基因工程制胰島素(生工版)

2024/12/11用基因工程方法獲得胰島素第四組2024/12/12胰島素是由胰島B細(xì)胞受內(nèi)源性或外源性物質(zhì)如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的一種蛋白質(zhì)激素。胰島素是機體內(nèi)唯一降低血糖的激素,同時促進糖原、脂肪、蛋白質(zhì)合成。外源性胰島素主要用來糖尿病治療。胰島素這類活性蛋白多肽和細(xì)胞因子具有高度生物活性,分子量很大,立體結(jié)構(gòu)異常復(fù)雜,體外難以人工合成。所以過去糖尿病患者只能服用從牛、豬體中提取的胰島素來治療；但牛、豬胰島素結(jié)構(gòu)上與人胰島素有差別,如與豬胰島素B鏈第30個氨基酸殘基不同,長期服用會引起腎和眼的疾病,故必需要用基因工程方法獲得重組人胰島素進行治療。2024/12/13基因工程制胰島素三種方法一、A鏈和B鏈分別表達法化學(xué)合成A鏈和B鏈的編碼序列2024/12/14基因工程制胰島素三種方法一、A鏈和B鏈分別表達法表達產(chǎn)物的后期處理路線:2024/12/15基因工程制胰島素三種方法二、人胰島素原表達法基因工程菌的構(gòu)建戰(zhàn)略:2024/12/16基因工程制胰島素三種方法二、人胰島素原表達法表達產(chǎn)物的后期處理路線:2024/12/17基因工程制胰島素三種方法三、A鏈和B鏈同時表達法2024/12/18方法一:

由于A鏈和B鏈上共存在六個半胱氨酸殘基，體外二硫鍵的正確配對率較低，通常只有10%-20%，因此成本高。

方法二:

胰島素原能形成良好的空間構(gòu)象，三對二硫鍵的正確配對率提高，折疊率高。工藝路線依然繁瑣。

方法三:

需體外折疊。基因工程制胰島素三種方法三種方法比較:2024/12/19基因工程獲取胰島素的步驟一、獲取外源目的基因片段二、選擇與獲取表達載體三、重組目的DNA片段與表達載體四、選擇與獲取表達細(xì)胞五、重組體導(dǎo)入表達細(xì)胞六、對重組體細(xì)胞進行篩選純化鑒定七、工程菌產(chǎn)物鑒定和保存八、發(fā)酵培養(yǎng)2024/12/110一、獲取外源目的基因片段1.選擇實驗材料2.提取RNA，分離RNA3.逆轉(zhuǎn)錄mRNA,得cDNA第一鏈4.得雙鏈DNA5.DNA序列糾錯6.目的基因通過細(xì)胞克隆擴增7.目的基因回收及DNA測序，最終目的基因獲取2024/12/111一、獲取外源目的基因片段1.選擇實驗材料胰島素是一種蛋白質(zhì)類激素，體內(nèi)胰島素是胰島B細(xì)胞（即胰島β細(xì)胞）受內(nèi)源性或外源性物質(zhì)如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的。胰島素基因只有在胰島B細(xì)胞中才能轉(zhuǎn)錄出信使RNA，所以用基因工程方法生產(chǎn)胰島素時，選用胰島B細(xì)胞為獲取目的基因的實驗材料。2024/12/112一、獲取外源目的基因片段2.提取RNA，分離RNA2.1總RNA的提取2.2mRNA的純化2.3mRNA的保存2024/12/113一、獲取外源目的基因片段2.1總RNA的提取總RNA的抽提方法有多種，TRIzol試劑是使用組廣泛的RNA抽提試劑，主要由苯酚和異硫氰酸胍組成，可以迅速破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使存在于細(xì)胞質(zhì)及核內(nèi)的RNA釋放出來，并使核糖體蛋白與RNA分子分離。苯酚雖可有效地變性蛋白質(zhì)，但不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中還加入了8－羥基喹啉、異硫氰酸胍、β-巰基乙醇等來抑制內(nèi)源和外源RNase（RNA酶）。TRIzol是從細(xì)胞和組織中提取總RNA的即用型試劑，在樣品裂解或勻漿過程中，TRIzol能保持RNA完整性。提取RNA時，首先用液氮研磨材料，勻漿，加入TRIzol試劑，進一步破碎細(xì)胞并溶解細(xì)胞成分。然后加入氯仿抽提，離心，分離水相和有機相，收集含有RNA的水相，通過異丙醇沉淀，可獲得比較純的總RNA，用于下一步mRNA的純化。

2024/12/114一、獲取外源目的基因片段2．1．1TRIzol法提取流程（1）樣品處理①培養(yǎng)細(xì)胞:收獲細(xì)胞1-5*10^7，移入1.5ml離心管中，加入1mlTRIzol，混勻，室溫靜置5min。②組織:取50-100mg組織（新鮮或-70℃及液氮中保存的組織均可）置1.5ml離心管中，加入1mlTRIzol充分勻漿，室溫靜置5min。（2）加入0.2ml氯仿，振蕩15s，靜置2min。（3）4℃離心，12000g*15min，取上清液。（4）加入0.5ml異丙醇，將管中液體輕輕混勻，室溫靜置10min。（5）4℃離心，12000g*10min，棄上清液。（6）加入1ml75%乙醇，輕輕洗滌沉淀。4℃，7500g*5min，棄上清液。（7）晾干，加入適量的DEPCH2O溶解（65℃促溶10-15min）。2024/12/115一、獲取外源目的基因片段2.1.1TRIzol法提取流程圖2024/12/116一、獲取外源目的基因片段2.2mRNA的純化該方法利用mRNA

3＇端含有PolyA（多聚腺苷酸）的特點，當(dāng)RNA流經(jīng)寡聚dT纖維素柱時，在高鹽緩沖液的作用下，mRNA被特異性的結(jié)合在柱上，再用低鹽溶液或蒸餾水洗脫mRNA。經(jīng)過兩次寡聚纖維柱后可得到較高純度的mRNA。2024/12/117一、獲取外源目的基因片段2．2．1寡聚（dT）纖維素柱純化mRNA（1）試劑準(zhǔn)備:①3M醋酸鈉（pH5.2）；②0.1MNaOH；③上樣緩沖液:20mMTris-HCl（pH7.6）,0.5MNaCl,1MEDTA(pH8.0),0.1%SLS(十二烷基氨酸鈉)。配制時可先配制Tris-HCl（pH7.6）、NaCl、EDTA（pH8.0）的母液，經(jīng)高壓消毒后按各成分確切含量，經(jīng)混合后再高壓消毒，冷卻至65℃，加入經(jīng)65℃溫育（30min）的10%SLS至終濃度為0.1%；④洗脫緩沖液:10mMTris-HCl（pH7.6），1mMEDTA（pH8.0），0.05%SDS；⑤無水乙醇、70%乙醇；⑥D(zhuǎn)EPC（0.1%焦炭酸二乙酯）2024/12/118一、獲取外源目的基因片段2．2．1寡聚（dT）纖維素柱純化mRNA（2）操作步驟:①將0.5-1.0g寡聚（dT）纖維懸浮于0.1M的NaOH溶液中。②用DEPC處理的1ml注射器或適當(dāng)?shù)募?xì)管，將寡聚（dT）纖維素裝柱0.5-1ml，用3倍柱床體積的DEPCH2O洗柱。③使用1*上樣緩沖液洗柱，直至洗出液pH值小于8.0。④將RNA溶解于DEPCH2O中，在65℃中溫育10min左右，冷卻至室溫后加入等體2*上樣緩沖液，混勻后上柱，立即收集流出液。當(dāng)RNA上樣液全部進入柱床后，再用1*上樣緩沖液洗柱，繼續(xù)收集流出液。⑤將所有流出液于65℃加熱5min，冷卻至室溫后再次上柱，收集流出液。⑥用5-10倍柱床體積的1*上樣緩沖液洗柱，每管1ml分步收集，OD260測定RNA含量。前部分收集管中流出液的OD260值很高，其內(nèi)含物為無polyA尾的RNA。后部分收集管中流出液的OD260值很低或無吸收。⑦用2-3倍柱容積的洗脫緩沖液洗脫poly（A+）RNA，分步收集，每部分為1/3-1/2柱體積。⑧OD260測定poly（A+）RNA分布，合并含poly（A+）RNA的收集管，加入1/10體積3MNaAc（pH5.2）、2.5倍體積的預(yù)冷無水乙醇，混勻，-20℃放置30min。⑨4℃離心，10000g*15min，小心吸棄上清。用70%乙醇洗滌沉淀。4℃離心，10000g*5min，棄上清，室溫晾干。⑩用適量的DEPCH2O溶解RNA。2024/12/119一、獲取外源目的基因片段2.2.1寡聚（dT）纖維素柱純化mRNA（3）注意事項①整個實驗過程必須防止Rnase的污染。②步驟④中將RNA溶液置65℃中溫育然后冷卻至室溫再上樣的目的有兩個，一個是破壞RNA的二級結(jié)構(gòu)，尤其是mRNApoly（A+）尾處的二級結(jié)構(gòu)，使poly（A+）尾充分暴露，從而提高poly（A+）RNA的回收率；另一個目的是能解離mRNA與rRNA的結(jié)合，否則會導(dǎo)致rRNA的污染。所以此步驟不能省略。③十二烷基肌氨酸鈉鹽在18℃以下溶解度下降，會阻礙柱內(nèi)液體流動，若室溫低于18℃最好用LiCl替代NaCl。④寡聚（dT）纖維素柱可在4℃貯存，反復(fù)使用。每次使用前應(yīng)該依次用NaOH、滅菌ddH2O、上樣緩沖液洗柱。⑤一般而言，107哺乳動物培養(yǎng)細(xì)胞能提取1-5μgpoly（A+）RNA，約相當(dāng)于上柱總RNA量的1%-2%。2024/12/120一、獲取外源目的基因片段2.3mRNA的保存用少量水溶解mRNA，即可用于cDNA合成或保存在70%乙醇中并于-70℃下貯存。2024/12/121一、獲取外源目的基因片段胰島素基因mRNA序列2024/12/122一、獲取外源目的基因片段胰島素基因mRNA序列NCBI中搜索得2024/12/123一、獲取外源目的基因片段3．逆轉(zhuǎn)錄mRNA,得cDNA第一鏈mRNA在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下由引物引導(dǎo)合成cDNA。加入高濃度的

Oligo（dT）引物，

，Oligo（dT）引物與

mRNA

的

3'

末端的

poly（A）配對，引導(dǎo)反轉(zhuǎn)錄酶以

mRNA

為模板合成第一鏈

cDNA

。這種

cDNA

合成的方法在

cDNA

文庫構(gòu)建中應(yīng)用極為普遍，其缺點主要是由于

cDNA

末端存在較長的

poly（A）而影響

cDNA

測序。（原因:oligo（dT）結(jié)合在mRNA的3‘端，因此合成全長的cDNA需要反轉(zhuǎn)錄酶從mRNA分子的一端移動到另一端，有時這種全合成難以達到）2024/12/124一、獲取外源目的基因片段4.得雙鏈DNA

4.1合成cDNA第二鏈得雙鏈DNA

4.2將DNA雙鏈通過PCR技術(shù)進行擴增2024/12/125一、獲取外源目的基因片段4.1合成cDNA第二鏈得雙鏈DNAmRNA－cDNA

雜合雙鏈中的

mRNA

鏈在

RNA

酶

H

作用下先形成很多切口,

mRNA

鏈就被切割成很多的小片段,這些小片段為大腸桿菌

DNA

聚合酶

Ⅰ

提供了合成第二鏈的引物。大腸桿菌

DNA

聚合酶

Ⅰ

以第一鏈

cDNA

為模板合成一段段互補的

cDNA

片段。這些

cDNA

片段進而在

DNA

連接酶的作用下連接成一條鏈,即

cDNA

的第二鏈。遺留在

5'-末端的一段很小的

mRNA

也被大腸桿菌

DNA

聚合酶

Ⅰ

的

5'3'

核酸外切酶和

RNA

酶

H

降解,暴露出與第一鏈

cDNA

對應(yīng)的

3'-端部分序列。同時,大腸桿菌

DNA

聚合酶

Ⅰ

的

3'--5'

核酸外切酶的活性可將暴露出的第一鏈

cDNA

的

3'-端部分消化掉,形成平端或差不多的平端優(yōu)點:a)合成cDNA的效率高b)直接利用第一鏈的反應(yīng)產(chǎn)物,不需純化c)避免使用S1核酸酶來切割雙鏈cDNA2024/12/126一、獲取外源目的基因片段4.1合成cDNA第二鏈得雙鏈DNA2024/12/127一、獲取外源目的基因片段4.2將DNA雙鏈通過PCR技術(shù)進行擴增4.2.1模板DNA的變性向離心管加入ＤＮＡ模板、引物、耐熱的DNA聚合酶、PCR緩沖液（500mm01／LKCl；100mmol／LTris一HCl(pH8.4),150mmol／LMgCl2,lmg／m1明膠）、5mmo1／LdNTP貯備液,然后加熱至93℃左右一定時間后,使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離,使之成為單鏈,以便它與引物結(jié)合,為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備2024/12/128一、獲取外源目的基因片段4.2將DNA雙鏈通過PCR技術(shù)進行擴增4.2.2模板DNA與引物的退火(復(fù)性)模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后,溫度降至55℃左右,引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合；2024/12/129一、獲取外源目的基因片段4.2將DNA雙鏈通過PCR技術(shù)進行擴增4.2.3引物的延伸DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP為反應(yīng)原料,靶序列為模板,按堿基配對與半保留復(fù)制原理,合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復(fù)制鏈,重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程,就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”,而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需2～4分鐘,2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。2024/12/130一、獲取外源目的基因片段5.目的基因回收純化及DNA測序糾錯

5.1將目的基因進行回收純化

5.2對目的基因進行測序

5.3DNA序列糾錯2024/12/131一、獲取外源目的基因片段5.1將目的基因進行回收純化1)在PCR試管中加入凝膠緩沖液進行瓊脂糖凝膠電泳電泳到適當(dāng)位置后在目的DNA條帶的前端挖一長方形槽，向槽中加入融化的低熔點膠，待凝固后進行電泳。2）當(dāng)DNA進入低熔點膠中心時停止電泳。紫外燈下切下目的條帶的低熔點膠。3)將切下的膠放到離心管中，加入200μｌ的ＴＥ緩沖液，65℃溫浴3分鐘以融化低熔點膠。4)然后分別用酚/氯仿，氯仿抽提一次。取上清，加入2倍體積的無水乙醇，-20℃沉淀DNA2h以上，12000rpm離心15min，棄上清，用70%乙醇洗滌，吹干后溶于10μl無菌水中。注意事項:在紫外燈下切出含有目的DNA片段的瓊脂糖凝膠時應(yīng)注意要快速操作，以免損傷ＤＮＡ。2024/12/132一、獲取外源目的基因片段5.2對目的基因進行測序利用DNA聚合酶,以待測單鏈DNA為模板,以dNTP為底物,設(shè)立四種相互獨立的測序反應(yīng)體系,在每個反應(yīng)體系中加入不同的ddNTP作為鏈延伸終止劑。在測序引物引導(dǎo)下,按照堿基配對原則,每個反應(yīng)體系中合成一系列長短不一的引物延伸鏈,通過高分辨率的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,放射自顯影檢測后,從凝膠底部到頂部按5’至3’方向讀出新合成鏈序列,由此推知待測模板鏈的序列。2024/12/133一、獲取外源目的基因片段5.2對目的基因進行測序2024/12/134一、獲取外源目的基因片段5.3DNA序列糾錯1、將待突變基因克隆到突變載體上；2、制備含突變基因的單鏈模板；3、人工合成一段改變了堿基順序的寡核苷酸片段，以此作為引物，在體外合成互補鏈，獲得含有錯配堿基的完整雙鏈M13DNA4、轉(zhuǎn)化和初步篩選異源雙鏈DNA分子轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，產(chǎn)生野生型、突變型的同源雙鏈DNA分子。5.用誘變的寡核苷酸引物作為探針，通過雜交即可鑒定出突變體2024/12/135一、獲取外源目的基因片段6.目的基因通過細(xì)胞克隆擴增6.1目的基因與運載體結(jié)合6.2將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞并使之?dāng)U增6.3篩選獲得了重組DNA分子的受體細(xì)胞克隆2024/12/136一、獲取外源目的基因片段6.1目的基因與運載體結(jié)合用與提取目的基因相同的限制酶切割質(zhì)粒使之出現(xiàn)一個切口；將目的基因插入切口處,讓目的基因的黏性末端與切口上的黏性末端互補配對；在連接酶的作用下連接形成重組DNA分子。2024/12/137一、獲取外源目的基因片段6.2將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞并使之?dāng)U增要讓目的基因表達，必須將它導(dǎo)入受體細(xì)胞并進行擴增。為獲得目的基因的表達產(chǎn)物時，通常以大腸桿菌等無害易得的細(xì)菌為受體。注意:為改進某種生物時，將欲改進的生物細(xì)胞為受體。為使重組的DNA分子更容易進入受體細(xì)胞，通常還要用一些物質(zhì)對受體細(xì)胞進行處理，使受體細(xì)胞具有更大的通透性，例如改變PH值，加入氯化鈣等。2024/12/138一、獲取外源目的基因片段6.3篩選獲得重組DNA分子的受體細(xì)胞克隆前幾步的處理十分繁鎖,為保證目的基因得到有效利用,通常用大量的受體細(xì)胞來接受不多的目的基因。這樣,處理的受體細(xì)胞中真正攝入了目的基因的很少,必須將它從中檢測出來。細(xì)菌的檢測,將每個受體細(xì)胞單獨培養(yǎng)形成菌落,檢測菌落中是否有目的基因的表達產(chǎn)物。淘汰無表達產(chǎn)物的菌落,保留有表達產(chǎn)物的進一步培養(yǎng)、研究。多細(xì)胞生物的檢測,將每個受體細(xì)胞單獨培養(yǎng)并誘導(dǎo)發(fā)育成完整個體,檢測這些個體是否攝入目的基因,攝入的基因是否表達（是否表現(xiàn)出相應(yīng)的性狀）。2024/12/139一、獲取外源目的基因片段7、目的基因回收及DNA測序,最終目的基因獲取7.1內(nèi)容物釋放將培養(yǎng)物加入試管,加入EDTA及去污劑（ＳＤＳ）,用堿處理細(xì)菌,使細(xì)菌的細(xì)胞壁破裂,釋放出細(xì)胞內(nèi)容物（在強堿環(huán)境下,宿主菌的線性雙鏈DNA片段中的氫鍵斷裂,雙鏈解離變性,而質(zhì)粒DNA共價閉合環(huán)狀的雙鏈并不完全分離）。2024/12/140一、獲取外源目的基因片段7、目的基因回收及DNA測序,最終目的基因獲取7.2加酸、離心然后加入高濃度酸性鹽,PH恢復(fù)至中性（變性的染色體DNA與變性的蛋白質(zhì)以及細(xì)胞碎片凝聚成網(wǎng)絡(luò)狀大分子不溶性沉淀物,而質(zhì)粒DNA又恢復(fù)天然構(gòu)型,能溶解在上清液中）,通過離心把染色體DNA,蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起除去。2024/12/141一、獲取外源目的基因片段7、目的基因回收及DNA測序,最終目的基因獲取7.3切割、電泳利用限制性內(nèi)切酶特異的識別DNA特異的核苷酸序列,并切割DNA,產(chǎn)生一定長度的DNA片段,通過電泳對酶切前后產(chǎn)物分析可以鑒別目的基因2024/12/142一、獲取外源目的基因片段7、目的基因回收及DNA測序,最終目的基因獲取7.4回收純化、測序?qū)δ康幕蜻M行回收純化,再測序2024/12/143二.表達載體的構(gòu)建pET28a（含有T7噬菌體啟動子、乳糖操縱子、核糖體結(jié)合位點、His6標(biāo)簽序列、凝血酶切割位點、多克隆位點、T7噬菌體終止子、乳糖阻遏序列、pBR322復(fù)制子ori、fl噬菌體復(fù)制子、卡那霉素篩選標(biāo)記序列等。）2024/12/144二.表達載體的構(gòu)建2024/12/145原因:1.T7噬菌體啟動子、核糖體結(jié)合位點等引導(dǎo)目的基因高效轉(zhuǎn)錄和翻譯。2.乳糖操縱子和乳糖阻遏序列存在的意義主要在于，當(dāng)目的蛋白對大腸桿菌有毒性的時候，可以通過添加阻遏物，控制目的蛋白以較低水平表達。3.His6標(biāo)簽序列、凝血酶切割位點存在的意義主要在于方便利用針對His6的整合層析分離純化蛋白、然后利用凝血酶去除切割標(biāo)簽蛋白。4.卡那霉素抗性基因編碼的氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶，對卡那霉素進行修飾，阻斷其與核糖體結(jié)合作用。二.表達載體的構(gòu)建2024/12/146三.重組目的DNA片段和表達載體用T7噬菌體DNA連接酶將質(zhì)粒載體pET28a經(jīng)EcoRⅠ和BamHⅠ酶切的片段與目的基因經(jīng)EcoRⅠ和BamHⅠ酶切的片段連接起來，構(gòu)成重組DNA分子。使用雙酶切:DNA分子重組時為了保證目的片段以正確的方向連接進入載體，往往盡可能選擇兩種具有不同黏性末端的酶分別酶切目的DNA分子和載體，這種雙酶切雖然使載體和目的DNA都產(chǎn)生兩種不同的黏性末端，但是連接酶會選擇把相同的黏性末端連接起來，從而保證目的基因只以一個方向連接入載體。2024/12/147四、選擇與獲取表達細(xì)胞1、選擇大腸桿菌2.培養(yǎng)大腸桿菌2024/12/148四、選擇與獲取表達細(xì)胞1.選擇大腸桿菌原因：1）繁殖迅速、培養(yǎng)簡單、操作方便、遺傳穩(wěn)定2）基因克隆及表達系統(tǒng)成熟完善3）全基因組測序完成，共有4405個開放性閱讀框架4）被美國FDA批準(zhǔn)為安全的基因工程受體生物2024/12/149四、選擇與獲取表達細(xì)胞開放閱讀框（ORF）是生物個體的基因組中,可能是蛋白質(zhì)編碼序列的部分?；蛑械腛RF包含并位于開始編碼與終止編碼之間。由于一段DNA或RNA序列有多種不同讀取方式,因此可能同時存在許多不同的開放閱讀框架。開放閱讀框包含一段可以編碼蛋白的堿基序列,不能被終止子打斷。2024/12/1502.大腸桿菌的培養(yǎng)（1）LB（Luria-Bertain)液體培養(yǎng)基配制精解蛋白胨(bacto-tryptone)1.0%酵母浸出粉(bacto-extract)0.5%氯化鈉1.0%攪拌使之完全溶解，用5molNaOH(about0.2ml/1000ml培養(yǎng)基）調(diào)pH至7.0，如用進口試劑可不必調(diào)，高壓滅菌20min(120℃0.1Mpa)

四、選擇與獲取表達細(xì)胞2024/12/151四、選擇與獲取表達細(xì)胞（2）牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基組成成分:牛肉膏3g,蛋白胨10g,Nacl5g,瓊脂15～20g,水1000mL,PH7.4～7.6。具體配置步驟:1.稱藥品按實際用量計算后,按配方稱取各種藥品放入大燒杯中.牛肉膏可放在小燒杯或表面皿中稱量,用熱水溶解后倒入大燒杯;也可放在稱量紙上稱量,隨后放入熱水中,牛肉膏使與稱量紙分離,立即取出紙片.蛋白胨極易吸潮,故稱量時要迅速。2024/12/152四、選擇與獲取表達細(xì)胞具體配置步驟:2.加熱溶解在燒杯中加入少于所需要的水量,然后放在石棉網(wǎng)上,小火加熱,并用玻棒攪拌,待藥品完全溶解后再補充水分至所需量.若配制固體培養(yǎng)基,則將稱好的瓊脂放入己溶解的藥品中,再加熱融化,此過程中,需不斷攪拌,以防瓊脂糊底或溢出,最后補足所失的水分。3.調(diào)pH檢測培養(yǎng)基的pH,若pH偏酸,可滴加lmol/LNaOH,邊加邊攪拌,并隨時用pH試紙檢測,直至達到所需pH范圍.若偏堿,則用lmol/LHCl進行調(diào)節(jié).pH的調(diào)節(jié)通常放在加瓊脂之前.應(yīng)注意pH值不要調(diào)過頭,以免回調(diào)而影響培養(yǎng)基內(nèi)各離子的濃度。2024/12/153四、選擇與獲取表達細(xì)胞具體配置步驟:4.過濾液體培養(yǎng)基可用濾紙過濾,固體培養(yǎng)基可用4層紗布趁熱過濾,以利培養(yǎng)的觀察.但是供一般使用的培養(yǎng)基,這步可省略。5.分裝按實驗要求,可將配制的培養(yǎng)基分裝入試管或三角瓶內(nèi).分裝時可用漏斗以免使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上而造成污染.分裝量:固體培養(yǎng)基約為試管高度的l/5,滅菌后制成斜面.分裝入三角瓶內(nèi)以不超過其容積的一半為宜.半固體培養(yǎng)基以試管高度的1/3為宜,滅菌后垂直待凝。2024/12/154四、選擇與獲取表達細(xì)胞具體配置步驟:6.加棉塞試管口和三角瓶口塞上用普通棉花(非脫脂棉)制作的棉塞.棉塞的形狀,大小和松緊度要合適,四周緊貼管壁,不留縫隙,才能起到防止雜菌侵入和有利通氣的作用.要使棉塞總長約3/5塞入試管口或瓶口內(nèi),以防棉塞脫落.有些微生物需要更好的通氣,則可用8層紗布制成通氣塞.有時也可用試管帽或塑料塞代替棉塞。7.包扎加塞后,將三角瓶的棉塞外包一層牛皮紙或雙層報紙,以防滅菌時冷凝水沾濕棉塞.若培養(yǎng)基分裝于試管中,則應(yīng)以5支或7支在一起,再于棉塞外包一層牛皮紙,用繩扎好.然后用記號筆注明,培養(yǎng)基名稱,組別,日期。2024/12/155四、選擇與獲取表達細(xì)胞具體配置步驟:8.滅菌將上述培養(yǎng)基于121.3℃濕熱滅菌20min.如因特殊情況不能及時滅菌,則應(yīng)故人冰箱內(nèi)暫存。

9.無菌檢查將滅菌的培養(yǎng)基放入37℃溫箱中培養(yǎng)24～48h,無菌生長即可使用,或貯存于冰箱或清潔的櫥內(nèi),備用。2024/12/156四、選擇與獲取表達細(xì)胞大腸桿菌培養(yǎng):采用劃痕接種法。用接種環(huán)從菌種中沾取少量菌液，劃線。37攝氏度，恒溫培養(yǎng)48到72小時，因為接種時和具體培養(yǎng)條件的不同，其生長一般都在2天外才能長出明顯的菌落。菌落特征:乳白色，圓形，菌落邊緣整齊，表面光滑，表面和背面顏色一致。2024/12/157五、重組DNA導(dǎo)入表達細(xì)胞氯化鈣轉(zhuǎn)化法對數(shù)生長期的大腸桿菌經(jīng)冰浴的氯化鈣低滲溶液處理,其細(xì)胞膜通透性增加,成為感受態(tài)細(xì)胞（感受態(tài)是指受體細(xì)胞處于容易吸收外源DNA的一種生理狀態(tài)）,加入重組質(zhì)粒,重組質(zhì)粒與鈣離子形成復(fù)合物并粘附于細(xì)菌細(xì)胞膜表面,經(jīng)42℃熱休克處理,細(xì)胞膜通透性增加,重組質(zhì)粒DNA進入感受態(tài)細(xì)胞（導(dǎo)入重組體）。細(xì)菌在不含抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)一定時間,使含有重組質(zhì)粒的細(xì)胞復(fù)原并表達抗生素抗性基因,涂布于含有抗生素的培養(yǎng)板上,生長得到轉(zhuǎn)化子。2024/12/158氯化鈣法轉(zhuǎn)化的原理機制:在0℃的CaCl2低滲溶液中，細(xì)菌細(xì)胞發(fā)生膨脹，Ca2+使細(xì)胞膜磷脂層形成液晶結(jié)構(gòu)，促使細(xì)胞外膜與內(nèi)膜間隙中部分核酸酶解離，誘導(dǎo)形成感受態(tài)。此外，Ca2+能與加入的DNA分子結(jié)合，形成抗脫氧核糖核酸酶的羥基－磷酸鈣復(fù)合物，黏附在胞膜的外表面；42℃熱激處理，細(xì)胞膜的液晶結(jié)構(gòu)發(fā)生擾動，出現(xiàn)間隙。五、重組DNA導(dǎo)入表達細(xì)胞2024/12/159氯化鈣轉(zhuǎn)化法要點:1.氯化鈣（二價鈣離子）的作用:提高細(xì)胞壁（膜）的通透性；2.熱激后迅速轉(zhuǎn)移到冰上:促使質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)移進入胞內(nèi)；3.這種轉(zhuǎn)化方法適用于雙鏈環(huán)狀DNA（質(zhì)粒），線型DNA不能采用此法。（在自然界自然發(fā)生的轉(zhuǎn)化過程中，進入細(xì)菌細(xì)胞中的為單鏈DNA。）五、重組DNA導(dǎo)入表達細(xì)胞2024/12/160標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒DNA.重組質(zhì)粒DNA.大腸桿菌JM109、離心機、0.1mol/LCaCl2、LB培養(yǎng)基、微量移液器、微量離心管、抗生素、20mmol/LMgSO4、微孔濾膜及濾器、培養(yǎng)皿、三角瓶、恒溫水浴箱、恒溫?fù)u床、超凈工作臺、玻璃涂布棒、95%乙醇實驗材料:五、重組DNA導(dǎo)入表達細(xì)胞2024/12/161注意事項:①質(zhì)粒的質(zhì)量和濃度。用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA應(yīng)主要是超螺旋DNA。轉(zhuǎn)化效率與外源DNA的濃度在一定范圍內(nèi)成正比，但當(dāng)加入的外源DNA的量過多或體積過大時，轉(zhuǎn)化效率就會降低。②試劑的質(zhì)量。所用試劑均需要最高純度的，并用超純水新鮮配制，滅菌備用。③防止雜菌和雜DNA的污染。五、重組DNA導(dǎo)入表達細(xì)胞2024/12/162二價鈣離子對轉(zhuǎn)化效率的影響熱激溫度對轉(zhuǎn)化效率的影響五、重組DNA導(dǎo)入表達細(xì)胞2024/12/163感受態(tài)細(xì)胞的制備：1、從新活化的E.coliDH5α平板上挑取一單菌落，接種于3～5mlLB液體培養(yǎng)中，37℃振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期(12h左右)；2、將該菌懸液以1:100～1:50轉(zhuǎn)接于100mlLB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩擴大培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)液開始出現(xiàn)混濁后，每隔20～30min測一次OD600，至OD600為0.3～0.5時停止培養(yǎng)，并轉(zhuǎn)裝到1.5mL離心管中；3、培養(yǎng)物于冰上放置20min；4.0～4℃，4000g離心10min，棄去上清液，加入1mL冰冷的0.1mo1／LCaCl2溶液，小心懸浮細(xì)胞,冰浴20分鐘；五、重組DNA導(dǎo)入表達細(xì)胞2024/12/1645、0～4℃，4000g離心10min，倒凈上清培養(yǎng)液，再用1.0mL冰冷的0.1mo1／LCaCl2溶液輕輕懸浮細(xì)胞，冰浴20min；6.0～4℃，4000g離心10min，棄去上清液，加入100μL冰冷的0.1mo1／LCaCl2溶液，小心懸浮細(xì)胞，冰上放置片刻后，即制成了感受態(tài)細(xì)胞懸液；制備好的感受態(tài)細(xì)胞懸液可直接用于轉(zhuǎn)化實驗，如果在4℃放置12～24h，其轉(zhuǎn)化效率可以增高4～6倍；也可加入占總體積15％左右高壓滅菌過的甘油，混勻后分裝于1.5ml離心管中，置于-70℃條件下，可保存半年至一年。五、重組DNA導(dǎo)入表達細(xì)胞2024/12/165六、重組體細(xì)胞的篩選純化鑒定在重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞的實驗中,由于重組率很低,因此需要從這些細(xì)胞中篩選出期望重組子,將轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞涂布于特定的固體培養(yǎng)板,生長出的單菌落或噬菌斑進一步篩選和鑒定。2024/12/1661、載體遺傳標(biāo)記法（抗生素抗性篩選法、營養(yǎng)缺陷型篩選法、噬菌斑篩選法、互補篩選法）2.核酸分子雜交法菌落原位雜交：制備與目的基因某一區(qū)域同源的探針序列，根據(jù)核酸雜交原理，探針序列特異性的雜交目的基因，并通過放射性同位素或熒光基團進行定位檢測。六、重組體細(xì)胞的篩選純化鑒定2024/12/1673.目的基因表達產(chǎn)物測定法如果重組DNA的目的基因能在宿主細(xì)胞中編碼蛋白質(zhì)，且宿主細(xì)胞本身不含該蛋白質(zhì)，那么可以通過檢測蛋白質(zhì)的生物功能或結(jié)構(gòu)來篩選和鑒定重組子。六、重組體細(xì)胞的篩選純化鑒定2024/12/168用熒光原位標(biāo)記篩選重組體1.制備核酸探針，通過數(shù)據(jù)庫查詢所需的寡核苷酸探針的資料，用ＤＮＡ合成儀合成，然后用熒光素進行標(biāo)記。２、將樣品進行打碎、離心、清洗等步驟，使微生物細(xì)胞與雜質(zhì)進行分離，同時增大細(xì)胞壁的通透性，保證探針?biāo)憷M入與ＤＮＡ雜交。３、配置雜交液，其中雜交液中的甲酰胺的濃度直接影響雜交的特異性，將雜交液與樣品之一雜交爐（避光、密封），雜交完成后用洗脫液（ＳＥＴ或ＳＳＣ）將多余的探針除去。４、加少量的苯二胺－甘油溶液覆蓋樣品，防止熒光淬滅，再封片，用熒光顯微鏡觀察、照相進行分析。六、重組體細(xì)胞的篩選純化鑒定2024/12/169熒光原位雜交技術(shù)熒光原位雜交是一種非放射性原位雜交方法，將熒光標(biāo)記的探針與待測序列進行雜交，根據(jù)雜交信號的有無及類型達到診斷的目的。原理:基于堿基互補配對的原則，用熒光素標(biāo)記的已知外源DNA或RNA作探針，與載玻片上的組織切片等雜交，與待測核酸的靶序列專一性結(jié)合，通過檢測雜交位點熒光來顯示特定核苷酸序列的存在、數(shù)目和定位。六、重組體細(xì)胞的篩選純化鑒定2024/12/170產(chǎn)物1.菌種RRhPIZpQE-40E.coliM15菌株七、工程菌產(chǎn)物鑒定和保存2024/12/1712.材料與試劑DEAE-SepharoseFF(瓊脂糖快流速陰離子交換劑)為杭州爭光樹脂有限公司產(chǎn)品,SephadexG-25為Sigma公司產(chǎn)品,Superdex75為GE公司產(chǎn)品,溶菌酶、脫氧核糖核酸酶、胰蛋白酶和羧肽酶B均為Sigma公司產(chǎn)品,谷胱甘肽[氧化型(GSSG)和還原型(GSH)]為上海博奧生物科技有限公司產(chǎn)品,二硫蘇糖醇(DTY)為OrganicsInc產(chǎn)品,13-巰基乙醇和異丙基-13-D-巰基吡喃半乳糖苷(IPTG)為BB1分裝,胰蛋白胨、酵母粉（英國Oxiod公司）,氨芐青霉素（美國Sigma公司）,其余試劑均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。七、工程菌產(chǎn)物鑒定和保存2024/12/172培養(yǎng)基:（１）LB培養(yǎng)基(g/L):胰蛋白胨10.0,酵母提取物5.0,NaCl10.0,pH7.0;（２）發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖4,甘油15,酵母粉30,蛋白胨30,Na2HPO412,KH2PO46,NH4Cl1,NaCl2,MgSO40.48,pH7.0;（３）甘油補料培養(yǎng)基(g/L):甘油300,酵母汁150,MgSO410,pH7.0。所有培養(yǎng)基使用前均加入氨芐青霉素至終濃度50mg/L。水平恒溫?fù)u床（德國Therma公司）；BiostatB發(fā)酵系統(tǒng)（德國Braun公司）；蛋白質(zhì)電泳凝膠自動成像系統(tǒng)（英國Syngene公司）。七、工程菌產(chǎn)物鑒定和保存2024/12/1733.細(xì)菌培養(yǎng)和RRhPI的表達采用二級發(fā)酵的方式，用正交法優(yōu)化培養(yǎng)條件，并將優(yōu)化條件用于發(fā)酵罐進行發(fā)酵，收獲濕菌體。RRhPIZpQE-40E．coliM15的發(fā)酵罐培養(yǎng):將lOlId經(jīng)過活化的RRhPI／pQE-40E．coliM15轉(zhuǎn)移至100ml培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)一段時間后，將其轉(zhuǎn)移至含有1.5L培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，培養(yǎng)一段時間(轉(zhuǎn)速為300r/min，通氣量為1:1.5-1:1.8)，過程中加人一定量新鮮的培養(yǎng)基并用NaOH調(diào)節(jié)pH，之后加入IPTG并升溫誘導(dǎo)RRhPI的表達，轉(zhuǎn)速隨即調(diào)為400-500r／min，增大通氣量至1:1.8-1:2.0，繼續(xù)培養(yǎng)一段時間后，收集菌體。七、工程菌產(chǎn)物鑒定和保存2024/12/1744.包涵體的收集和洗滌將收集的濕菌體凍存于-2O℃,然后懸浮于緩沖液A(50mmol/Lrifs-HC1,0.5mmol/LEDTA,50mmol/LNaC1,5％甘油,0.1-0.5mmol/LDTY,pH7.9)(5-6ml/g濕菌)中,加入溶菌酶(5mg/g濕菌體),室溫或37℃振蕩2h。冰浴超聲10S×30次,其間每次間隔20S,功率為200W。10℃條件下1000g離心5min去除細(xì)胞碎片。上清液中的包涵體(Inclusionbody,IB)在4℃條件下27000g離心15min收集,然后用含2mol/L尿素的緩沖液A充分懸浮,室溫靜置30min后4℃條件下17000g離心15min,收集沉淀。沉淀再用含2％脫氧膽酸鈉的緩沖液A充分懸浮,4℃條件下17000g離心l5min,收集沉淀。最后沉淀用10mmol/Lrifs-HC1,pH7.3洗滌兩次(4℃,17000g離心15min)。七、工程菌產(chǎn)物鑒定和保存2024/12/175注意事項:細(xì)胞內(nèi)表達的最大問題就是容易形成不溶性的包涵體,它的形成對表達產(chǎn)物的活性不利。七、工程菌產(chǎn)物鑒定和保存2024/12/176包涵體(inclusionbody)是細(xì)菌表達的蛋白質(zhì)在胞內(nèi)互相凝集而形成的無活性固體顆粒。具有很強的折光性。正常的大腸桿菌基因以重組方法使其在大腸桿菌內(nèi)表達也會形成包涵體。說明不僅僅是外源蛋白才能形成包涵體,同時也發(fā)現(xiàn)有表達量較低的基因產(chǎn)物也是以不可溶形式存在的。包涵體的形成不僅僅與宿主細(xì)胞、表達基因有關(guān),還與培養(yǎng)外環(huán)境有關(guān)系。其形成的原因多數(shù)認(rèn)為:目的基因的過度表達使蛋白質(zhì)無足夠時間進行肽鏈折疊,產(chǎn)生凝集。重組蛋白所處的環(huán)境條件對包涵體也有較大影響,如當(dāng)溫度超過某一種蛋白質(zhì)的變性溫度時,隨著溫度的增加凝集量也增加。當(dāng)環(huán)境PH接近某一種蛋白的等電點時,蛋白的凝集增加,包涵體的形成也增多,此外,離子組成和強度、輔助因子、氧化還原電位等均可影響包涵體的形成。七、工程菌產(chǎn)物鑒定和保存2024/12/177應(yīng)對方案:

改變發(fā)酵條件,如發(fā)酵溫度、培養(yǎng)的PH值等來減少重組蛋白的凝集,進而有效控制包涵體的形成,給下游純化工作創(chuàng)造有利條件。七、工程菌產(chǎn)物鑒定和保存2024/12/1785.RRhPI的初步純化將收集的IB用含有0.1％-0.3％13-巰基乙醇的緩沖液B(30mmol/LHC1,8mol/L尿素,pH8.0)溶解,上于已用緩沖液B平衡的DEAE-SepharoseFF柱,用合適的氯化鈉梯度洗脫,收集含RRhPI的洗脫液。6.RRhPI的重組復(fù)性將初步純化后的RRhPI通過SephadexG-25脫尿素,轉(zhuǎn)換緩沖液為不同pH的50mmol/LGly-NaOH重組液,或含有適量GSSG的Gly-NaOH緩沖液中,使蛋白終濃度為0.1-0.6mg/mL,收集趨于正確折疊的RRhPI單體組分,加人適量GSH和GSSG,4℃放置24h。七、工程菌產(chǎn)物鑒定和保存2024/12/1797.酶切轉(zhuǎn)化向RRhPI復(fù)性液中加入一定量的胰蛋白酶和羧肽酶B,37℃酶切一段時間,然后用0.1mol/LZnC1終止反應(yīng)并沉淀生成的hI。8.hI的純化將hI粗品用30mmol/LTris2HCl,8mol/L尿素,pH8.0溶解,在Superdex75上進行分離純化。七、工程菌產(chǎn)物鑒定和保存2024/12/180分離純化層析柱的平衡液和洗脫液均為0.2mol/L乙酸鈉二乙酸,pH4.0用0.1mol/LZnCl2沉淀的hI粗產(chǎn)品可通過Superdex75進行純層析圖譜見圖1,hI主要集中在峰3。收集峰3進行SDS2PAGE分析,結(jié)果顯示,見圖2,所得hI組份在SDS2PAGE分析中是均一的,只有一條蛋白帶。將峰3組分透析,濃縮并凍干,即可最終制得hI。圖1:Superdex75純化hI

圖2十二烷基磺酸鈉-聚丙稀酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)七、工程菌產(chǎn)物鑒定和保存2024/12/181產(chǎn)物進一步鑒定:（1）氨基酸組成測定取純化的胰島素,經(jīng)5.7mol/L鹽酸水解,用氨基酸自動分析儀測定氨基酸組成。（2）與人胎盤細(xì)胞膜胰島素受體結(jié)合（3）胰島素的生物活力測定體內(nèi)活力用半定量小白鼠驚厥方法測定。七、工程菌產(chǎn)物鑒定和保存2024/12/182常見的保藏方法有以下幾種:（1）短期保存可以用瓊脂穿刺進行（2）長期保存大多采取低溫保存，用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，離心后加一定的菌種保藏液（含甘油），在-20℃下保藏。（3）用液氮迅速冷卻，減壓升華去除水之后在-80℃下保存七、工程菌產(chǎn)物鑒定和保存2024/12/183八、發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)流程的設(shè)計2024/12/184八、發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)流程的設(shè)計2024/12/185生產(chǎn)工藝流程功能間分布八、發(fā)酵培養(yǎng)2024/12/186八、發(fā)酵培養(yǎng)生產(chǎn)工藝流程功能間分布2024/12/187八、發(fā)酵培養(yǎng)搖瓶發(fā)酵試驗搖瓶培養(yǎng)水平下,用優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基和比濁法測RRhPI-pQE40E.coliM15的生長曲線。2024/12/188八、發(fā)酵培養(yǎng)搖瓶發(fā)酵試驗用接種環(huán)挑取斜面保存的RRhPI-pQE40E.coliM15一環(huán)接種于3mlLB/AK培養(yǎng)基中,37℃,220r·min-1恒溫振蕩培養(yǎng)一段時間。取100μl菌液接種于5mlLB/AK培養(yǎng)基中,37℃,220r·min-1恒溫振蕩培養(yǎng)一段時間即可。活化的種子可在4℃下保存數(shù)周待用。2024/12/189八、發(fā)酵培養(yǎng)搖瓶發(fā)酵試驗將5ml活化種子轉(zhuǎn)接到50ml優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基中,恒溫振蕩培養(yǎng)一段時間。取50ml經(jīng)一級發(fā)酵擴培后的菌液轉(zhuǎn)接到500ml發(fā)酵培養(yǎng)基中,恒溫振蕩培養(yǎng)一段時間后加入IPTG誘導(dǎo)人胰島素原的表達,繼續(xù)恒溫振蕩培養(yǎng)一段時間后結(jié)束發(fā)酵。3×103r·min-1離心15min,沉淀即得RRh2PI-pQE40E.coliM15濕菌體,于-20℃保存。2024/12/190八、發(fā)酵培養(yǎng)搖瓶發(fā)酵試驗采用正交法,結(jié)合搖瓶發(fā)酵工藝的前期研究,選取搖瓶培養(yǎng)條件中7個主要因素進行兩水平正交優(yōu)化,7個因素為種子活化方式、搖床轉(zhuǎn)速(通風(fēng)量)、IPTG誘導(dǎo)溫度、接種量、IPTG添加量、誘導(dǎo)時間和補料方式。以每升培養(yǎng)基收獲濕菌體的量及發(fā)酵液的A600為目標(biāo)量考察條件優(yōu)化的效果。2024/12/191八、發(fā)酵培養(yǎng)搖瓶發(fā)酵試驗進行8次實驗,對實驗結(jié)果進行分析,優(yōu)化出最佳實驗條件,并做3次水平重復(fù)試驗,分別測定每升培養(yǎng)基收獲濕菌體的量、發(fā)酵液的A600及每升培養(yǎng)基收獲包涵體的量。IPTG誘導(dǎo)基因工程大腸桿菌表達RRhPI。對誘導(dǎo)時間的影響進一步做了分析,基因工程菌在三角搖瓶培養(yǎng)至對數(shù)生長中期,加入0.5mmol·L-1IPTG進行誘導(dǎo),每隔1h取樣,以SDS分析RRhPI的表達情況。2024/12/192八、發(fā)酵培養(yǎng)搖瓶發(fā)酵結(jié)果在搖瓶培養(yǎng)水平下,采用優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵RRhPI-pQE40E.coliM15,培養(yǎng)4h后即進入對數(shù)生長期,而且對數(shù)生長期可延至17h。2024/12/193八、發(fā)酵培養(yǎng)搖瓶發(fā)酵結(jié)果采用優(yōu)化出的最佳實驗條件做3次平行驗證試驗。結(jié)果見表。

2024/12/194八、發(fā)酵培養(yǎng)搖瓶發(fā)酵結(jié)果綜合每升培養(yǎng)基所收獲濕菌體的量(wetweight/g·L-1)和發(fā)酵液的A600兩個指標(biāo),選取關(guān)鍵因素的最優(yōu)條件,結(jié)果表明搖床轉(zhuǎn)速(即通風(fēng)量)與補料方式對發(fā)酵結(jié)果影響最大,IPTG的誘導(dǎo)時間和添加量次之。

2024/12/195八、發(fā)酵培養(yǎng)搖瓶發(fā)酵結(jié)果正交試驗所得菌體經(jīng)溶菌酶或/聲破碎細(xì)胞后得到的包涵體SDS的結(jié)果見圖。2024/12/196八、發(fā)酵培養(yǎng)搖瓶發(fā)酵結(jié)果RRhPI-pQE40E.coliM15表達的外源蛋白(His)6-Arg-Arg-人胰島素原以包涵體形式存在,其分子大小約為13kD,由圖可知,在哪種正交實驗條件下包涵體的表達量較高。2024/12/197八、發(fā)酵培養(yǎng)搖瓶發(fā)酵結(jié)果RRhPI-pQE40E.coliM15在搖瓶中培養(yǎng)至對數(shù)生長中期,加入0.5mmol·L-1IPTG進行誘導(dǎo),每隔1h取樣,以SDS分析RRhPI的表達情況(如圖)。2024/12/198八、發(fā)酵培養(yǎng)搖瓶發(fā)酵結(jié)果結(jié)果RRhPI-pQE40E.coliM15在IPTG誘導(dǎo)4～5h時,富含包涵體的濕菌體(約24kD)收率較高,相應(yīng)的目的蛋白表達量較高,繼續(xù)誘導(dǎo)并未使?jié)窬w表達量有所提高。因此,誘導(dǎo)3.5～4h既有利于富含包涵體的濕菌體及目的蛋白的表達,又可縮短發(fā)酵時間,簡化生產(chǎn)工藝。2024/12/199八、發(fā)酵培養(yǎng)細(xì)胞的兩種破碎方法其一是溶菌酶/超聲破碎細(xì)胞。發(fā)酵所得RRhPI-pQE40E.coliM15濕菌體,懸浮于適量緩沖液A(50mmol·L-1Tris-HCl、0.5mmol·L-1EDTA.50mmol·L-1NaCl、5%甘油、0.1～0.5mmol·L-1DTT、pH7.90)中,加入溶菌酶(5mg·g-1濕菌體),室溫或37℃振蕩2h。在冰浴中超聲(10s×30),每次間隔20s,功率200W。2024/12/1100八、發(fā)酵培養(yǎng)細(xì)胞的兩種破碎方法其二是超聲破碎細(xì)胞。大腸桿菌濕菌體懸浮于適量的緩沖液A中,充分溶解,冰浴超聲(40s×10),每次間隔30s,功率200W。2024/12/1101八、發(fā)酵培養(yǎng)細(xì)胞的兩種破碎方法兩種破碎方法所得包涵體洗滌后作SDS。洗滌時均先后用含2mol·L-1尿素的緩沖液和含2%脫氧膽酸鈉(DOC)的緩沖液各洗滌1次,最后用10mmol·L-1Tris-HCl清洗兩次。2024/12/1102八、發(fā)酵培養(yǎng)包涵體的三種洗滌方法溶菌酶/超聲破碎細(xì)胞的裂解液于4℃、114×104r·min-1離心15min,收集沉淀。洗滌方法一是將此沉淀用2mol·L-1尿素的緩沖液充分溶解,離心收集沉淀;沉淀再用2%DOC的緩沖液洗滌,離心,所得沉淀用10mmol·L-1Tris-HCl清洗2次,即得包涵體,于-20℃保存。2024/12/1103八、發(fā)酵培養(yǎng)包涵體的三種洗滌方法方法二則用緩沖液充分洗滌沉淀兩次,收集沉淀保存。方法三用2%DOC的緩沖液洗滌1次。再用10mmol·L-1Tris-HCl清洗兩次,離心收集沉淀保存。取上述不同方法洗滌的沉淀,用SDS檢測洗滌效果。2024/12/1104八、發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)果說明“1.2.3”項中破碎方法一較好,即用溶菌酶和超聲破碎結(jié)合可徹底破碎細(xì)胞,并使表達產(chǎn)物包涵體充分溶出?！?.2.4”項中方法一的洗滌效果優(yōu)于方法二和三,即采用變性劑2mol·L-1尿素及離子型去污劑2%DOC洗滌的效果較好。2024/12/1105菌種活化與擴大培養(yǎng)

將凍存的工程菌復(fù)蘇后接種于LB平板培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)24h,挑取單菌落接種于5mLLB液體培養(yǎng)基,37℃250r/min振蕩12h后,按1:100比例轉(zhuǎn)種于LB液體培養(yǎng)基中,繼續(xù)振蕩10h作為發(fā)酵種子液。八、發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵步驟2024/12/1106八、發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵罐發(fā)酵發(fā)酵罐的選取培養(yǎng)設(shè)備以及設(shè)備控制應(yīng)滿足獲得高濃度的受體細(xì)胞和高表達的基因表達產(chǎn)物。發(fā)酵罐的組成部分：發(fā)酵罐體、保證高傳質(zhì)作用的攪拌器、精細(xì)的溫度控制和滅菌系統(tǒng)、空氣無菌過濾裝置、殘留氣體處理裝置、參數(shù)測量與控制系統(tǒng)（如pH、O2.CO2等）、培養(yǎng)液配制及連續(xù)操作裝置等。發(fā)酵步驟2024/12/1107八、發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵罐發(fā)酵發(fā)酵步驟2024/12/1108發(fā)酵罐發(fā)酵采用自控5L發(fā)酵罐進行分批補料發(fā)酵試驗,初始工作體積為3.0L。設(shè)置指標(biāo)為:發(fā)酵溫度37℃,初始攪拌速度400r/min,初始通氣量1.5L/min,不斷提高攪拌轉(zhuǎn)速與通氣量最大分別至650r/min和3.5L/min以維持溶解氧始終在30%以上,pH值誘導(dǎo)前為7.2,誘導(dǎo)后為7.4。培養(yǎng)分分批培養(yǎng)和分批補料兩個階段,每隔1h取樣測定A650nm、細(xì)胞干重和葡萄糖濃度等參數(shù)。當(dāng)檢測到培養(yǎng)基中葡萄糖耗盡時開始采用pH-stat反饋流加的方式補料,即當(dāng)發(fā)酵液的pH達到7.4時設(shè)定pH反饋,高于設(shè)定的pH即開始補加發(fā)酵補料培養(yǎng)基,直至達到設(shè)定的pH時停止流加;補料總量為發(fā)酵液總體積的20%。誘導(dǎo)后培養(yǎng)5-7h,放罐,SDS檢測表達情況。八、發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵步驟2024/12/1109高密度發(fā)酵補料控制工藝

以甘油作為限制性基質(zhì)進行分批補料發(fā)酵,分別考察不同補料模式對工程菌生長和重組蛋白表達的影響:(1)恒速補料法在開始誘導(dǎo)后,分別依照恒定的速度(10,20,30,40mL/h)流加甘油補料培養(yǎng)基,通過流加氨水和稀鹽酸控制pH值。(2)分階段變速補料法在開始誘導(dǎo)后,以20mL/h的初速度流加甘油補料培養(yǎng)基,并以5mL/h的增加速度,逐漸提高補料速度。(3)恒定pH反饋補料法在發(fā)酵的不同階段設(shè)定培養(yǎng)環(huán)境的pH(初始培養(yǎng)期以發(fā)酵培養(yǎng)基pH7.0為設(shè)定值,誘導(dǎo)期pH根據(jù)分批培養(yǎng)結(jié)果設(shè)定為其最佳值),用甘油補料培養(yǎng)基維持不同時期系統(tǒng)pH的相對恒定。八、發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵步驟2024/12/1110高密度發(fā)酵影響條件1.培養(yǎng)基組成:（1）碳源大腸桿菌高密度高表達發(fā)酵控制中優(yōu)化碳源是關(guān)鍵因素。常用的碳源有糖類、低碳醇、油脂和有機酸等。由于大腸桿菌利用葡萄糖生長速度快,并且測定方便,葡萄糖是目前大腸桿菌發(fā)酵中最常用的碳源物質(zhì)。但葡萄糖添加過量時容易使大腸桿菌生長速率過大,導(dǎo)致葡萄糖效應(yīng),產(chǎn)生乙酸等代謝副產(chǎn)物,不僅影響菌體的生長,而且不利于外源蛋白的表達。以甘油代替葡萄糖作為碳源可以有效減少抑制性代謝產(chǎn)物乙酸的積累,更有利于重組菌的高密度發(fā)酵。八、發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵步驟2024/12/1111高密度發(fā)酵影響條件（2）無機鹽微生物要維持正常的生長代謝,除需要碳源和氮源外還需要