第11章-臨床免疫學檢驗儀器與技術

第十一章

臨床免疫學檢驗儀器與技術

施新明目錄第一節(jié)免疫熒光分析儀器與技術第二節(jié)散射比濁分析儀器與技術第三節(jié)

酶免疫分析儀器與技術第四節(jié)化學發(fā)光免疫分析儀器與技術第五節(jié)自動化免疫分析儀的臨床應用

重點提示1.自動免疫熒光染色的技術原理是什么？2.時間分辨熒光免疫分析儀的基本原理和性能特點是什么？3.散射比濁儀器的分類和原理是什么？4.比濁法檢測抗原過剩的方法有哪些？5.酶聯(lián)免疫分析技術的原理是什么？6.化學發(fā)光酶免疫分析的技術原理是什么？7.吖啶酯化學發(fā)光免疫分析技術的原理是什么？8.電化學發(fā)光免疫分析技術的原理和特點是什么？9.光激化學發(fā)光免疫分析技術的原理是什么？第一節(jié)免疫熒光分析儀器與技術一、免疫熒光染色儀器與技術（一）免疫熒光染色技術原理將熒光素標記在抗體上，免疫反應結束后使用特定波長的激發(fā)光照射標記的熒光素，熒光素吸收激發(fā)光的能量，產生可見的熒光。一、免疫熒光染色儀器與技術（二）免疫熒光染色相關儀器1.免疫熒光染色自動操作儀

用于自動化完成血清稀釋、加樣、溫育、清洗等檢測過程。基本結構包含加樣系統(tǒng)、清洗系統(tǒng)、溫育系統(tǒng)、機械臂和軟件系統(tǒng)等。1.條形碼掃描器2.樣品軌架3.樣品針清洗站4.清洗站5.清洗機頭6.載片托盤7.試劑架8.用于初始稀釋的稀釋板9.用于系列稀釋的稀釋板一、免疫熒光染色儀器與技術（二）免疫熒光染色相關儀器1.免疫熒光染色自動操作儀

加樣系統(tǒng)由樣品針和清洗站、樣品軌架和試劑架等構成；清洗系統(tǒng)包括儲液桶、清洗站、清洗機頭、廢液排除管路等部件；溫育系統(tǒng)包括恒溫器，孵育蓋等；機械臂用于移動樣品針、清洗機；特點：①能夠替代手工操作，降低操作者的工作強度；②使免疫熒光染色過程標準化，減少人為操作誤差；③清洗充分，減少非特異性的干擾。一、免疫熒光染色儀器與技術（二）免疫熒光染色相關儀器2.全自動免疫熒光判讀系統(tǒng)（1）技術原理：

DAPI染色使熒光顯微鏡能夠定位細胞；拍攝FITC染色的熒光圖像；智能數(shù)字熒光圖像識別軟件進行熒光模型的判讀。一、免疫熒光染色儀器與技術（二）免疫熒光染色相關儀器2.全自動免疫熒光判讀系統(tǒng)熒光強度判讀：軟件自動分析熒光圖片中的每個像素點的熒光強度，根據(jù)熒光強度的數(shù)值來判讀熒光結果。熒光模型的判讀：①模式識別原理計算機系統(tǒng)將圖形轉化為數(shù)字參數(shù)，與數(shù)據(jù)庫中存儲的大量數(shù)據(jù)比對，判讀熒光模型。需要計算能力強大的計算機；有學習能力，識別能力會隨數(shù)據(jù)庫內數(shù)據(jù)的累積而提高。一、免疫熒光染色儀器與技術②圖形識別算法原理；軟件系統(tǒng)對陽性結果模擬合成一張三維全息圖，測定三維圖的峰和谷，轉換成數(shù)值信息，與軟件中設定的條件進行匹配，所需設備簡單。一、免疫熒光染色儀器與技術（2）基本結構：主要由全自動熒光顯微鏡、成像系統(tǒng)、機械與控制系統(tǒng)、計算機和軟件系統(tǒng)組成。1、自動熒光顯微鏡；2、冷CCD攝像頭；3、計算機；4、熒光準直儀；5、顯微鏡控制器；6、LED熒光光源發(fā)生器二、時間分辨免疫熒光分析儀器與技術（一）時間分辨免疫熒光分析技術原理鑭系元素的熒光壽命比非特異性熒光長，利用這一特點，使用鑭系三價稀土離子及其螯合物作為標記物標記抗體（或抗原）進行免疫反應，待反應體系中血清、溶劑和其他成分的短壽命背景熒光完全衰變后，再測量鑭系元素的特異性熒光，以有效地降低本底熒光的干擾。這種技術稱時間分辨熒光免疫分析（TRFIA）。二、時間分辨免疫熒光分析儀器與技術（一）時間分辨免疫熒光分析技術原理1.解離增強鑭系元素熒光免疫分析增強液可使鑭系元素形成具有高強度熒光的穩(wěn)定螯合物。增強液使Eu3+標記的抗體抗原復合物pH降至2～3，有利于Eu3+從復合物上完全解離下來。游離的Eu3+被増強液中的螯合劑所螯合、再與增強液中的β-二酮體生成一個Eu3+在其內部的保護性膠態(tài)分子團。新生成的螯合物在紫外光激發(fā)下能發(fā)射出很強的熒光，信號的增強效果可達上百萬倍。2.FIAgen分析系統(tǒng)

用雙功能螯合劑4,7-二（氯磺?；┍交?1,10-菲咯啉-2,9-二羧酸，并把生物素-親和素系統(tǒng)引入TRFIA系統(tǒng)。二、時間分辨免疫熒光分析儀器與技術（一）時間分辨免疫熒光分析技術原理3.酶放大TRFIA采用堿性磷酸酶水解5-氟水楊酸磷酸酯，生成5-氟水楊酸，在堿性條件下5-氟水楊酸可與鑭系元素（Tb3+）和乙二胺四乙酸形成強熒光絡合物，在激發(fā)光源激發(fā)下產生熒光。4.均相TRFA系統(tǒng)

利用三聯(lián)吡啶類化合物將鑭系元素（Eu3+）和別藻藍蛋白連接，組成能量轉移效率最高的能量供體和受體對，測量前不必分離結合標記物和游離標記物，可以用雙波長時間分辨免疫熒光分析儀直接測定固相熒光。二、時間分辨免疫熒光分析儀器與技術（二）時間分辨免疫熒光分析儀的基本結構二、時間分辨免疫熒光分析儀器與技術（三）時間分辨免疫熒光分析儀的性能特點1.靈敏度高，檢測下限可以達到10-18mol/L；分析范圍寬，可達4～5個數(shù)量級。2.標記結合物穩(wěn)定，有效使用期長。3.特異性強。4.測量快速，易于自動化，無放射污染。5.不足之處是易受環(huán)境、試劑和容器中的鑭系元素離子的污染，使檢測本底增高。第二節(jié)散射比濁分析儀器與技術一、散射比濁法技術原理液相的免疫沉淀反應和散射光譜原理相結合而形成的免疫分析技術。可溶性抗原、抗體在液相中特異結合，形成免疫復合物從而引起液體濁度的改變，利用散射光譜分析技術測定濁度變化而得知待測抗原的濃度。二、散射比濁技術的分類（一）終點散射比濁法抗原和抗體反應達到平衡，免疫復合物形成的量不再增加，反應體系的濁度不再變化時，可以認為是免疫反應結束。特點：反應過程時間較長，抗體復合物易聚合形成大顆粒沉淀，導致偏低的結果，標本內抗原含量較低時，敏感性不夠。主流的散射比濁儀器通常不采用終點散射比濁法。二、散射比濁技術的分類（二）定時散射比濁法由終點散射比濁法改進而成。反應分預反應階段和反應階段。預反應階段用于保證抗原抗體比例合適，避免產生的鉤狀效應。反應階段抗原、抗體反應形成不可溶性小分子顆粒，產生的散射光信號，這種信號與待測的抗原量成正比。二、散射比濁技術的分類（三）速率散射比濁法速率散射比濁法是一種抗原抗體結合的動力學測定方法。速率是在單位時間內抗原、抗體結合形成復合物的速度?？乖?、抗體結合速率最大的某一時刻稱為速率峰，當反應體系的抗體過量時，速率峰的高低與抗原含量成正比。速率散射比濁法動態(tài)地測定單位時間內抗原-抗體復合物形成的散射光信號，從而獲得多個速率峰，峰值的高低與待測物質（抗原）的量成正比。當儀器測定到某一時間內形成速率下降時，所出現(xiàn)速率峰的峰值高低代表所測抗原的量。速率散射比濁法具有檢測速度快、敏感性高、精確度高、穩(wěn)定性好的優(yōu)點。二、散射比濁技術的分類（三）速率散射比濁法二、散射比濁技術的分類（四）乳膠增強免疫比濁法選擇一種大小適中、均勻一致的乳膠顆粒，吸附或交聯(lián)抗體，在液相狀態(tài)下，單個乳膠顆粒在入射光波長內光線可透過，使透過光增加，散射光量減少；當結合了膠乳顆粒的抗體遇到相應抗原發(fā)生聚集時，則使透過光減少，散射光增加，散射光的增加程度與膠乳凝集成正比，也與抗原量成正比?？贵w吸附于乳膠顆粒表面可以增加免疫反應復合物的直徑，從而增強散射光強度，達到提高散射比濁法檢測靈敏度的目的（檢測水平可達到ng/ml或pg/ml）?；趩慰寺】贵w膠乳免疫比濁技術的定量分析是比濁分析技術的發(fā)展方向。三、定時散射比濁分析儀的基本結構與性能（一）基本結構BNⅡ散射免疫比濁分析儀由分析儀主機、計算機、鍵盤、打印機、條形碼掃描儀等組成。主要結構包括加樣系統(tǒng)，孵育轉盤、光路系統(tǒng)和液路系統(tǒng)等。三、定時散射比濁分析儀的基本結構與性能（二）性能特點以定時散射比濁分析法為原理。比濁儀檢測器與光路呈13°～24°角測量散射光。使用乳膠顆粒增強技術，提高檢測的靈敏度。采用預先反應程序，防止抗原過剩。非特異性反應的排除通過測定反應管起始值和空白值之間的差異，排除樣本由于內源性濁度或其有快速反應特性所帶來的非特異性干擾。四、速率散射比濁分析儀的基本結構與性能（一）基本結構IMMAGE800速率散射免疫比濁分析儀由分析儀、計算機、打印機三部分組成。分析儀包括濁度儀、加樣系統(tǒng)、試劑和樣品轉盤、清洗工作站等。四、速率散射比濁分析儀的基本結構與性能（二）性能特點用雙光徑系統(tǒng)設計，組合應用散射比濁法和透射比濁法兩種技術，以及速率散射比濁法、速率抑制散射比濁法、近紅外顆粒速率透射法、近紅外顆粒速率抑制透射法四種方法，分別檢測大、中、小分子。①LED光源（透射比濁）；②激光光源（散射比濁）；③聚焦鏡頭；④分光棱鏡；⑤反應杯；⑥散射比濁檢測儀；⑦激光反射；⑧透射比濁檢測儀四、速率散射比濁分析儀的基本結構與性能（二）性能特點1.采用速率檢測法實現(xiàn)，排除干擾信號，提高準確度。2.抗原過量自動監(jiān)測

在抗體與抗原反應過程完成時，再加入已知相應抗原到反應體系中；如果新增的抗原可與過量的抗體結合反應，則產生新的速率峰，由此證明抗體過量，待測的抗原免疫反應完全；若新加入抗原后不出現(xiàn)新的速率峰，則說明反應體系中抗體不足，存在抗原過量，需將待測樣品進一步稀釋復測。3.全程動力學空白對照，排除非特異性的干擾，確保檢測結果的可靠性。五、散射比濁分析儀的性能要求1.靈敏度

2.精密度

3.準確度

4.攜帶污染

5.溫度準確度與波動度

6.樣品和試劑加樣準確度與重復性

第三節(jié)酶免疫分析儀器與技術一、酶聯(lián)免疫吸附試驗（一）酶聯(lián)免疫吸附試驗的原理酶標記固相免疫分析技術?？贵w、抗原進行免疫反應后，標記的酶水解反應底物而使之顯色。顯色程度與其濃度成一定關系，能對抗原（或抗體）進行定性或定量。一、酶聯(lián)免疫吸附試驗（二）酶聯(lián)免疫吸附試驗技術常用酶與底物常用酶作用底物顯色辣根過氧化物酶，HRP鄰苯二胺，OPD四甲基聯(lián)苯胺TMB黃色藍色堿性磷酸酶

，ALP對-硝基苯磷酸酯PNP黃色β-半乳糖苷酶

，

β-Gal4-甲傘酮基-β-D-半乳糖苷葡萄糖氧化酶，GOD對硝基氮藍四唑藍色二、酶標儀（一）酶標儀的基本原理與結構基本工作原理和主要結構與光電比色計基本相同。相當于專用于ELISA的光電比色計或分光光度計。二、酶標儀（二）酶標儀的性能要求酶標儀計量性能評價要求包括：外觀檢查、示值穩(wěn)定性、波長示值誤差、波長重復性、吸光度示值誤差、吸光度重復性、靈敏度、通道差異、絕緣電阻9項。與檢測性能相關的有7項。示值穩(wěn)定性要求在±0.005；波長示值誤差±3nm；波長重復性±1.5nm；吸光度示值誤差±0.03；吸光度重復性1%；靈敏度≥0.01L/mg；通道差異0.03。三、全自動酶免疫分析系統(tǒng)（一）全自動酶免疫分析系統(tǒng)的基本結構全自動酶免疫分析系統(tǒng)是具有自動加樣本、加試劑，自動控溫溫育，自動洗板和自動判讀計算等功能的分析系統(tǒng)?？捎糜诟鞣N酶免疫實驗、血庫篩查、生化檢測、細胞培養(yǎng)、分子生物學等各個方面。三、全自動酶免疫分析系統(tǒng)（二）全自動酶免疫分析系統(tǒng)的特點1．加樣系統(tǒng)加樣系統(tǒng)用于樣本和試劑的分配加樣系統(tǒng)永久性加樣針采用一次性吸頭三、全自動酶免疫分析系統(tǒng)（二）全自動酶免疫分析系統(tǒng)的特點2．溫控孵育系統(tǒng)提供在孵育時酶標板所需溫度，防止蒸發(fā)，并可振蕩孵育，可使免疫反應更加充分，提高檢測靈敏度。3．洗滌工作站

洗滌工作站主要用于洗滌加樣針和反應板。4．酶標儀洗板機酶標儀第四節(jié)化學發(fā)光免疫分析儀器與技術一、化學發(fā)光免疫分析技術原理與分類（一）化學發(fā)光免疫分析技術原理化學發(fā)光的原理在化學反應過程中，發(fā)光劑吸收化學能后，從穩(wěn)定的基態(tài)分子被激發(fā)到不穩(wěn)定的激發(fā)態(tài)，在激發(fā)態(tài)時分子有很高并且不穩(wěn)定的能量，釋放能量重新回到基態(tài)，能量以光子形式釋放。一、化學發(fā)光免疫分析技術原理與分類（一）化學發(fā)光免疫分析技術原理2.化學發(fā)光免疫分析的原理通過免疫反應特異性地將待測組分從樣本中分離，再通過化學發(fā)光反應顯示分離的組分，并且化學發(fā)光的反應強度與待測組分的含量成一定的比例關系。一、化學發(fā)光免疫分析技術原理與分類（二）化學發(fā)光免疫分析技術的分類化學發(fā)光酶免疫測定將酶標記于示蹤抗體上，再以酶催化底物進行化學發(fā)光反應。常用的工具酶有：辣根過氧化物酶（HRP）常用的底物有魯米諾或其衍生物異魯米諾，在HRP和啟動發(fā)光試劑（NaOH和H2O2）作用下進行發(fā)光反應，其波長為425nm。是一類重要的發(fā)光試劑。堿性磷酸酶（ALP），常用的底物是AMPPD，ALP水解AMPPD，產生金剛烷酮和產生470nm的光，可持續(xù)幾十分鐘。一、化學發(fā)光免疫分析技術原理與分類（二）化學發(fā)光免疫分析技術的分類2.化學發(fā)光免疫測定用化學發(fā)光劑直接標記抗原或抗體的免疫分析方法。常用標記的化學發(fā)光物質有吖啶酯類化合物，通過啟動發(fā)光試劑（NaOH和H2O2）作用而發(fā)光，強烈的直接發(fā)光在一秒內完成，為快速的閃爍發(fā)光。特點：化學反應簡單、快速、無需催化劑；檢測小分子抗原時一般采用競爭法，大分子抗原則大多采用夾心法。非特異性結合少、本底低；檢測大分子靈敏度高。一、化學發(fā)光免疫分析技術原理與分類（二）化學發(fā)光免疫分析技術的分類3.電化學發(fā)光免疫測定反應體系中含有三聯(lián)吡啶釕[Ru（bpy）3]2+，再加入含三丙胺（TPA）的緩沖液，電極加電壓，使二價釕被氧化成三價，TPA被氧化形成強還原劑，形成激發(fā)態(tài)的釕，激發(fā)態(tài)的三聯(lián)吡啶釕不穩(wěn)定，發(fā)射出一個波長620nm的光子，重新生成基態(tài)的釕，發(fā)光標記物可循環(huán)發(fā)光。一、化學發(fā)光免疫分析技術原理與分類（二）化學發(fā)光免疫分析技術的分類4.光激化學發(fā)光免疫分析技術競爭法光激化學發(fā)光原理抗體包被感光微球，抗原包被發(fā)光微球，抗體與抗原結合，感光微球在680nm激發(fā)光照射下，產生單線態(tài)氧擴散至發(fā)光微球并傳遞能量，發(fā)光微球發(fā)射520～620nm熒光信號。單線態(tài)氧的半衰期只有4微秒（μs），在反應體系中只能擴散大約200nm。發(fā)光的量與樣品中的待測抗原量成反比。一、化學發(fā)光免疫分析技術原理與分類（三）順磁性顆粒分離技術順磁顆粒的核心為氧化鐵，表面包有高分子化合物。特點：順磁性：指有些固體的原子具有本征磁矩。當受外磁場作用時，表現(xiàn)出宏觀磁性。沒有外加磁場時，顆粒間沒有相互作用，能夠在液體中形成均勻的懸液。大比表面積：表面功能基團密度及選擇性吸附能力變大，生物相容性：多數(shù)生物高分子如多聚糖、蛋白質等具有良好的生物相容性。功能基團特性：能與生物高分子的多種活性基團共價連接，可在其表面穩(wěn)定地固定生物活性物質。二、化學發(fā)光免疫分析儀器的基本結構與性能要求（一）化學發(fā)光免疫分析儀器的基本結構及其作用1.控制系統(tǒng)分析儀器的大腦，通常由軟件系統(tǒng)和硬件系統(tǒng)組成。2.取樣系統(tǒng)取樣系統(tǒng)能夠自動將樣本和試劑定量加入反應管中。二、化學發(fā)光免疫分析儀器的基本結構與性能要求（一）化學發(fā)光免疫分析儀器的基本結構及其作用3.反應孵育系統(tǒng)提供合適環(huán)境溫度以便進行免疫反應。4.清洗系統(tǒng)用以去除化學發(fā)光反應所不需要的游離相。二、化學發(fā)光免疫分析儀器的基本結構與性能要求（一）化學發(fā)光免疫分析儀器的基本結構及其作用5.測量系統(tǒng)化學發(fā)光反應產生的光信號通過光電倍增管進行測量，最后換算出相對發(fā)光單位（RLU）。6.試劑和消耗品系統(tǒng)保存試劑和消耗品，并維持合適的溫度環(huán)境。二、化學發(fā)光免疫分析儀器的基本結構與性能要求（二）化學發(fā)光分析儀器的性能要求反應區(qū)溫度控制的準確性

應在設定值的±0.5℃內，波動度不超過±1.0℃。2.分析儀器的穩(wěn)定性

分析儀開機處于穩(wěn)定工作狀態(tài)后第4小時、第8小時的測試結果與處于穩(wěn)定工作狀態(tài)初始時的測試結果的相對偏倚不超過±10％。3.批內測量重復性

CV≤8%。4.線性相關性

在不小于2個數(shù)量級的濃度范圍內，線性相關系數(shù)（r）≥0.994。二、化學發(fā)光免疫分析儀器的基本結構與性能要求（二）化學發(fā)光分析儀器的性能要求5.攜帶污染率

應≤10-5。6.分析儀應具備的主要功能

①用戶可以通過人機對話指令，使儀器能自動完成不同樣品、測試項目的分析任務；②儀器應能提示試劑等消耗品、廢棄物的狀態(tài)；③儀器具備自檢功能；④儀器對操作錯誤、機械及電路故障應有相應提示。二、化學發(fā)光免疫分析儀器的基本結構與性能要求（三）臨床常用化學發(fā)光分析儀器的主要特點1．ACCESS2全自動免疫分析系統(tǒng)堿性磷酸酶標記，AMPPD作為發(fā)光底物，是典型的化學發(fā)光酶免疫反應。采用超細磁性微粒子技術，微粒子直徑＜7μm；采用超聲波清洗分離技術，清洗效率高，交叉污染率；直接穿刺式試劑盒，防止試劑揮發(fā)而濃縮。二、化學發(fā)光免疫分析儀器的基本結構與性能要求（三）臨床常用化學發(fā)光分析儀器的主要特點2．ARCHITECTi2000SR全自動免疫分析系統(tǒng)采用的是吖啶酯衍生物直接標記的化學發(fā)光免疫分析技術。采用的啶酯類衍生物增加了親水基團，改善了吖啶酯化合物的水溶性，保證實驗結果的可靠。RSH軌道處理系統(tǒng)采用人工智能機械臂樣本傳輸軌道系統(tǒng)，提高了實驗效率。二、化學發(fā)光免疫分析儀器的基本結構與性能要求（三）臨床常用化學發(fā)光分析儀器的主要特點3．cobase系列電化學發(fā)光免疫分析系統(tǒng)采用電化學發(fā)光免疫分析原理，具有較高的靈敏度、較寬的檢測范圍和較快的檢測速度。使用一次性加樣頭，避免交叉污染。采用模塊化組合結構，可與生化分析儀器模塊，組成生化免疫一體化儀器。第五節(jié)自動化免疫分析儀的臨床應用自動化免疫分析儀的臨床應用一、免疫熒光染色技術的應用常用于自身抗體檢測，用于輔助診斷自身免疫性疾病。此技術還可用于免疫病理檢測。也可用于淋巴細胞表面CD抗原、抗原受體、補體受體、Fc受體等膜分子的檢測。二、時間分辨免疫熒光分析儀的應用適用于大、中、小分子的檢測，可用于蛋白質、激素、藥物、腫瘤標志物、抗原/抗體等。三、散射免疫比濁分析儀的應用散射免疫比濁分析儀目前在臨床上主要用于蛋白質測定。自動化免疫分析儀的臨床應用四、酶免疫分析儀器的應用全自動的酶免疫分析系統(tǒng)作為實驗室常