第10章動物染色體工程

第10章動物(dòngwù)染色體工程染色體工程(chromosomeengineering)是按照人們的需要對生物的染色體進行操作,添加、削弱或替代(tìdài)染色體，從而達到定向育種或創(chuàng)造人工新物種的目的。共一百一十九頁AnimalChromosomeEngineering◆認識(rènshi)染色體與染色體組◆什么是染色體工程◆動物染色體工程的主要內(nèi)容染色體組工程個別染色體工程人工染色體共一百一十九頁一、認識染色體1.染色體的組成與DNA、基因之間的關(guān)系2.染色體的形態(tài)結(jié)構(gòu)與分類(fēnlèi)3.染色體DNA的3種功能元件4.染色體組共一百一十九頁1、真核細胞染色體的組成(zǔchénɡ)組蛋白：H1、H2A、H2B、H3、H4；非組蛋白：HMG、DNA結(jié)合蛋白DNA：不重復(fù)序列；中度重復(fù)序列；高度(gāodù)重復(fù)序列少量的RNA；共一百一十九頁2、染色體的主要結(jié)構(gòu)(jiégòu)◆著絲粒(centromere)●主縊痕(Primaryconstriction)

◆次縊痕(secondaryconstriction)◆動粒(kinetochore)◆核仁組織區(qū)(nucleolarorganizingregion,NOR)◆隨體(satellite)◆端粒(telomere)根據(jù)著絲點的位置而定，可將中期(zhōngqī)染色體分為四種：中著絲粒染色體、亞中著絲粒染色體、端著絲粒染色體、近端著絲粒染色體。共一百一十九頁共一百一十九頁染色體的超微結(jié)構(gòu)核小體是染色體包裝(bāozhuāng)的基本單位；染色體包裝的螺線管模型：共一百一十九頁核小體的結(jié)構(gòu)(jiégòu)每一個核小體核心(héxīn)包含有146bpDNA和8個組蛋白分子（2H2A，2H2B，2H3，2H4）；DNA在每個組蛋白核心外纏繞約2圈共一百一十九頁染色體的串珠狀形式(xíngshì)與螺線管結(jié)構(gòu)146bpDNA的核小體核心由54bp間隔DNA連成一條串珠狀結(jié)構(gòu)；核小體螺旋形纏繞(chánrào)形成螺線管結(jié)構(gòu)，每一周螺旋含6個核小體，因此，DNA長度縮短了6倍。共一百一十九頁共一百一十九頁從DNA到染色體的包裝(bāozhuāng)壓縮DNA鏈核小體螺線管染色單體超螺旋壓縮(yāsuō)比例：7×6×40×5=8400（1：7）（1：6）（1：40）（1：5）共一百一十九頁共一百一十九頁DNAPackaging共一百一十九頁GeneExpression共一百一十九頁3、染色體DNA結(jié)構(gòu)穩(wěn)定遺傳(yíchuán)的功能序列◆ARS(autonomousreplicatingsequence)◆CEN(centromericsequence)

Thecentromereisaspecializedregionofthechromosomethatplaysacriticalroleinensuringthecorrectdistributionofduplicatedchromosomestodaughtercellsduringmitosis

◆TEL(telomericsequence)

Thesequencesattheendsofeukaryoticchromosomes,calledtelomeres,playcriticalrolesinchromosomereplicationandmaintenance.共一百一十九頁DNA穩(wěn)定(wěndìng)遺傳的三種功能位點共一百一十九頁共一百一十九頁4、染色體組◆染色體組◆染色體組型◆染色體倍性體細胞中的一組非同源染色體，它們在形態(tài)和功能上各不相同，但是，攜帶(xiédài)著控制一種生物生長發(fā)育、遺傳和變異的全部信息，這樣的一組染色體，叫做一個染色體組。

染色體組型是指一個體細胞中全部染色體的數(shù)目、大小和形態(tài)(xíngtài)特征。

染色體倍性是指細胞中包含的染色體組數(shù)或基數(shù)。共一百一十九頁HumanmitoticchromosomesandkaryotypeChromosomepainting=multicolorFISH共一百一十九頁染色體組用符號(fúhào)“X”表示

生物體的體細胞染色體數(shù)用2n表示，無論是二倍體還是多倍體，2n只表示體細胞的染色體數(shù)，并不表示其倍性如：玉米(yùmǐ)體細胞染色體數(shù)2n=20，普通小麥體細胞染色體數(shù)2n=42，要正確表示倍性應(yīng)寫成：玉米2n=2X=20，普通小麥2n=6X=42。符號“n”和“X”的區(qū)別與聯(lián)系單倍體與一倍體含義相同嗎？共一百一十九頁AnimalChromosomeEngineering◆認識染色體與染色體組◆什么是染色體工程(gōngchéng)◆動物染色體工程的主要內(nèi)容染色體組工程個別染色體工程人工染色體共一百一十九頁騾子母馬(mǔmǎ)和公驢的后代共一百一十九頁共一百一十九頁為什么騾子不能繁殖(fánzhí)后代？

馬的染色體數(shù)是64條，驢的染色體數(shù)是62條，馬的卵子染色體數(shù)是32條，驢的精子染色體數(shù)是31條，通過精卵結(jié)合發(fā)育成的新個體——騾子的染色體數(shù)是63條。騾子的染色體聯(lián)繪紊亂(wěnluàn)因此騾子的生殖細胞不能分化發(fā)育成完整的個體。

共一百一十九頁生育(shēngyù)的概率極低騾子性成熟以后，再形成精子或卵子時，每條染色體都沒有相對應(yīng)的同源染色體進行配對，這樣每一條染色體分到哪個配子里是隨機的，在這些配子中，只有配子里的染色體完全(wánquán)來自于馬的，或來自于驢的，這樣的配子才有生育能力。

共一百一十九頁獅虎獸（liger）

雄獅和雌虎交配產(chǎn)生的后代。獅虎獸的體型比獅或虎都要大，又同時具備兩者之間的外貌特征；獅子(shīzi)與老虎相戀、懷孕的概率極低，即使在人工飼養(yǎng)的環(huán)境下，虎、獅受孕的機會也僅為1％至2％。幼獸由于先天不足等原因，成活率僅為五十萬分之一左右。據(jù)資料顯示，目前世界上存活的獅虎獸只有20只左右。

共一百一十九頁獅虎獸（liger）

共一百一十九頁獅虎獸獅虎虎獅獸共一百一十九頁動物(dòngwù)染色體工程染色體倍性改造(gǎizào)結(jié)構(gòu)改造人工染色體的利用共一百一十九頁10.1.1動物(dòngwù)的多倍體育種多倍體（polyploidy）:是指體細胞中含有三個或三個以上染色體組的個體多倍體產(chǎn)生機制：通過卵細胞第二極體的保留(bǎoliú)或受精卵早期有絲分裂的抑制而實現(xiàn)共一百一十九頁10.1動物(dòngwù)染色體倍性改造定義：染色體倍性改造工程是指有目的、有計劃(jìhuà)地增加或減少一組或幾組同源或異源染色體，以創(chuàng)造動植物新品種的一項染色體工程技術(shù)。主要包括多倍體育種和單倍體育種。共一百一十九頁整倍變化(biànhuà)：多倍體：細胞中含有三個或更多染色體組的個體單倍體：細胞中含有正常體細胞的一半染色體數(shù)非整倍體變化：染色體減少：單體（減1條）、缺體（減1對）染色體增加：三體（加1條）、四體（加1對）染色體代換：同種代換、異種代換共一百一十九頁染色體數(shù)變異一是體細胞內(nèi)以染色體組為基數(shù)進行的整倍性變化，以整倍體染色體數(shù)目變化產(chǎn)生的變異會產(chǎn)生多倍體和單倍體；另一種是染色體組內(nèi)的個別染色體數(shù)目有所增減(zēnɡjiǎn)，使細胞內(nèi)的染色體數(shù)目不是基數(shù)的的完整倍數(shù)，因此被稱為非整倍體。共一百一十九頁染色體結(jié)構(gòu)(jiégòu)變異易位：一個染色體上某一區(qū)段跟另一非同源染色體上的區(qū)段發(fā)生互換缺失：染色體的某一區(qū)段及帶有的基因一起丟失倒位：染色體上某一區(qū)段連同它帶有的基因順序(shùnxù)發(fā)生180度倒轉(zhuǎn)重復(fù)：一個染色體上增加了相同的某個區(qū)段。共一百一十九頁染色體結(jié)構(gòu)變異染色體易位：一個染色體上某一區(qū)段與另一非同源染色體上的區(qū)段發(fā)生互換。染色體缺失：染色體的某一區(qū)段及其帶有的基因一起(yīqǐ)丟失染色體倒位：染色體上某一區(qū)段連同它帶有的基因順序發(fā)生180度倒轉(zhuǎn)。染色體重復(fù)：一個染色體上增加了相同的某個區(qū)段。共一百一十九頁缺失(quēshī)：缺失一個片段。重復(fù)：某一片斷重復(fù)出現(xiàn)。倒位：片段斷裂，倒轉(zhuǎn)180度，重新(chóngxīn)連接。易位：片段斷裂，移到另一條染色體臂上。共一百一十九頁10.1.1動物(dòngwù)的多倍體育種

1．染色體加倍技術(shù)(人工誘導(dǎo))1).化學(xué)誘導(dǎo)法

有些化學(xué)物質(zhì)也可以用來阻止第二極體的排出或受精卵的有絲分裂而產(chǎn)生三倍體或四倍體。a.細胞松馳(sōnɡchí)素B：能抑制肌動蛋白聚合成微絲，從而抑制細胞質(zhì)分裂。共一百一十九頁

b.秋水仙堿：可以抑制細胞分裂中紡綞絲的形成，因而抑制有絲分裂。其它藥物：N2O、CHCIF2和聚乙二醇等。缺點：化學(xué)藥品一般比較昂貴、且具有毒性，影響處理后的胚胎發(fā)育，同時加上化學(xué)藥物誘導(dǎo)產(chǎn)生的多倍體往往是在育種上沒有價值的鑲嵌體，所以化學(xué)方法在實際中的應(yīng)用不及(bùjí)物理方法。共一百一十九頁2)生物學(xué)方法(fāngfǎ)生物學(xué)上主要通過雜交尤其是種間雜交獲得異源多倍體。Rasch等（1965）年首次證明了三倍體脊椎動物可以通過雜交產(chǎn)生，他們(tāmen)將雌核發(fā)育的二倍體帆鱂（Poeciliaformosa）與P.Vittate雜交，得到三倍體后裔。例如用雌性草魚（2n＝48）與雄性三角魴（2n＝48）雜交可以獲得子一代染色體數(shù)目為72的草魴雜種三倍體。異育銀鯽與興國紅鯉雜交獲得的復(fù)合四倍體，通過細胞方法證明其產(chǎn)生的原因是受精卵發(fā)生了兩性融合。這種不同科、屬、種之間的遠源雜交，會導(dǎo)致第二極體不排出，而產(chǎn)生多倍體。共一百一十九頁

動物通過雜交方法尤其是種間雜交獲得(huòdé)異源多倍體。種間雜交導(dǎo)致第二極體不排出。

草魚♀×♂三角(sānjiǎo)魴

(2n=48)(2n=48)

草魴雜種(3n=72)

共一百一十九頁共一百一十九頁包括溫度激變（溫度休克法）、機械創(chuàng)傷、電離輻射、離心、水靜壓法和高鹽高堿法等。⑴溫度休克法：冷休克法（0～5℃）和熱休克法（30℃）。定義：用略高于或略低于致死溫度的冷或熱休克來誘導(dǎo)三倍體或四倍體的方法。關(guān)鍵(guānjiàn)：能否成功地阻止第二次成熟分裂或第二極體的排出。要達到這一點，必須考慮溫度處理的開始時間（TA）、處理持續(xù)時間（D）和處理溫度（T）這三個因素。3).物理學(xué)方法(fāngfǎ)共一百一十九頁

目前對魚類使用溫度休克法誘導(dǎo)三倍體的工作報道較多。一般來說，冷水性魚類如鮭科種類應(yīng)用熱休克法好，而溫水性魚類用冷休克效果較好。優(yōu)點：廉價(liánjià)、易操作，是誘導(dǎo)動物細胞多倍體化的常用手段，也有利于大規(guī)模生產(chǎn)使用。共一百一十九頁

⑵水靜壓法：采用較高的水靜壓（65kg/cm2）抑制第二極體的放出或第一次卵裂來產(chǎn)生多倍體。優(yōu)點：誘導(dǎo)率高（一般在90％～100％）、處理時間短（3～5min），對受精卵損傷小、成活率高。缺點(quēdiǎn)：需要專門的設(shè)備——水壓機，成本較高，其樣品室容量有限，處理卵的量有限，所以不適于大規(guī)模生產(chǎn)的。共一百一十九頁◆Assemblyofmicrotubules●Assemblyinvitro影響(yǐngxiǎng)微管穩(wěn)定的因素共一百一十九頁2．多倍體的倍性鑒定(jiàndìng)（1）直接法1）染色體計數(shù)：是鑒定多倍體的一個準確的直接方法，但比較費時。2）DNA含量測定：細胞DNA含量測定是倍性鑒定的另一個有效的直接方法。（2）間接(jiànjiē)法1）體積測量2）蛋白質(zhì)電泳3）生化分析共一百一十九頁共一百一十九頁

核體積測量：二倍體/三倍體核體積之比為1:1.5，二倍體與四倍體的核體積之比為1:1.74。核體積測量法省時、簡單，在生產(chǎn)現(xiàn)場就能進行而廣為人們采用，但缺乏準確性，亦測不出嵌合體，往往需要校正；生化(shēnɡhuà)分析：如在關(guān)東系銀鯽中，三倍體紅血球的丙酮酸激酶的含量含著高于二倍體。共一百一十九頁

染色體計數(shù)：是鑒定多倍性倍性的一種最為準確、直接方法，但缺點是費時；

DNA含量測定：流式細胞儀。是較為先進常用的方法，其測定快速準確，并能測出嵌合體，但需要特殊(tèshū)的儀器設(shè)備。采用何種方法均有利有弊，進行鑒定主要依賴于所測樣本的發(fā)育時期、實驗要求和所具備的儀器設(shè)備條件。共一百一十九頁流式細胞儀

FlowCytometry

Flowcytometryusesanelectronicinstrumentthatpassesparticlesorcellsonebyonethroughalaserandpastsensorsthatmeasurephysicalandchemicalcharacteristicsofthoseparticlesorcells.共一百一十九頁3、優(yōu)點(yōudiǎn)與缺點a.優(yōu)點多倍體育種技術(shù)方法簡單、見效快，有潛在(qiánzài)的理論和應(yīng)用價值。許多誘導(dǎo)的多倍體動物如兩棲類、魚類、貝類等都具有良好的生存力和生長率。種間雜種生長快，可以同時具有兩個不同的種的優(yōu)良特性。利用三倍體不育的特性，將生殖腺發(fā)育消耗的能量用于動物生長，可以避免因繁殖季節(jié)及肉質(zhì)下降而延誤上市時間或影響商品價值，縮短了養(yǎng)殖周期，減少了養(yǎng)殖成本，這在鮑魚、昆蟲等方面已有應(yīng)用。某些多倍體動物肉質(zhì)量、含氧量、抗病性等經(jīng)濟性狀較二倍體好。共一百一十九頁準確的處理時間；誘導(dǎo)率、成活率及孵化率的提高；準確可靠的倍性鑒定方法(fāngfǎ)的確定。b.缺點(quēdiǎn)共一百一十九頁3.人工(réngōng)誘導(dǎo)多倍體的意義

多倍體(polyploidy):

多倍體動物(dòngwù)如兩棲類、魚類、貝類都具有良好的生存力和生長率水產(chǎn)養(yǎng)殖增強抗病能力、提高生長速度共一百一十九頁共一百一十九頁特點多倍體與二倍體相比，最顯著的特點是形態(tài)(xíngtài)上的巨大性。糖類、蛋白質(zhì)及其它產(chǎn)物的含量也有所提高。由于多倍體動物具有生長速度快、成活率高及抗病能力強等特點，所以可通過人工誘導(dǎo)多倍體來改善生物的經(jīng)濟性狀。共一百一十九頁三倍體triploid共一百一十九頁人工(réngōng)誘導(dǎo)三倍體的方法直接途徑，即用物理或化學(xué)的方法對受精卵進行處理，阻礙第二極體外排。間接(jiànjiē)途徑，即首先誘導(dǎo)獲得四倍體，待四倍體個體性成熟后再與二倍體個體自然交配，獲得三倍體。共一百一十九頁共一百一十九頁魚類三倍體育種(yùzhǒng)的意義

三倍體是非偶數(shù)染色體組，故阻礙(zǔài)了生殖細胞正常的減數(shù)分裂，結(jié)果導(dǎo)致性腺不能發(fā)育。不育的三倍體經(jīng)濟魚類因為沒有性成熟階段性腺發(fā)育的能量損耗，所以有以下優(yōu)點：避免了性腺發(fā)育階段和產(chǎn)卵季節(jié)魚肉質(zhì)量下降并延長了上市時間避免了性腺發(fā)育階段的生長停滯和死亡率增加縮短了養(yǎng)殖周期，減少了養(yǎng)殖成本并可養(yǎng)成大型個體共一百一十九頁利用三倍體魚類不育性的優(yōu)點(yōudiǎn)，人們可以達到這樣的目的：①獲得生長速度(sùdù)較快的三倍體品種，提高魚類養(yǎng)殖的經(jīng)濟效益②控制養(yǎng)殖魚類的過度繁殖和防止對天然資源的干擾共一百一十九頁湘云鯽由湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院(xuéyuàn)劉筠院士培育

共一百一十九頁共一百一十九頁TriploidGrassCarp三倍體草魚(cǎoyú)共一百一十九頁3．動物多倍體育種(yùzhǒng)的意義1）多數(shù)具有良好的生長率2）低等動物的種間雜交優(yōu)勢(yōushì)非常明顯3）巨大性4）育性低(四倍體可育)共一百一十九頁10.1.2動物(dòngwù)的單倍體育種（一）、人工單性生殖（二）、人工誘導(dǎo)(yòudǎo)雌核發(fā)育的方法（三）、雌核發(fā)育的鑒定共一百一十九頁（一）、人工單性生殖1.雌核發(fā)育：（gynogenesis）是單性生殖的一種，指卵子依靠自己的細胞核發(fā)育成個體的生殖行為。

同種或異種精子進入(jìnrù)卵內(nèi)只起刺激卵子發(fā)育的作用，不形成雄性原核和提供遺傳物質(zhì)，其子代的遺傳物質(zhì)完全來自雌核，只具有母本的性狀。共一百一十九頁自然界中一些無脊椎動物和魚類等存在。人工誘導(dǎo)：雌核發(fā)育是指用經(jīng)過紫外線、X射線或γ射線等處理后的失活精子來“受精”，再在適當時間施以冷、熱、高壓等物理處理，以抑制第二極體的排出，使卵子發(fā)育為正常(zhèngcháng)的二倍體動物。共一百一十九頁凡雌核發(fā)育的個體，都具有純母系的單倍體染色體組，依賴于卵子染色體組的二倍體化。1911年，赫特威氏就第一個成功地人工消除了精子染色體活性，并發(fā)現(xiàn)了“赫特威氏效應(yīng)”。赫特威氏效應(yīng)指只有在適當?shù)母咻椛?fúshè)劑量下，才能導(dǎo)致精子染色體完全失活，屆時精子雖能穿入卵內(nèi)，卻只能起到激活卵球啟動發(fā)育的作用。共一百一十九頁抑制(yìzhì)第二極體外排抑制(yìzhì)第一次卵裂精子遺傳物質(zhì)失活共一百一十九頁Haploidembryosaregeneratedby'mock-fertilizing'eggswithUV-irradiatedsperm(whichcannotcontributegenetically),andcansurviveafewdays.Haploidscanberescuedbysuppressingformationofthepolarbodywithpressuretreatmentshortlyafterfertilization.

抑制(yìzhì)第二極體外排共一百一十九頁朱

洗

細胞學(xué)家。浙江臨海人。1931年獲法國國家博士學(xué)位。中國科學(xué)院實驗生物研究所研究員、所長。長期從事兩棲類、魚類、家蠶等動物卵子成熟、受精等研究。1961年使人工雌核發(fā)育的雌蟾蜍與雄蟾蜍交配，繁殖出沒有外祖父的蟾蜍，證明了單性生殖(shēngzhí)的高等動物仍保有傳代的能力。共一百一十九頁2.雄核發(fā)育：用經(jīng)過紫外線、X線或ｒ線處理的卵子與正常的精子受精，再在適當時間施以冷、熱或高壓等物理處理，使進入卵子內(nèi)的精子染色體加倍，而發(fā)育成完全為父本性狀的二倍體。定義：遺傳失活的卵子與精子結(jié)合，發(fā)育成只有父本染色體個體的一種特殊生殖(shēngzhí)方式。共一百一十九頁一、人工(réngōng)誘導(dǎo)雌核發(fā)育的方法共一百一十九頁物理方法：采用射線包括γ射線、X射線（效果較好）和紫外線（效果較差）等處理精子使精子的遺傳物質(zhì)失活。

化學(xué)方法：采用化學(xué)物質(zhì)如甲苯胺藍、乙烯(yǐxī)尿素和二甲基硫酸等消除精子染色體遺傳活性的方法。

顯微手術(shù)法：采用顯微操作的方法直接去除受精卵中雄性原核的方法。1.精子(jīngzǐ)遺傳物質(zhì)的失活共一百一十九頁阻止第一次有絲分裂或第二極體的外排；利用溫度、壓力或化學(xué)方法(fāngfǎ)，如冷休克、熱休克、流體靜水壓、細胞松馳素B、聚乙二醇處理等。2.雌核染色體數(shù)目減少(jiǎnshǎo)的阻止共一百一十九頁首先將兩個不同品系的近交系進行雜交。交配后，在精核(jīnɡhé)與卵核尚未融合之前，從母鼠子宮內(nèi)沖取受精卵，并用極細的吸管將精核(jīnɡhé)去掉。在細胞松馳素B的處理下使雌核加倍，形成二倍體細胞。二倍體細胞在體外培養(yǎng)到囊胚期后，移植到養(yǎng)母的子宮內(nèi)，使胚胎繼續(xù)發(fā)育，直至出生。共一百一十九頁二、雌核發(fā)育的鑒別(jiànbié)共一百一十九頁鑒別雌核發(fā)育的個體，通常以顏色、形態(tài)以及生化等方面的指標為依據(jù)。也可以(kěyǐ)通過細胞學(xué)的研究，如若是雌核發(fā)育，其囊胚細胞中只出現(xiàn)一套來自雌核的染色體，否則雌核和雄核染色體各占一半，得到的是雜交種。用遺傳標志的方法來鑒別雄核發(fā)育的二倍體化，即由第一次有絲分裂的阻礙，還是由保留極體而來。假如二倍體源自第一次有絲分裂的抑制，雜合雌性個體的子代應(yīng)該都是純合型；而如果是通過阻止第二極體的外排產(chǎn)生的雌核發(fā)育個體，則子代的情況取決于著絲點與基因間的距離。在著絲點與基因距離遠離時，將明顯增加雜合型子代的比例。共一百一十九頁三、雌核發(fā)育的意義(yìyì)共一百一十九頁為生產(chǎn)單性種群提供了可能。能迅速地產(chǎn)生同源型二倍體。提供某些致死突變種的生物品質(zhì)(pǐnzhì)。在農(nóng)牧漁業(yè)生產(chǎn)中，可人工控制性別繁殖。廣泛地用于進行基因-著絲點的定位研究?？衫卯a(chǎn)生新的純系來篩選除去有害的等位基因。共一百一十九頁四、人工(réngōng)誘導(dǎo)雄核發(fā)育共一百一十九頁雄核發(fā)育（androgenesis）是指因經(jīng)過紫外線、X射線或γ射線處理的卵子與正常的精子受精，再在適當時間施以冷、熱或高壓等物理處理，使進入卵子內(nèi)的精子染色體加倍，而發(fā)育為完全為父本性狀的二倍體。雄核發(fā)育的個體的生存率非常低，這是由于精子基因型的純合性、卵子由于照射的損傷和阻止第一次卵裂處理的損傷等原因(yuányīn)造成的。但是仍舊在遺傳學(xué)基礎(chǔ)理論和育種中都有一定的價值，利用雄核生殖的精子可用于冷凍基因庫，保存種質(zhì)資源，對基因世代克隆系的建立，不同種間核質(zhì)的雜種的產(chǎn)生和YY雄性引起的性別控制等也有特殊的意義。共一百一十九頁第三節(jié)染色體顯微操作技術(shù)染色體分離(fēnlí)染色體微切割共一百一十九頁1.原理：由于熒光染料Hoechst只對A-T特異性染色，而染料Chromomycin只對G-C特異性染色。染色體上DNA的堿基序列是不同的，因此這些特異性染料和不同染色體上DNA結(jié)合的量和比例是不同的。結(jié)合這些染料后，再經(jīng)激光照射，染色體就會呈現(xiàn)不同的熒光帶。將特定染色體發(fā)出(fāchū)的熒光波長輸入計算機，通過計算機控制就可將發(fā)出(fāchū)同一波長的染色體收集在一起，從而實現(xiàn)染色體的分離。一、

染色體分離(fēnlí)共一百一十九頁細胞分裂同步處理染色體的熒光色素(sèsù)染色染色體分離2.染色體分離(fēnlí)的具體步驟共一百一十九頁共一百一十九頁微細玻璃針切割法：采用特細的玻璃針（尖端直徑約為0.17μm）在倒置顯微鏡下對目的基因所在染色體區(qū)段進行切割與分離。顯微激光切割法：將染色體標本在底部貼有特殊薄膜的培養(yǎng)皿上制作，利用激光共聚焦掃描顯微系統(tǒng)(xìtǒng)，依靠高能量激光照射非選擇細胞或染色體，使其受熱蒸發(fā)，最后只留下目的染色體。二、

染色體微切割(qiēgē)共一百一十九頁第四節(jié)染色體轉(zhuǎn)移(zhuǎnyí)技術(shù)微細胞介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移法染色體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移法共一百一十九頁將同特定(tèdìng)基因表達有關(guān)的染色體或染色體片段轉(zhuǎn)入受體細胞，使該基因得以表達，并能在細胞分裂中一代又一代地傳遞下去。該技術(shù)稱為染色體轉(zhuǎn)移（或染色體轉(zhuǎn)導(dǎo)）。微細胞介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移法（Microcellmediatedgenetransfer，MMGT）染色體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移法（Chromosomemediatedgenetransfer，CMGT）共一百一十九頁一、微細胞(xìbāo)介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移法微細胞（或微核體）：是指含有一條或幾條染色體，外有一薄層細胞質(zhì)和一個完整質(zhì)膜的核質(zhì)體。供體：微細胞優(yōu)點：簡化(jiǎnhuà)供體基因的表達、對受體細胞影響小、微核染色體穩(wěn)定共一百一十九頁微細胞(xìbāo)制備微細胞融合共一百一十九頁1.微細胞(xìbāo)的制備用化學(xué)藥劑和（如秋水仙素）阻斷供體細胞的有絲分裂，使染色體停滯在有絲分裂中期(zhōngqī)，從而在染色體周圍逐漸形成核膜而成為眾多的微核。然后在細胞松弛素B的作用下使微核逐漸突出細胞膜外。最后經(jīng)過離心獲得含有一個微核、四周有一薄層細胞質(zhì)和質(zhì)膜界限的微細胞。共一百一十九頁2.微細胞(xìbāo)的融合制備的微細胞只能存活幾個小時，但經(jīng)融合可使其成為能夠存活的整體細胞。常采用PEG作為細胞融合劑。最好選用帶有營養(yǎng)缺陷標志(biāozhì)的受體細胞。由于微細胞的染色體含有互補的原養(yǎng)型基因，微細胞與受體細胞形成的雜合細胞即可在特定的選擇性培養(yǎng)基中生長而被篩選出來。共一百一十九頁染色體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移法：是指分離得到相應(yīng)的染色體后轉(zhuǎn)入受體細胞的一種技術(shù)?；静襟E：⑴誘發(fā)細胞同步分裂；⑵阻斷(zǔduàn)細胞分裂于中期；⑶破碎細胞；⑷離心收集中期染色體；⑸通過適當?shù)姆诸愞D(zhuǎn)移到受體細胞中去。二、染色體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移(zhuǎnyí)法共一百一十九頁細胞(xìbāo)同步化與染色體的分離染色體的轉(zhuǎn)移受體細胞的分離與鑒定染色體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移(zhuǎnyí)的過程共一百一十九頁1.細胞(xìbāo)同步化與染色體的分離用秋水仙素及合適的酶處理對數(shù)生長期的細胞離心收集中期相細胞沉淀(chéndiàn)洗滌數(shù)次在中性緩沖液中培育用注射針噴射細胞，使染色體釋放離心收集染色體沉淀蔗糖梯度離心或用流式細胞測量儀分離單條染色體共一百一十九頁2.染色體的轉(zhuǎn)移(zhuǎnyí)染色體可以通過細胞的吞噬作用而進入受體細胞。一般先采用磷酸鈣和染色體一起沉淀(chéndiàn)，再用二甲基亞砜處理受體細胞，或采用卵磷脂與膽固醇制成的脂質(zhì)體將染色體轉(zhuǎn)入受體細胞。共一百一十九頁分離：利用(lìyòng)選擇性培養(yǎng)基進行篩選鑒定：染色體組型分析同工酶分析其他方法3.導(dǎo)入基因(jīyīn)的受體細胞的分離與鑒定共一百一十九頁第五節(jié)人工(réngōng)染色體共一百一十九頁染色體要確保(quèbǎo)在細胞分裂中保持穩(wěn)定，必須要能夠自我復(fù)制和向子細胞中平均分配。它需要3個關(guān)鍵序列，包括自主復(fù)制DNA序列（autonomouslyreplicatingsequence，ARS）、著絲粒DNA序列（centromereDNAsequence，CEN）和端粒DNA序列（telomereDNAsequence,TEL）。

共一百一十九頁將3個關(guān)鍵序列用分子生物學(xué)方法拼接起來(qǐlái)就得到人造微小染色體（artificialminichromosome），在大片段DNA分子的克隆、基因組分析、基因功能鑒定、基因治療以及研究染色體結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系等研究中得到了廣泛的應(yīng)用，具有極為重要的價值。目前，正在研究或應(yīng)用的有：酵母人工染色體（yeastartificialchromosome,YAC）細菌人工染色體（bacterialartificialchromosome,BAC）哺乳動物人工染色體（mammalianartificialchromosome）共一百一十九頁基于ARS、CEN、TEL是線性染色體穩(wěn)定的功能序列，人們利用這些序列構(gòu)建載體，重組后的DNA以線性狀態(tài)存在，這樣不僅穩(wěn)定，而且大大提高了插入外源基因的能力，并且可以像天然染色體一樣在寄主細胞中穩(wěn)定復(fù)制和遺傳，稱為人工(réngōng)染色體。如利用從酵母染色體上分離的ARS、CEN、TEL序列構(gòu)建載體，然后用這種載體構(gòu)建的染色體即稱為酵母人工染色體。共一百一十九頁

共一百一十九頁

共一百一十九頁共一百一十九頁【復(fù)習思考題】經(jīng)常采用的人工誘導(dǎo)多倍體形成的手段有哪些？要達到實驗條件下二倍體雌核發(fā)育目的需要解決哪些問題？選擇、判斷題：1911年，人工條件下，

第一個在適當?shù)母咻椛鋭┝肯鲁晒Φ厝斯は司尤旧w活性，導(dǎo)致精子染色體完全失活。A.赫特威氏B.沃克C.克拉克D.摩爾根多倍體的鑒定不宜采取的方法是

。A.核體積測量B.染色體計數(shù)C.血平板計數(shù)D.利用血液成分、酶的含量等進行生化分析溫度(wēndù)休克法包括冷休克法（0～5度）和熱休克法（30度左右）兩種，即用略高于或略低于最適溫度(wēndù)的冷或熱休克來誘導(dǎo)三倍體或四倍體的方法。測定細胞核體積對細胞多倍體進行測定屬于直接法。

共一百一十九頁10.3人工(réngōng)染色體

人工染色體酵母人工染色體細菌(xìjūn)人工染色體哺乳類人工染色體人工染色體的應(yīng)用共一百一十九頁人工(réngōng)染色體

染色體要確保在細胞分裂中保持穩(wěn)定性，必須要能夠自我復(fù)制和向子細胞中平均分配，需要3個關(guān)鍵序列：1.自主(zìzhǔ)復(fù)制DNA序列（ARS）

是DNA復(fù)制的起點，確保染色體能夠開始自我復(fù)制。2.著絲粒DNA序列（CEN）

確保染色體在細胞分裂時能平均分配到子細胞中。

3.端粒DNA序列（TEL）

使DNA能結(jié)束復(fù)制，確保染色體的獨立性和穩(wěn)定性。共一百一十九頁人工(réngōng)染色體

artificialchromosome

定義：人工構(gòu)建的含有(hányǒu)復(fù)制起始點、著絲粒和端粒三個關(guān)鍵序列