nèi)切酶酶切限制性內(nèi)切酶酶切、電泳分離、純化DNA連接酶重組載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)大腸桿菌宿主細(xì)胞細(xì)菌增殖分子克隆的基本過程重組載體在大腸桿菌宿主細(xì)胞中復(fù)制以產(chǎn)生許多相同的DNA分子拷貝完成分子克隆所需的條件

載體

目的DNA或cDNA

工具酶(限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶、修飾酶)

宿主細(xì)胞及導(dǎo)入重組DNA分子到宿主細(xì)胞的手段陽性克隆的篩選方法基因組測序特定基因的克隆、表達(dá)及功能鑒定基因診斷：疾病相關(guān)基因的檢測，病原微生物的檢測等

DNA指紋分析基因治療重組病毒疫苗、DNA疫苗藥物研發(fā)及藥物生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)、植物的產(chǎn)生微生物生產(chǎn)能源及處理環(huán)境廢物分子克隆技術(shù)的應(yīng)用利用大腸桿菌生產(chǎn)人胰島素發(fā)酵裝置人胰島素載體和宿主細(xì)胞

(VectorsandHostcells)(一)克隆載體(Cloningvectors)

用于構(gòu)建基因組文庫、cDNA

文庫以及克隆某一特定基因或cDNA

以測定其核苷酸序列。1.質(zhì)粒(plasmid)2.噬菌體載體(

phage)3.粘粒(cosmid)4.細(xì)菌人工染色體(Bacterialartificialchromosome,BAC)5.酵母人工染色體(Yeastartificialchromosome,YAC)載體(Vectors)

(二)表達(dá)載體(Expressionvectors)

用于表達(dá)某一基因或cDNA

以獲得目的蛋白。表達(dá)載體的種類較多，根據(jù)要表達(dá)的目的蛋白的特點(diǎn)對載體進(jìn)行選擇。1.原核表達(dá)載體(質(zhì)粒)：用原核細(xì)胞表達(dá)目的蛋白2.真核表達(dá)載體(質(zhì)粒)：用真核細(xì)胞表達(dá)目的蛋白

用于酵母的表達(dá)載體

用于昆蟲細(xì)胞的表達(dá)載體

用于哺乳類細(xì)胞的表達(dá)載體功能分析結(jié)構(gòu)分析藥物篩選臨床藥物克隆目的基因或cDNA到克隆載體亞克隆目的基因或cDNA到表達(dá)載體表達(dá)目的蛋白基因治療克隆載體 宿主細(xì)胞 載體結(jié)構(gòu) 外源插入片段克隆質(zhì)粒 大腸桿菌 環(huán)狀質(zhì)粒

0.1-10kb

噬菌體載體 大腸桿菌 線狀病毒 8-25kb粘粒 大腸桿菌 環(huán)狀質(zhì)粒 35-45kb細(xì)菌人工染色體 大腸桿菌 環(huán)狀質(zhì)粒 50-300kb酵母人工染色體 酵母 線狀染色體 100-1000kb克隆載體的類型低分子量、高拷貝數(shù)質(zhì)粒：高拷貝數(shù)質(zhì)?？纱罅繑U(kuò)增被克隆的目的基因、DNA片段或cDNA。含有一個(gè)或幾個(gè)可供選擇的標(biāo)記：抗生素的抗性基因、細(xì)菌的lacZ

基因片段及ccdB

致死基因等。含多克隆位點(diǎn)(Multiplecloningsite,MCS)：在質(zhì)粒的選擇性標(biāo)記中有多個(gè)限制性內(nèi)切酶單一識(shí)別位點(diǎn)，允許外源DNA插入?？寺≠|(zhì)粒(Cloningplasmid)MCS(pUC18)ApR:Ampicillinresistancegenerep(ori):replicationoriginlacZ:N-terminal-galactosidaseMCS:multiplecloningsites基因組被改造的E.coli

菌株DH5

F-endA1glnV44thi-1recA1relA1gyrA96deoR

nupG

Φ80dlacZΔM15Δ(lacZYA-argF)U169,hsdR17(rK-mK+),

-

JM109endA1glnV44thi-1relA1gyrA96recA1mcrB+Δ(lac-proAB)e14-[F'traD36proAB+

lacIqlacZΔM15]hsdR17(rK-mK+)

XL1-BlueendA1gyrA96(nalR)thi-1recA1relA1lacglnV44F'[::Tn10proAB+

lacIqΔ(lacZ)M15]hsdR17(rK-mK+)

用于基因克隆的大腸桿菌(E.coli

)菌株表達(dá)載體(質(zhì)粒)原核細(xì)胞與真核細(xì)胞表達(dá)目的蛋白的特點(diǎn)大腸桿菌菌株(基因組被改造) BL21(DE3),CD41(DE3),ER2566酵母細(xì)胞

P.pastoris,S.cerevisiae,

S.pombe昆蟲細(xì)胞系

Sf9,Sf21各種高等真核生物的組織細(xì)胞用于目的蛋白表達(dá)的宿主細(xì)胞構(gòu)成原核表達(dá)載體的元件復(fù)制起始點(diǎn)多克隆位點(diǎn)(MSC)抗生素抗性基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄終止子有些載體具有核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)用于純化目的蛋白的標(biāo)簽(tag)

His-tag6-10個(gè)His(組氨酸)與目的蛋白的N或C末端形成融合蛋白，便于用His-Ni或His-Co親和層析法純化目的蛋白；

GST(glutathioneS-transferase)GST與目的蛋白的N端形成融合蛋白，便于用

glutathione-Sepharose

純化目的蛋白；

MBP(Maltosebindingprotein)MBP與目的蛋白的N端形成融合蛋白，便于用

amylose-Sepharose

純化目的蛋白；

CBD-tagCBD(Cellulosebindingdomain)與目的蛋白的N端形成融合蛋白，便于用纖維素純化目的蛋白。用于純化目的蛋白的標(biāo)簽親和層析真核表達(dá)載體為穿梭載體(shuttlevector)，既可在大腸桿菌中復(fù)制擴(kuò)增(便于基因克隆)，又可在真核細(xì)胞中表達(dá)目的蛋白。用于大腸桿菌的復(fù)制起始點(diǎn)多克隆位點(diǎn)(MCS)

用于大腸桿菌的抗生素抗性基因；用于真核細(xì)胞的抗生素抗性基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄終止子添加PolyA

的信號(hào)序列構(gòu)成真核表達(dá)載體的元件多克隆位點(diǎn)

Ampicillin,kanamycin,HygromycinB抗性基因用于E.coli

中復(fù)制的復(fù)制起點(diǎn)來源于SV40的復(fù)制起點(diǎn)

Neomycin,Zeocin,Blasticidin

抗性基因，用于篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系

CMV(cytomegalovirus),SV40(Simianvirus40),RSV啟動(dòng)子

轉(zhuǎn)錄終止子

加PolyA

的信號(hào)序列哺乳類細(xì)胞表達(dá)載體用于基因治療的病毒表達(dá)載體逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(Retroviralvectors)

慢病毒載體(Lentivirusvectors)

腺病毒載體(Adenoviralvectors)

用于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的表達(dá)載體含組織表達(dá)特異性的啟動(dòng)子

用于噬菌體展示(PhageDisplay)的載體將目的基因插入噬菌體衣殼蛋白基因，形成的融合蛋白出現(xiàn)在噬菌體表面，目的蛋白或多肽保持相對獨(dú)立的空間結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性。其他特殊表達(dá)載體轉(zhuǎn)化(Transformation)

將外源DNA導(dǎo)入細(xì)菌的過程。

化學(xué)法、物理法(電轉(zhuǎn)化)

轉(zhuǎn)染(Transfection)

將外源DNA導(dǎo)入真核細(xì)胞的過程。 化學(xué)法、物理法轉(zhuǎn)導(dǎo)(Transduction)

利用噬菌體將外源DNA導(dǎo)入細(xì)菌的過程。感染(Infection)

利用病毒將外源DNA導(dǎo)入真核細(xì)胞的過程。載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞的方法

CaPO4-DNA共沉淀法鈣離子與DNA的磷酸基團(tuán)結(jié)合形成不溶性沉淀CaPO4-DNA，并附著于細(xì)胞表面，通過細(xì)胞內(nèi)吞作用被細(xì)胞所吸收。

DEAE-葡聚糖方法帶正電荷的DEAE-葡聚糖與帶負(fù)電荷的DNA磷酸基團(tuán)結(jié)合形成DEAE-葡聚糖-DNA復(fù)合物并結(jié)合帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜，通過細(xì)胞內(nèi)吞作用被細(xì)胞所吸收。脂質(zhì)體法陽離子脂質(zhì)富集DNA分子，形成穩(wěn)定的DNA-脂質(zhì)體并附著于帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜，脂質(zhì)體與細(xì)胞膜發(fā)生融合，DNA被細(xì)胞所吸收。電穿孔法原理同電穿孔轉(zhuǎn)化方法，但所用的參數(shù)不同。顯微注射法轉(zhuǎn)染方法人工合成的陽離子脂質(zhì)Transfectam

的結(jié)構(gòu)構(gòu)建攜帶目的基因的表達(dá)載體表達(dá)載體被細(xì)胞吸收到細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)載體轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中目的基因及選擇性標(biāo)記整合到基因組DNA中目的基因在真核細(xì)胞中的表達(dá)暫態(tài)表達(dá)穩(wěn)定表達(dá)轉(zhuǎn)染暫態(tài)表達(dá)(Transientexpression)

表達(dá)載體轉(zhuǎn)染動(dòng)物細(xì)胞后，表達(dá)載體以附加體(episome)形式存在于細(xì)胞核中。表達(dá)載體上的目的基因在24

-

72小時(shí)內(nèi)表達(dá)，并隨著附加體的消失而最終消失。穩(wěn)定表達(dá)(Stableexpression)

用選擇培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)染的動(dòng)物細(xì)胞而獲得穩(wěn)定細(xì)胞系，表達(dá)載體上的目的基因整合到細(xì)胞的基因組DNA中。穩(wěn)定細(xì)胞系可以持續(xù)表達(dá)目的基因。病毒載體介導(dǎo)的基因治療過程利用病毒載體將目的基因?qū)氚屑?xì)胞，使目的基因的產(chǎn)物補(bǔ)償或替代有缺陷基因的功能。造血細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、肝細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、皮膚成纖維細(xì)胞等可作為靶細(xì)胞限制性內(nèi)切酶和修飾酶(Restrictionendonucleases

andmodifyingenzymes)一類存在于細(xì)菌中的核酸內(nèi)切酶，它們識(shí)別雙鏈DNA分子上特異的核苷酸序列，并對DNA分子進(jìn)行剪切。限制性：細(xì)菌的DNA甲基化酶可對限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列中的堿基進(jìn)行甲基化修飾，因此，細(xì)菌DNA不被限制性內(nèi)切酶剪切，而外源DNA分子被限制性內(nèi)切酶所剪切。內(nèi)切酶：是指酶切位點(diǎn)在DNA分子內(nèi)，而不是兩端。限制性內(nèi)切酶(一)限制性內(nèi)切酶的分類回文結(jié)構(gòu)

(palindrome)是雙鏈DNA分子中的反向重復(fù)結(jié)構(gòu)，即每條鏈從5’

3’方向讀其核苷酸序列都相同。

5’GGATCC3’ 3’CCTAGG5’ 5’AGATCT3’ 3’TCTAGA5’ 5’CCCGGG3’ 3’GGGCCC5’1.命名屬名(genus)的第一個(gè)字母，用大寫表示；種名(species)的前兩個(gè)字母，用小寫表示；細(xì)菌株名(strain)，用大寫或小寫表示；同一細(xì)菌株中不同的限制性內(nèi)切酶被發(fā)現(xiàn)和分離的順序，用羅馬字表示。(二)類型II限制性內(nèi)切酶EcoRIE=Escherichia屬co=coli種R=RY13株I=第1個(gè)被分離的限制性內(nèi)切酶2.識(shí)別序列(1)

具有回文結(jié)構(gòu)

BamHI 5’GGATCC3’ 3’CCTAGG5’

KpnI 5’GGTACC3’ 3’CCATGG5’(2)

具有間斷的回文結(jié)構(gòu)

HinfI(XmnI) 5’GANTC3’ 3’CTNAG5’(3)

具有簡并性堿基

HincII 5’GT(T/C)(A/G)AC3’ 3’CA(A/G)(T/C)TG5’(4)

無回文結(jié)構(gòu)

MboII 5’GAAGA(N)83’ 3’CTTCT(N)75’酶切位點(diǎn)識(shí)別序列(回文結(jié)構(gòu))DNA片段1DNA片段23.經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后所產(chǎn)生的末端類型(1)粘性末端(stickyends,cohesiveends)5’凸端粘性末端EcoRI3’凸端粘性末端(2)平端或鈍端(bluntends)異源同工酶(Isoschizomer)

來源于不同細(xì)菌但具有相同識(shí)別序列的限制性內(nèi)切酶為異源同工酶。識(shí)別序列和酶切位點(diǎn)均相同的限制性內(nèi)切酶

識(shí)別序列相同但酶切位點(diǎn)不同的限制性內(nèi)切酶酶活性單位 在37

C(某些限制性內(nèi)切酶在

25

C或50

C)條件下，每小時(shí)酶切1

gDNA所用的酶量為１個(gè)單位(Unit)。限制性內(nèi)切酶緩沖液

NaCl,KCl:提供正確的離子強(qiáng)度

Tris-HCl:提供合適的pH環(huán)境

Mg2+:限制性內(nèi)切酶的輔助因子

DTT:還原劑

BSA:保護(hù)限制性內(nèi)切酶5.類型II限制性內(nèi)切酶的反應(yīng)條件T4DNA連接酶(T4

DNAligase)堿性磷酸酶(Alkalinephosphatase)DNA聚合酶I大片段

(Klenow)T4DNA聚合酶(T4DNApolymerase)T7DNA聚合酶(T7DNApolymerase)TaqDNA聚合酶(TaqDNApolymerase)逆轉(zhuǎn)錄酶(Reversetranscriptase)末端脫氧多核苷酸轉(zhuǎn)移酶(Terminaldeoxynucleotidyl

transferase)多核苷酸激酶(Polynucleotidekinase)DNA核酸酶I(DNAnucleaseI)S1核酸酶(S1nuclease)外切核酸酶III(ExonucleaseIII)

外切核酸酶(Exonuclease)修飾酶核酸的制備(PreparationofNucleicAcids)核酸的制備基因組DNA的制備總RNA的制備質(zhì)粒DNA的制備苯酚及氯仿可使蛋白質(zhì)變性，用于純化核酸。用Tris-HCl(pH8.0)飽和酚去除DNA溶液中的蛋白質(zhì)；用Tris-HCl(pH6.7)飽和酚去除RNA溶液中的蛋白質(zhì)酚:氯仿:異戊醇＝25:24:1

酚:氯仿＝1:1核酸的分離與純化鹽離子可中和核酸分子上的磷酸根；

2.5倍體積的乙醇或0.9-1倍體積的異丙醇使核酸沉淀；在12000xg離心力作用下，促進(jìn)核酸沉淀。核酸的濃縮用于沉淀核酸的鹽溶液注：需用70％乙醇洗滌核酸沉淀以除去鹽離子。鹽類儲(chǔ)存液(M)終濃度(M)醋酸鈉3.00.3醋酸銨10.02.0-2.5氯化鋰8.00.8氯化鈉5.00.2

建立基因組文庫；

克隆特定的基因；

用Southern印跡檢測某一基因的存在和拷貝數(shù)；

用PCR反應(yīng)檢測基因的存在及突變等；

進(jìn)行DNA指紋分析從細(xì)胞或組織中提取的基因組DNA的目的：基因組DNA

的制備(1)細(xì)胞裂解蛋白酶K和SDS可破壞細(xì)胞膜及細(xì)胞中的蛋白質(zhì)，使基因組DNA從破碎的細(xì)胞中釋放出來。(2)蛋白質(zhì)淬取用酚/氯仿/異戊醇(25/24/1)淬取蛋白質(zhì)。(3)基因組DNA沉淀用0.1倍體積的3MNaAC

和2.5倍體積的100%乙醇沉淀DNA,用

70%乙醇除去DNA沉淀中的鹽離子。(4)將基因組DNA溶解在TE緩沖液中，使其終濃度為~1mg/ml，置4

C保存?；蚪MDNA的制備方法哺乳動(dòng)物基因組DNA1,6.DNA/HindIII;2,3.大鼠基因組DNA；4,5.小鼠基因組DNA基因組DNA的檢測細(xì)菌基因組DNA1.1KbPlusDNALadder;2,3.M.sm

基因組DNA123123456高純度DNA：OD260/OD280>1.7

純化mRNA；

建立cDNA文庫；

克隆特定的cDNA；

用Northern印跡方法檢測某一特定基因的表達(dá)；

用RT-PCR方法檢測某一特定基因的表達(dá)。從組織或細(xì)胞中提取總RNA的目的：總RNA

的制備異硫氰酸胍和十二烷基肌氨酸鈉為強(qiáng)烈的蛋白質(zhì)變性劑，能迅速溶解蛋白質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，使總RNA從細(xì)胞中釋放出來。異硫氰酸胍法制備總RNA用TRIzol

試劑(Invitrogen

公司)處理細(xì)胞或勻漿組織氯仿萃取蛋白質(zhì)沉淀RNA洗滌RNA沉淀用RNase-freeddH2O溶解RNA，并置-20

C保存

異硫氰酸胍和

-巰基乙醇等還原劑使內(nèi)源性

RNase

變性失活,防止RNA被降解。

焦碳二乙酯(DEPC)使外源性

RNase

變性并失活。用0.1%DEPC配制緩沖液，然后高壓滅菌除去DEPC。用0.1%DEPC處理EP管、Tip頭。置玻璃器皿于180

C烤箱中烘烤４小時(shí)。

去除RNA酶(RNase)的方法

注意：DEPC是潛在的致癌劑，須小心操作。RNA的檢測用瓊脂糖凝膠電泳檢測rRNA，確定總RNA的質(zhì)量。物種rRNA大小(kb)人類18S1.928S5.0小鼠18S1.928S4.7果蠅18S2.228S2.8大腸桿菌16S1.523S2.9RNAMarkers(0.28-6.58kb);2.小鼠腦組織中的總RNA;3.大鼠腦組織中的總RNA123RNAMarkers(0.5-9.0kb);2.大腸桿菌總RNA18SrRNA28SrRNA16SrRNA23SrRNA1.5kb3.0kb6.58kb4.98kb121.90kb1