高三 人教版選擇性必修三 生物 第3章《重組DNA技術的基本工具》課件

高三—人教版選擇性必修三—生物—第3章重組DNA技術的基本工具知識回顧

基因工程是指按照人們的愿望,通過轉基因等技術，賦予生物新的遺傳特性,創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產品。由于基因工程是在DNA分子水平上進行設計和施工的，因此又叫作DNA重組技術。理論基礎（1）DNA的基本組成單位和空間結構相同；（2）堿基對的配對方式相同；

（3）基因控制蛋白質的合成且共用一套遺傳密碼。

番木瓜是“嶺南四大佳果”之一。但是，一直以來番木瓜的生長都受到環(huán)斑病毒（PRSV,一種單鏈RNA病毒）的威脅，嚴重的時候會導致番木瓜減產80%-90%。

華南農業(yè)大學利用轉基因技術，將PRSV的復制酶基因轉入番木瓜植株，獲得了優(yōu)質的抗病毒番木瓜——“華農1號”，該品種可抵抗華南地區(qū)現已發(fā)現的5個病毒株系。該品種于2006年獲農業(yè)部批準準予在廣東省生產應用的安全證書，目前已在華南地區(qū)廣泛種植，這也是我國首例轉基因果樹植物批準商品化生產，帶來了良好的經濟、社會和環(huán)境收益。實例：番木瓜“華農一號”的培育

番木瓜“華農一號”培育的大致流程如圖所示，請你根據所學知識：①簡要描述“華農一號”培育的主要步驟；②說出每個步驟中需要何種工具？步驟一：步驟二：目的基因與運載體分子拼接步驟三：重組分子導入受體細胞獲取目的基因：切割、改造“分子手術刀”“分子縫合針”“分子運輸車”一、“分子手術刀”——限制性核酸內切酶1.來源：主要從原核生物中分離純化而來2.作用特點：

能夠專一性識別雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列，

并且使每一條鏈中特定部位的磷酸二酯鍵斷開.1.你能推測限制酶存在于原核生物中的作用是什么嗎？限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA，達到保護自身的目的。2.為什么限制性內切酶不剪切細菌本身的DNA？①其DNA分子中或者不具備這種限制酶的識別切割序列。②通過甲基化酶將甲基轉移到所識別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開。思考:EcoRⅠ(識別GAATTC序列,在G與A之間切割)SmaⅠ(識別GGGCCC序列,在G與C之間切割)5'5'3'3'5'5'3'3'黏性末端平末端3．作用結果中心軸線兩側中心軸線處對點練習：1.請寫出下列限制酶切割形成的黏性末端不同的限制酶也可能會形成相同的黏性末端同尾酶：使切割點的選擇范圍擴大對點練習：2.請判斷：以下黏性末端是由______種限制酶作用產生。3注意觀察識別序列和切割位點①配對黏性末端②找到切割位點③補全序列一做題技巧：TTAAGC為讓抗PRSV基因與質粒拼接，需要在抗PRSV基因兩端分別添加對應的限制酶的酶切位點。番木瓜“華農一號”的培育大致流程如圖所示：二、“分子縫合針”——DNA連接酶1.作用：2.種類：⑴E.coliDNA連接酶⑵T4DNA連接酶將雙鏈DNA片段“縫合”起來，恢復被限制酶切開的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵。E·coliDNA連接酶與T4DNA連接酶比較：類型

來源E.coliDNA連接酶T4DNA連接酶功能大腸桿菌T4噬菌體恢復磷酸二酯鍵只能連接黏性末端能連接黏性末端和平末端(效率較低)相同點差別思考：DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎？DNA連接酶DNA連接酶ATAGTCCGAATTDNA連接酶：連接兩個DNA片段CAATTGAGTATCDNA聚合酶DNA聚合酶：連接單個脫氧核苷酸形成單鏈小結DNA連接酶與DNA聚合酶的比較DNA連接酶DNA聚合酶相同點作用實質化學本質不同點模板作用對象作用結果用途都能催化形成磷酸二酯鍵都是蛋白質

不需要需要DNA的一條鏈作模板形成完整的重組DNA分子形成DNA的一條鏈基因工程、DNA復制DNA復制只能將單個核苷酸連接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯鍵在兩個DNA片段之間形成磷酸二酯鍵二三、“分子運輸車”—基因進入受體細胞的載體質粒作為運載工具，將外源基因送入受體細胞。2.作用：動植物病毒噬菌體1.種類：質粒③有特殊的標記基因，便于重組DNA分子的篩選①有一或多個限制酶切割位點②能在受體細胞內大量復制并穩(wěn)定保存④對受體細胞無害，易分離

質粒是一種裸露的、結構簡單、獨立于真核細胞細胞核或原核細胞擬核DNA之外的環(huán)狀雙鏈DNA分子。對點練習：下圖是某一質粒和目的基因上的限制酶切位點示意圖，應該選用哪種限制酶切割來構建重組質粒？圖1圖2BamHI

和

HindIII①

防止目的基因和質粒的自身環(huán)化不能用E.coRI的原因：②

防止目的基因反向連接到質粒上不能用SmaI的原因：SmaI會破壞目的基因為讓抗PRSV基因與質粒拼接并表達，需在抗PRSV基因的上下游分別添加限制

和

的酶切位點。番木瓜“華農一號”的培育大致流程如圖所示：HindIIIBamHI思維提升1、選目的基因兩端和運載體都有的酶切位點；2、酶切位點不能破壞目的基因以及質粒中的重要元件；3、至少保留一個完整的標記基因，便于篩選；4、盡量使用雙酶切法，可以防止目的基因、載體的自身環(huán)化以及目的基因與載體反向連接；選擇限制酶的原則：限制酶作用部位：種類E.coliDNA連接酶運載體條件③

有一個至多個限制酶切割位點質粒、噬菌體、動植物病毒DNA連接酶作用部位：切開DNA分子的磷酸二酯鍵來源：主要存在于原核生物中特點：具有專一性（能識別雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列）T4DNA連接酶①

對受體細胞無害②

能自我復制或整合到宿主DNA上。④

常有特殊的標記基因種類：磷酸二酯鍵作用結果：產生黏性末端或平末端本節(jié)小結實驗與探究:DNA的粗提取與鑒定1.實驗原理：提取：DNA不溶于酒精，但某些蛋白質溶于酒精，利用這一原理，可以使DNA析出，初步分離DNA與蛋白質。DNA在不同濃度的NaCl溶液中的溶解度不同，它能溶于2mol/L的NaCl溶液。在一定溫度下，DNA遇二苯胺

會呈現藍色。鑒定：2.實驗材料：新鮮洋蔥（香菜、菠菜、菜花或豬肝等）也可以用雞血細胞，需加入檸檬酸鈉，防止血液凝固3.試劑：①研磨液②體積分數為95%的酒精③2mol/L的NaCl溶液④二苯胺試劑含有NaCl、EDTA、SDS、Tris和HCl研磨液成分作用Tris-HCl緩沖液穩(wěn)定DNAEDTA抑制DNA酶SDS使蛋白質變性溶解細胞膜使蛋白質變性與DNA分離4.實驗步驟取材、研磨過濾或離心取溶液預冷酒精析出DNA或離心收集沉淀中的DNANaCl溶液溶解DNA并鑒定五、注意事項1．加入酒精和用玻璃棒攪拌時，動作要輕緩，且沿一個方向攪拌，以免加劇DNA分子的斷裂，導致DNA分子不能形成絮狀沉淀2．酒精要預冷：①可抑制DNA水解酶的活性，進而抑制DNA降解②抑制分子運動，使DNA易形成沉淀析出③低溫有利于增加DNA分子的柔韌性，減少其斷裂六、結果分析與評價1．某同學提取出的絲狀物發(fā)黃，用二苯胺試劑鑒定，藍色不明顯，是什么原因？如果提取的DNA不是白色絲狀物，說明DNA中的雜質較多;如果鑒定不呈現藍色，也說明提取的DNA含量低，或者在實驗操作過程中出現了失誤等。2．你能分析出粗提取的DNA中可能含有哪些雜質嗎？本實驗粗提取的DNA可能仍然含有核蛋白、多糖等雜質。謝謝觀看！高三—人教版選擇性必修三—生物—第3章重組DNA技術的基本工具答疑一、選擇題：1．（2023·山西·高考真題）某同學擬用限制酶（酶1、酶2、酶3和酶4）、DNA連接酶為工具，將目的基因（兩端含相應限制酶的識別序列和切割位點）和質粒進行切割、連接，以構建重組表達載體。限制酶的切割位點如圖所示。

下列重組表達載體構建方案合理且效率最高的是（

）A．質粒和目的基因都用酶3切割，用E.coliDNA連接酶連接B．質粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4DNA連接酶連接C．質粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4DNA連接酶連接D．質粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coliDNA連接酶連接C【解析】考點：限制酶和DNA連接酶的作用特點。只有T4DNA連接酶可以連接平末端。2．（2023·湖北·高考真題）用氨芐青霉素抗性基因（AmpR）、四環(huán)素抗性基因（TetR）作為標記基因構建的質粒如圖所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的質粒，構建基因表達載體（重組質粒），并轉化到受體菌中。下列敘述錯誤的是（）

A．若用HindⅢ酶切，目的基因轉錄的產物可能不同B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet（四環(huán)素）培養(yǎng)基中的菌落，不一定含有目的基因C．若用SphⅠ酶切，可通過DNA凝膠電泳技術鑒定重組質粒構建成功與否D．若用SphⅠ酶切，攜帶目的基因的受體菌在含Amp（氨芐青霉素）和Tet的培養(yǎng)基中能形成菌落D2．（2023·湖北·高考真題）用氨芐青霉素抗性基因（AmpR）、四環(huán)素抗性基因（TetR）作為標記基因構建的質粒如圖所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的質粒，構建基因表達載體（重組質粒），并轉化到受體菌中。下列敘述錯誤的是（）

A．若用HindⅢ酶切，目的基因轉錄的產物可能不同B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet（四環(huán)素）培養(yǎng)基中的菌落，不一定含有目的基因D【解析】A、若用HindⅢ酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，因而轉錄的產物可能不同，A正確。B、若用PvuⅠ酶切，氨芐青霉素抗性基因被破壞，四環(huán)素抗性基因完整，但重組質粒和質粒中都有四環(huán)素抗性基因，因此在含四環(huán)素培養(yǎng)基中的菌落，不一定含有目的基因，B正確；2．（2023·湖北·高考真題）用氨芐青霉素抗性基因（AmpR）、四環(huán)素抗性基因（TetR）作為標記基因構建的質粒如圖所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的質粒，構建基因表達載體（重組質粒），并轉化到受體菌中。下列敘述錯誤的是（）

C．若用SphⅠ酶切，可通過DNA凝膠電泳技術鑒定重組質粒構建成功與否【解析】C、DNA凝膠電泳技術可以分離不同大小的DNA片段，重組質粒的大小與質粒不同，能夠鑒定重組質粒構建成功與否，C正確；D2．（2023·湖北·高考真題）用氨芐青霉素抗性基因（AmpR）、四環(huán)素抗性基因（TetR）作為標記基因構建的質粒如圖所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的質粒，構建基因表達載體（重組質粒），并轉化到受體菌中。下列敘述錯誤的是（）

D．若用SphⅠ酶切，攜帶目的基因的受體菌在含Amp（氨芐青霉素）和Tet的培養(yǎng)基中能形成菌落【解析】D、SphⅠ的酶切位點位于四環(huán)素抗性基因中，若用SphⅠ酶切，四環(huán)素抗性基因被破壞，但重組質粒中含氨芐青霉素抗性基因（AmpR），因此攜帶目的基因的受體菌在含Amp（氨芐青霉素）的培養(yǎng)基中能形成菌落，在含Tet的培養(yǎng)基中不能形成菌落，D錯誤。