2-1 免疫組織化學(xué)技術(shù)課件

第四章、免疫組織化學(xué)技術(shù)Immunohistochemistry吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)系李樹(shù)蕾2012-11-62-1免疫組織化學(xué)技術(shù)概念：應(yīng)用免疫學(xué)及組織化學(xué)原理，對(duì)組織切片或細(xì)胞標(biāo)本中的某些多肽和蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)進(jìn)行原位定性、定位或定量研究的技術(shù)稱(chēng)為免疫組織化學(xué)技術(shù)或免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)。基本過(guò)程：被檢抗原/半抗原提取→免疫動(dòng)物→特異性抗體→標(biāo)記抗體→抗原抗體反應(yīng)部位出現(xiàn)有色沉淀能與對(duì)應(yīng)抗體結(jié)合出現(xiàn)抗原-抗體反應(yīng)、又不能單獨(dú)激發(fā)人或動(dòng)物體產(chǎn)生抗體的抗原。它只有反應(yīng)原性，不具免疫原性，又稱(chēng)不完全抗原。大多數(shù)多糖和所有的類(lèi)脂都屬于半抗原。2-1免疫組織化學(xué)技術(shù)免疫酶組織化學(xué)免疫熒光組織化學(xué)免疫膠體金組織化學(xué)親和免疫組織化學(xué)（抗原信號(hào)放大系統(tǒng)）優(yōu)點(diǎn)：特異性強(qiáng)，敏感度高，應(yīng)用廣泛。2-1免疫組織化學(xué)技術(shù)第一節(jié)免疫組織化學(xué)基本原理一、直接法用酶或其它標(biāo)記物標(biāo)記的特異性抗體直接與標(biāo)本中的相應(yīng)抗原結(jié)合，再與酶的底物作用產(chǎn)生有色產(chǎn)物沉積，在抗原抗體反應(yīng)的部位即可檢測(cè)。

2-1免疫組織化學(xué)技術(shù)優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單快速，特異性強(qiáng)，非特異性反應(yīng)低；缺點(diǎn)：敏感性差；抗原量要求高；很難獲得各種市售標(biāo)記抗體。（腫瘤蛋白標(biāo)記物：低豐度蛋白）在免疫熒光和免疫酶技術(shù)中因材料處理不當(dāng)或用量不當(dāng)產(chǎn)生的背景著色反應(yīng)。2-1免疫組織化學(xué)技術(shù)

第一抗體（兔）不標(biāo)記，使用與一抗種屬相同抗體的Fc段（有種屬特異性）作為抗原免疫動(dòng)物（羊），制備抗抗體，即第二抗體（羊抗兔），并標(biāo)記第二抗體。二、間接法染色時(shí)，順次以第一抗體和標(biāo)記的第二抗體處理標(biāo)本，在抗原存在部位形成抗原-第一抗體-標(biāo)記第二抗體復(fù)合物，以達(dá)到檢測(cè)該抗原的目的。2-1免疫組織化學(xué)技術(shù)優(yōu)點(diǎn)：間接法因第二抗體的放大作用敏感性大大增高（放大原理=抗原：抗體1：6）；缺點(diǎn)：可能出現(xiàn)非特異性反應(yīng)；子宮內(nèi)膜巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子MIF2-1免疫組織化學(xué)技術(shù)三、親和免疫組織化學(xué)(一)親和素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物法(avidin-biotin-peroxidasecomplexmethod，ABC法)特點(diǎn):以親和素作為“橋”將生物素結(jié)合的酶和生物素化的抗體連接起來(lái)，使抗原與抗體反應(yīng)信號(hào)放大，以增加敏感性。

1.原理:生物素

(biotin)為含硫的雜環(huán)單羧酸，生物素分子量為244.31，pI為3.5，咪唑酮環(huán)（又稱(chēng)Ureido環(huán)）(I環(huán))是與親合素結(jié)合的主要部位；Ⅱ環(huán)為噻吩環(huán)有一個(gè)戊酸側(cè)鏈，末端羧基是標(biāo)記抗體和酶的唯一結(jié)構(gòu)。2-1免疫組織化學(xué)技術(shù)親和素

(avidin)又稱(chēng)抗生物素蛋白，是一種糖蛋白，分子量為6.8KD，pI10～10.5；在pH9～13緩沖液中性質(zhì)均穩(wěn)定。天然親合素為堿性蛋白，由4個(gè)相同的亞單位構(gòu)成4聚體；每個(gè)親合素亞單位通過(guò)其結(jié)構(gòu)中的色氨酸殘基與生物素中的Ureido環(huán)（I環(huán)）結(jié)合。因此，1個(gè)親合素分子存在4個(gè)與生物素分子結(jié)合位點(diǎn)2-1免疫組織化學(xué)技術(shù)ABC法2-1免疫組織化學(xué)技術(shù)鏈霉親和素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物法SABC法原理2-1免疫組織化學(xué)技術(shù)2.免疫組織化學(xué)酶類(lèi)標(biāo)記物

免疫組化標(biāo)記物的酶以共價(jià)鍵結(jié)合在抗體上，SABC法則采用生物素-親和素系統(tǒng)，制成酶標(biāo)抗體，再借助酶對(duì)底物的特異催化作用，生成有色不溶沉淀，在光鏡下進(jìn)行各種抗原成分觀察。常用酶類(lèi)：辣根過(guò)氧化物酶(Horseradishperoxidase，HRP),

堿性磷酸酶(Alkalinephosphatase，AP)2-1免疫組織化學(xué)技術(shù)用于標(biāo)記的酶的特性酶催化反應(yīng)形成的產(chǎn)物易于在光鏡下觀察酶反應(yīng)終產(chǎn)物是穩(wěn)定的沉淀，不會(huì)從酶活性部位向四周彌散而影響組織學(xué)定位較易獲得純的酶分子中性PH值時(shí)，酶分子穩(wěn)定酶連接在抗體上，二者活性均不受影響2-1免疫組織化學(xué)技術(shù)HRP底物:過(guò)氧化物：過(guò)氧化氫供氫體：二氨基聯(lián)苯胺(Diaminobenzidine,DAB)3-氨基-9乙基咔唑(3-amino-9-ethylcarbozole,AEC)DAB+H2O2棕色；

AEC+H2O2紫紅色AP磷酸酯水解酶，溴氯羥吲哚磷酸鹽(底物）/硝基藍(lán)四唑(BCIP/NBT)

溴氯羥吲哚磷酸鹽(底物）/硝基四紫唑

(BCIP/INT)

NBT/BCIP藍(lán)紫色

INT/BCIP棕紅色或橘黃色

HRPHRPAPAP2-1免疫組織化學(xué)技術(shù)ABC法的優(yōu)點(diǎn)：敏感性更高ABC法的缺點(diǎn)：①親和素(雞蛋白)中含有10%糖類(lèi)，導(dǎo)致背景著色②親和素的等電點(diǎn)約10左右，帶較多的負(fù)電荷，導(dǎo)致纖維組織著色。③內(nèi)源性生物素導(dǎo)致背景著色④親和素中有4個(gè)結(jié)合點(diǎn)，其中一半與連接抗體結(jié)合，另一半與復(fù)合物結(jié)合，可降低其敏感性。2-1免疫組織化學(xué)技術(shù)

(二)鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化酶法

（Streptavidin-peroxidasemethod，SP法）

鏈霉親和素替代ABC法中的親和素-生物素復(fù)合物，形成鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化酶法，SP法2-1免疫組織化學(xué)技術(shù)Ag1Ab2AbDABABCmethodDABSPmethodA-B-ComplexSa-P-ComplexPABPSa放大系統(tǒng)→←2-1免疫組織化學(xué)技術(shù)鏈霉親和素SA（鏈霉菌抗生物素蛋白）約6.5KD，由4條相同肽鏈構(gòu)成，每條肽鏈可結(jié)合1個(gè)生物素分子。每個(gè)SA有4個(gè)生物素結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)合常數(shù)與A相同為1015mol/L，約為抗原抗體間ka（105～1011mol/L)的1萬(wàn)倍以上。SA最高的活性可達(dá)18u，較A高（15u）；SA的四個(gè)亞基可以全部和二抗上的生物素結(jié)合。鏈霉親和素組織穿透性強(qiáng)，反應(yīng)速度快。等電點(diǎn)為5.5~6.7，接近中性，所帶的負(fù)電荷少；鏈霉親和素不含糖基。SP法的優(yōu)點(diǎn)2-1免疫組織化學(xué)技術(shù)第二節(jié)、免疫組織化學(xué)染色步驟一、免疫組化染色步驟（一）石蠟切片1.烤片：58℃2-６h；目的：帶蠟的組織切片牢固黏在載玻片上注意：高溫加速組織中抗原氧化2.脫臘和水化：二甲苯Ⅰ、Ⅱ中浸泡15min脫蠟→100﹪酒精Ⅰ、Ⅱ中分別浸泡5min→95﹪、90﹪、80﹪、70﹪酒精各浸泡2min→PBS洗3次×3min,置蒸餾水中待用；2-1免疫組織化學(xué)技術(shù)3.抗原修復(fù)：甲醛形成醛鍵、羧甲基等封閉部分抗原決定簇；蛋白分子交聯(lián)隱蔽了抗原決定簇。

加熱修復(fù)：①高壓修復(fù)：pH6.0的0.1mol／L檸檬酸緩沖液高壓鍋內(nèi)煮沸，切片置于其中,高壓修復(fù)1.5min，室溫冷卻，蒸餾水和PBS各沖洗2次×3min；注意：時(shí)間過(guò)長(zhǎng)背景加深；新鮮檸檬酸緩沖液；緩沖液足量②微波修復(fù)：pH6.0的0.1mol／L檸檬酸緩沖液微波煮沸，切片置于其中，中高檔微波處理15-20min，室溫冷卻，蒸餾水和PBS各沖洗2次×3min；③蒸汽修復(fù):

內(nèi)，盛自來(lái)水的鋁制容器加熱至水沸騰,放入含pH6.0的0.1mol／L檸檬酸緩沖液和切片的蓋容器.繼續(xù)沸騰10-15min,室溫冷卻.(強(qiáng)烈推薦)2-1免疫組織化學(xué)技術(shù)胰蛋白酶消化：細(xì)胞內(nèi)抗原

0.1%胰酶溶液（0.1%氯化鈣pH7.8），37℃，15-30min，,PBS沖洗3次×3min；胃蛋白酶消化：細(xì)胞間質(zhì)抗原0.4%，37℃，30-180min

注意:酶溶液新鮮配制;或分裝凍存;要預(yù)熱建議：仔細(xì)閱讀抗體說(shuō)明書(shū)，是否需要進(jìn)行抗原修復(fù)，選擇合適的抗原修復(fù)方法和時(shí)間。單一方法無(wú)效,可聯(lián)合應(yīng)用,適合于免疫組化雙重標(biāo)記或多重標(biāo)記.

2-1免疫組織化學(xué)技術(shù)4.細(xì)胞膜打孔0.1﹪-0.3％tritonX-100浸泡，RT，25min，PBS沖洗3次×5min

原理:tritonX-100為脂溶性去垢劑注意：檢測(cè)膜抗原可省略此步驟

使抗體滲透進(jìn)入細(xì)胞的方法（1）TritonX-100：使細(xì)胞膜脂類(lèi)溶解（2）Np-40：使細(xì)胞膜蛋白質(zhì)破環(huán)（3）Saponin皂苷：使細(xì)胞膜膽固醇溶解2-1免疫組織化學(xué)技術(shù)5.滅活內(nèi)源性酶及封閉內(nèi)源性生物素（1）滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶：3﹪甲醇-H2O2浸泡，RT，30min，PBS沖洗3次×5min；（2）滅活堿性磷酸酶：以每毫升24mg左旋咪唑加入底物液中，保持PH7.6－8.2。酸性磷酸酶用0.05M酒石酸抑制。（3）滅活內(nèi)源性生物素：加生物素阻斷劑A液（0.01%親和素）1滴，RT，10min，PBS沖洗3次×2min；加B液（生物素）1滴，RT，10分鐘，PBS沖洗3次×2min；此步驟適用于富含生物素的組織（如腦和胚胎組織）2-1免疫組織化學(xué)技術(shù)6.非免疫血清封閉：原因：富含正電荷的膠原和結(jié)締組織吸附抗體目的：吸附帶正電荷的蛋白操作：與二抗種屬相同的非免疫血清或2-5﹪BSA（牛血清白蛋白），RT，10min，不洗；

注意：結(jié)合不牢固，不能沖洗

建議：可試用不同動(dòng)物的非免疫血清（盡量不要與一抗種屬相同）2-1免疫組織化學(xué)技術(shù)7.加入一抗4℃過(guò)夜，或37℃孵育1-2h，PBS沖洗3次×5min多克隆抗體兔多抗價(jià)格低，效價(jià)高非特異性反應(yīng)高，效價(jià)不穩(wěn)定單克隆抗體小鼠單抗大鼠單抗兔單抗特異性強(qiáng)，無(wú)交叉反應(yīng)，效價(jià)穩(wěn)定價(jià)格高，效價(jià)低濃縮型抗體摸索效價(jià)市售抗體稀釋液，或含1-3%非免疫血清PBS即用型抗體無(wú)需摸索效價(jià)2-1免疫組織化學(xué)技術(shù)8.加入生物素標(biāo)記IgG(二抗），RT,10分鐘，PBS沖洗3次×5min；注意：與一抗匹配9.加入鏈霉親和素-生物素-辣根過(guò)氧化物酶/堿性磷酸酶（SABC-POD，或SABC-AP），RT,10min，PBS沖洗4次×5min2-1免疫組織化學(xué)技術(shù)10.AEC或DAB（或NBT/BCIP）顯色顯色過(guò)程為2～10min（鏡下監(jiān)控，AEC不能長(zhǎng)期保存），蒸餾水或自來(lái)水沖洗；11.AEC和NBT/BCIP顯色直接用水溶性封片劑封片。

12.蘇木精復(fù)染（10秒鐘），自來(lái)水沖洗返藍(lán)13.蘇木精染色則經(jīng)過(guò)脫水透明，用中性樹(shù)膠封片。14.鏡下檢查結(jié)果2-1免疫組織化學(xué)技術(shù)DAB顯色2-