DB32T 1772-2011 副豬嗜血桿菌病診斷技術(shù)　

ICS65.020.30備案號(hào)：DB32DiagnosticTechniquesforHaemop江蘇省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布DB32/T1772—2011為規(guī)范副豬嗜血桿菌病的診斷技術(shù)，特制定本標(biāo)準(zhǔn)。本標(biāo)準(zhǔn)按GB/T1.1—2009《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫》編制。本標(biāo)準(zhǔn)由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提出。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院。本標(biāo)準(zhǔn)起草人：劉茂軍、邵國(guó)青、周勇岐、王海燕、馮志新、孫佩元、甘源。1DB32/T1772—2011副豬嗜血桿菌病診斷技術(shù)本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了副豬嗜血桿菌病診斷技術(shù)要求。本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的分離鑒定和PCR法適用于本病的確診，間接血凝試驗(yàn)適用于大批量樣品的普查。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修訂單）適用于本文件。GB16548病害動(dòng)物和病害動(dòng)物產(chǎn)品生物安全處理規(guī)程GB/T6682—2008分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法NY/T541動(dòng)物疫病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)采樣方法3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1副豬嗜血桿菌病副豬嗜血桿菌病，又稱格拉澤氏病或革拉澤氏病(Glasser’sdisease)，該病由副豬嗜血桿菌（Haemophilusparasuis,HPs）引起，可以影響各年齡段豬，主要在斷奶前后和保育階段發(fā)病，通常見于5～8周齡的豬，表現(xiàn)為豬的纖維性多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎、胸膜炎和腦膜炎等。4診斷據(jù)流行病學(xué)、臨床癥狀和特征病變可作出初步診斷，典型病變PCR檢測(cè)病原可確診。4.1流行性病學(xué)診斷副豬嗜血桿菌只感染豬，感染2周齡到4月齡的青年豬，主要在斷奶前后和保育階段發(fā)病，通常見于5周齡～8周齡的豬，發(fā)病率一般在10%～15%，嚴(yán)重時(shí)死亡率可達(dá)到50%。在敏感豬群內(nèi)，副豬嗜血桿菌引起的死亡主要發(fā)生在幼豬。4.2臨床診斷由副豬嗜血桿菌引起的急性型疾病是非特異性的但卻是特征性的，臨床癥狀包括發(fā)熱、食欲不振和厭食，嚴(yán)重時(shí)可見呼吸困難、發(fā)紺、不愿活動(dòng)、關(guān)節(jié)腫脹、跛行、運(yùn)動(dòng)不協(xié)調(diào)以及死亡。急性發(fā)病耐過豬可以痊愈,但病癥嚴(yán)重，豬耐過后往往表現(xiàn)慢性病癥，主要是被毛粗亂、咳嗽、呼吸困難和生長(zhǎng)遲滯。有些豬由于發(fā)生腦膜炎而表現(xiàn)肌肉震顫、麻痹和驚厥，有些因腹膜粘連而常引起腸2DB32/T1772—20114.3病理變化肉眼可見的損傷主要是在單個(gè)或多個(gè)漿膜面，可見漿液性和化膿性纖維蛋白滲出物，這些漿膜包括腹膜，心包膜和胸膜，這些損傷也可能涉及腦膜和關(guān)節(jié)表面，尤其是腕關(guān)節(jié)和跗關(guān)節(jié)。胸腹腔積液或粘連，關(guān)節(jié)腫脹、關(guān)節(jié)腔粘液增多，肺臟出血、表面有纖維素性滲出物附著，全身淋巴結(jié)水腫、出血。在顯微鏡下觀察滲出物，可見纖維蛋白，中性粒細(xì)胞和較少量的巨噬細(xì)胞。病死豬及病料應(yīng)符合按GB16548的規(guī)定。5病原學(xué)診斷除另有規(guī)定，所用試劑均為分析純，水為符合GB/T6682—2008的滅菌二級(jí)水。5.1病原分離與鑒定5.1.1材料準(zhǔn)備巧克力瓊脂平板，鮮血瓊脂平板，TSA固體培養(yǎng)基，TSB液體培養(yǎng)基，副豬嗜血桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株，細(xì)菌微量生化鑒定管，滅菌棉拭子等。5.1.2病料采集按NY/T541規(guī)定的方法，采集呼吸道分泌物，采取具有特征的肺臟、肝臟、脾臟、胸膜、胸腹腔積水、心包積液、心血、關(guān)節(jié)液和腦組織。5.1.3病原分離采集樣品，首先在巧克力瓊脂平板、TSA固體培養(yǎng)基、鮮血瓊脂平板上分別劃線接種，37℃培養(yǎng)48h～72h以后挑取單個(gè)菌落，再進(jìn)行純培養(yǎng)并鑒定。細(xì)菌涂片，革蘭氏染色鏡檢。如果為革蘭氏陰性小桿狀或多形性小桿菌，再進(jìn)行一次巧克力瓊脂亞克隆培養(yǎng)，同時(shí)接種鮮血瓊脂平板和普通瓊脂平板。巧克力瓊脂平板生長(zhǎng)良好，而鮮血瓊脂平板和普通瓊脂平板沒有菌落生成則菌株保存待進(jìn)一步鑒5.1.4病原鑒定5.1.4.1生長(zhǎng)特性試驗(yàn)挑取被檢分離株和副豬嗜血桿菌標(biāo)準(zhǔn)株菌落接種綿羊鮮血瓊脂平板和2%胨瓊脂平板上，再以金黃色葡萄球菌點(diǎn)種或垂直劃線，置37℃培養(yǎng)48h。觀察葡萄球菌菌落周圍菌落生成情況，如愈靠近金黃色葡萄球菌菌落生成的半透明菌落愈大，愈遠(yuǎn)的愈小，甚至不見菌落生長(zhǎng)，且不出現(xiàn)溶血現(xiàn)象判為陽性。5.1.4.2生化實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)物接種于添加有NAD的脲酶、氧化酶、吲哚，接觸酶、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、果糖、核糖、半乳糖、硝酸鹽還原酶等細(xì)菌微量生化鑒定管，置37℃培養(yǎng)48h。按細(xì)菌微量生化鑒定管說明書判定。脲酶試驗(yàn)、氧化酶試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)均陰性，并接觸酶、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、果糖、核糖、半乳糖、硝酸鹽還原試驗(yàn)均陽性者判為副豬嗜血桿菌陽性。5.1.4.3聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）3DB32/T1772—2011按5.2進(jìn)行操作和判定。5.1.5結(jié)果判定以上實(shí)驗(yàn)皆為陽性判為副豬嗜血桿菌。5.2聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）5.2.1材料準(zhǔn)備PCR引物P15`-GTGATGAGGAAGGGTGGTGT-3`和P25`-GGCTTCGTCACCCTCTGT-3`，PCR相關(guān)試劑。副豬嗜血桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA提取物為陽性對(duì)照，水作為陰性對(duì)照。高速離心機(jī)（10000r/min）、PCR儀、電泳儀、水平電泳槽凝膠成像系統(tǒng)（或紫外投射儀）、移液器等儀器。5.2.2DNA模板的制備按NY/T541規(guī)定的方法，采集待檢豬的病料置于-20℃保存。取約1g病料，剪碎后勻漿器加5mL水研磨成糊狀，煮沸10min，高速10000r/min離心5min，取上清-20℃保存?zhèn)溆谩Ａ硗?，按GB16548規(guī)定處理待檢豬。取可疑培養(yǎng)物10000r/min離心5min，棄上清，沉淀以無菌水重懸，煮沸10min，高速10000r/min離心5min，取上清-20℃保存?zhèn)溆谩７蛛x純化的菌株用接種環(huán)刮取2個(gè)菌落洗脫于含100μL無菌水的離心管，煮沸10min，高速10000r/min離心5min，取上清-20℃保存?zhèn)溆谩?.2.3PCRPCR反應(yīng)體系：10×PCRBuffer2.5μL，Mg2+（25mM）1.3μL，P1（20pmol/μL）1.0μL，P2（20pmol/μL）1.0μL，dNTPs（2.5mM）2.0μL，TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.5μL，模板2μL～5μL，加ddH2O至總體積25μL。反應(yīng)條件：94℃5min，94℃30s，59℃30s，72℃45s，34個(gè)循環(huán)，72℃10min。5.2.4電泳制備1%瓊脂糖凝膠，內(nèi)加適量溴化乙錠或其替代物，取PCR產(chǎn)物10μL～20μL分別與適量加樣緩沖液混合后，加樣到鳥叫孔中，9V/cm恒壓下電泳15min～30min。將電泳好的凝膠放到紫外投射儀或凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果。5.2.5結(jié)果判定陽性對(duì)照擴(kuò)增到821bp條帶，同時(shí)陰性對(duì)照為擴(kuò)增到條帶時(shí)，試驗(yàn)成立。在試驗(yàn)結(jié)果成立的前提下，如果樣品擴(kuò)增到821bp條帶，可確認(rèn)為可疑培養(yǎng)物或分離純化的菌株副豬嗜血桿菌PCR陽性。6.1材料準(zhǔn)備6.1.196孔V型（110°)有機(jī)玻璃反應(yīng)板、25μL微量移液器、微量振蕩器等。6.1.2副豬嗜血桿菌純化滅活抗原、副豬嗜血桿菌標(biāo)準(zhǔn)陽性血清、副豬嗜血桿菌標(biāo)準(zhǔn)陰性血清。6.1.3致敏紅細(xì)胞:為副豬嗜血桿菌滅活抗原致敏的綿羊紅細(xì)胞。4DB32/T1772—20116.1.4稀釋劑:含1%健康兔血清pH7.2PBS。6.2操作方法6.2.1血清的處理取被檢血清0.2mL于無菌小試管中，56℃水浴30min滅活，冷卻后加入0.3mL2%戊二醛紅細(xì)胞懸液，搖勻，置37℃水浴3min，離心后吸出血清供檢驗(yàn)用。陽性血清、陰性血清的處理同被檢血清。用微量移液器先向反應(yīng)板每孔中加25μL稀釋劑，再向第1孔加人25μL已處理好的被檢血清，充分混勻后，吸取25μL加入第2孔……，依次做倍比連續(xù)稀釋至第6孔（血清的稀釋倍數(shù)為1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64），混勻后從第6孔取出25μL棄去。向每孔中加入25μL2%致敏紅細(xì)胞，血清的最終稀釋倍數(shù)為1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128。同時(shí)應(yīng)設(shè)陰、陽性血清對(duì)照及致敏紅細(xì)胞空白對(duì)照。置微型振蕩器上震蕩30s后，室溫靜置2h，觀察結(jié)果。6.3結(jié)果判定6.3.1成立條件致敏紅細(xì)胞對(duì)照無自凝現(xiàn)象，陽性對(duì)照血清抗體價(jià)>1:32；陰性對(duì)照血清抗體價(jià)<1:16時(shí)表明試驗(yàn)成立。6.3.2判定標(biāo)準(zhǔn)++++:紅細(xì)胞100%凝集，在孔底凝集濃縮成團(tuán)，面積較大；+++:紅細(xì)胞75%凝集，在孔底形成較厚層凝集，面積較大，卷邊或呈鋸齒狀；++:紅細(xì)胞50%凝集，其余不凝集的紅細(xì)胞在孔底中央集中成較大的圓點(diǎn)；+:紅細(xì)胞25%凝集，不完全沉于孔底，周圍有散在少量的凝集；-:紅細(xì)胞呈點(diǎn)狀沉于孔底，周邊光滑。6.3.3判定被檢血清效價(jià)大于1:32為陽性；低于1:16為陰性；在1:16～1:32之間為可疑。7最終結(jié)論判定下列任何情