消毒和滅菌效果的評(píng)價(jià)方法和標(biāo)準(zhǔn)

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Thisdocumentisforreferenceonly-rar21year.March消毒和滅菌效果的評(píng)價(jià)方法和標(biāo)準(zhǔn).(總25頁(yè))消毒與滅菌效果的評(píng)價(jià)方法與標(biāo)準(zhǔn)第一篇壓力蒸汽滅菌效果評(píng)價(jià)方法與標(biāo)準(zhǔn)

1主題內(nèi)容與適用范圍

本方法規(guī)定了壓力蒸汽滅菌技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)及其評(píng)價(jià)滅菌效果的檢測(cè)方法。

本方法適用于對(duì)壓力蒸汽滅菌設(shè)備滅菌效果的評(píng)價(jià)。

2試劑

本標(biāo)準(zhǔn)所用試劑，凡未說(shuō)明規(guī)格者，均為分析純（AR），水為蒸餾水。

2．1蛋白胨。

2．2葡萄糖。

2．3溴甲酚紫酒精溶液：取溴甲酚紫2．0g，溶于100mL95％乙醇中。

2．4溴甲酚紫蛋白胨水培養(yǎng)基配制：蛋白胨10．0g，葡萄糖5．0g，溶于1000mL蒸餾水中，調(diào)pH值至7．0～7．2，然后再加2％溴甲酚紫酒精溶液0．6mL，搖勻后，按5mL/管，分裝包口，置壓力蒸汽滅菌器中，于115℃滅菌40min后備用。

3指示菌

嗜熱脂肪桿菌芽胞（ATCC7953或SSIK31）菌片，含菌量為5×105～5×106cfu/片，121壓力蒸汽滅菌器壓力，MPa/cm2溫度℃滅菌時(shí)間,min下排氣式1154012130預(yù)真空式1344-6

國(guó)家技術(shù)監(jiān)督局1995-12-15批準(zhǔn)1996-07-01實(shí)施

6檢測(cè)方法

6．1生物學(xué)指標(biāo)（用作壓力蒸汽滅菌設(shè)備滅菌效果的依據(jù)）。

6．1．1將嗜熱脂肪桿菌芽胞菌片兩個(gè)分別放入滅菌小紙袋內(nèi)，置于標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)包中心部位。

6．1．2滅菌柜室內(nèi)，上、中層中央和排氣口處各放置一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)包（由3件平紋長(zhǎng)袖手術(shù)衣，4塊小手術(shù)巾，2塊中手術(shù)巾，1塊大手術(shù)巾，30塊10cm×10cm、8層紗布敷料包裹成25cm×30cm×30cm大?。?。手提壓力蒸汽滅菌器用通氣貯物盒（22cm×13cm×6cm）代替標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)包，盒內(nèi)盛滿中試管，指示菌片放于中心部位兩只滅菌試管內(nèi)（試管口用滅菌牛皮紙包封），將盒平放于手提壓力蒸汽滅菌器底部。

6．1．3經(jīng)一個(gè)滅菌周期后，在無(wú)菌條件下，取出標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)包或通氣貯物盒中的指示菌片，投入溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中，56℃

第二篇紫外線表面消毒效果評(píng)價(jià)方法與標(biāo)準(zhǔn)

8主題內(nèi)容與適用范圍

本方法規(guī)定了物體表面消毒用紫外線的波長(zhǎng)、強(qiáng)度及評(píng)價(jià)其消毒效果的物理學(xué)指標(biāo)和生物學(xué)檢測(cè)方法。

本方法適用于紫外線直接照射到的物體表面消毒效果評(píng)價(jià)。

9指示菌

9．1大腸桿菌（8099或ATCC25922）。

9．2枯草桿菌黑色變種芽胞（ATCC9372）。

10物理學(xué)指標(biāo)

10．1在電壓220V時(shí)，普通30W直管型紫外線燈，在室溫為20～25℃的使用情況下，253．7nm紫外線輻射強(qiáng)度（垂直1m處）應(yīng)≥70μW/cm2。

10．2在電壓220V時(shí)，高強(qiáng)度紫外線燈，在室溫為20～25C的使用情況下，253．7nm紫外線輻射強(qiáng)度（垂直1m處）應(yīng)≥200μW/cm2。

10．3照射劑量按式（1）計(jì)算：

劑量（μW·s/cm2）＝強(qiáng)度（μW/cm2）×?xí)r間（s）………（1）

11檢測(cè)方法

11．1物理學(xué)檢測(cè)方法

11．1．1燈管的紫外線強(qiáng)度（μW/cm2）用中心波長(zhǎng)為253．7nm的紫外線強(qiáng)度測(cè)定儀（標(biāo)定有效期內(nèi)），在燈管垂直位置處測(cè)定。

11．1．2在實(shí)際應(yīng)用中消毒表面的照射強(qiáng)度應(yīng)以燈管與消毒對(duì)象的實(shí)際距離測(cè)定。

11．1．3表面消毒接受的照射劑量，應(yīng)達(dá)殺滅目標(biāo)微生物所需。對(duì)大腸桿菌，照射劑量應(yīng)達(dá)到20000μW·s/cm2，對(duì)枯草桿菌黑色變種芽胞應(yīng)達(dá)到100000μW·s/cm2。

11．2生物學(xué)檢測(cè)方法

11．2．1采用載體定量消毒試驗(yàn)。載體制備按本標(biāo)準(zhǔn)附錄C進(jìn)行。

11．2．2開(kāi)啟紫外線燈5min后，將8個(gè)染菌玻片平放于滅菌器皿中，水平放于適當(dāng)距離照射，于4個(gè)不同間隔時(shí)間各取出2個(gè)染菌玻片，分別投入2個(gè)盛有5mL洗脫液（1％吐溫80，1％蛋白胨生理鹽水）試管中，振打80次。

11．2．3經(jīng)適當(dāng)稀釋后，取0．5mL洗脫液，作平板傾注，每個(gè)染菌玻片接種兩個(gè)，放37℃培養(yǎng)48h作活菌計(jì)數(shù)。

11．2．4陽(yáng)性對(duì)照，除不作照射處理外，取2個(gè)染菌玻片分別投入2個(gè)盛有5mL洗脫液中振打80次，余按4．2．3進(jìn)行。

11．2．5計(jì)算殺滅率

12判定標(biāo)準(zhǔn)

12．1對(duì)指示菌殺滅率≥99．9％判為消毒合格。

12．2達(dá)物理學(xué)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，作為消毒合格的參考標(biāo)準(zhǔn)。

第三篇液體消毒劑消毒效果評(píng)價(jià)方法與標(biāo)準(zhǔn)

13主題內(nèi)容與適用范圍

本方法具體規(guī)定了消毒劑消毒效果生物學(xué)檢測(cè)方法及其評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。

本方法適用于消毒劑對(duì)各種物體的消毒效果評(píng)價(jià)。

14理化指標(biāo)

將消毒劑置20±水浴中，測(cè)定在使用濃度下殺滅指示微生物達(dá)到消毒或滅菌所需的最短時(shí)間（min）。

15指示微生物

15．1細(xì)菌

15．1．1細(xì)菌繁殖體：金黃色葡萄球菌（ATCC6538）、大腸桿菌（8099或ATCC25922）。

15．1．2細(xì)菌芽胞：枯草桿菌黑色變種芽胞（ATCC9732）。

15．2真菌：白色念珠菌（ATCC10231）。

15．3乙型肝炎表面抗原：純化抗原（1．0mg/mL）。

16檢測(cè)方法

16．1中和試驗(yàn)（見(jiàn)附錄A）。

16．2消毒劑定性消毒試驗(yàn)（見(jiàn)附錄B）。

16．3消毒劑定量消毒試驗(yàn)（見(jiàn)附錄C）。

16．4消毒劑殺菌能量試驗(yàn)（見(jiàn)附錄D）。

16．5乙型肝炎表面抗原（HBsAg）抗原性破壞試驗(yàn)（見(jiàn)附錄E）。

17消毒效果評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

17．1對(duì)細(xì)菌和真菌的殺滅率≥99．9％，對(duì)HBsAg，將檢測(cè)方法靈敏度104倍或5×104倍（載體試驗(yàn)）的HBsAg抗原性破壞，可判為消毒合格。

17．2對(duì)枯草桿菌黑色變種芽胞全部殺滅，可判為滅菌合格。

17．3在實(shí)際應(yīng)用中消毒效果評(píng)價(jià)以有機(jī)物保護(hù)試驗(yàn)的最低濃度和最短時(shí)間為該消毒劑達(dá)到實(shí)用消毒所需的濃度和時(shí)間。附錄A

中和劑中和效果試驗(yàn)

（補(bǔ)充件）A1內(nèi)容提要

為了準(zhǔn)確評(píng)價(jià)消毒劑對(duì)微生物的殺滅作用，消毒試驗(yàn)中要求選擇適當(dāng)中和劑。所選中和劑不僅能及時(shí)中止消毒劑的殺微生物作用，且中和劑本身及其與消毒劑的反應(yīng)產(chǎn)物（下稱中和產(chǎn)物）尚需對(duì)微生物無(wú)抑制或殺滅作用，對(duì)培養(yǎng)基無(wú)不良影響。

A2培養(yǎng)基和試劑

A2．1營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基

成分：蛋白胨10．00g

牛肉膏3．00g

氯化鈉5．00g

瓊脂15．00g

蒸餾水1000．00mL

制法：除瓊脂外，其他成分溶解于蒸餾水中，調(diào)pH至7．2～7．4，加入瓊脂后加熱溶解，過(guò)濾分裝，經(jīng)121℃、壓力蒸汽作用30min，滅菌后備用。

A2．20．03mol/L磷酸鹽緩沖液（pH7．2～7．6，下稱PBS）。

成分：磷酸氫二鈉2．84g

磷酸二氫鉀1．36g

蒸餾水1000．00mL

制法：將磷酸氫二鈉與磷酸二氫鉀溶解于蒸餾水中，pH為7．2～7．4，分裝，經(jīng)121℃）。

A3．3量筒。

A3．4精密pH試紙。

A3．5無(wú)菌試管。

A3．6無(wú)菌刻度吸管（1．0，5．0，10．0mL）。

A3．7恒溫培養(yǎng)箱。

A3．8冰箱。

A3．9菌落計(jì)數(shù)器。

A3．10酒精燈。

A4中和劑（注明生產(chǎn)廠家，批號(hào)）

A5操作方法

A5．1用PBS將指示菌制成5×105～5×106cfu/mL懸液。

A5．2將消毒劑用滅菌蒸餾水配制成3種不同濃度，在不加中和劑的情況下，測(cè)知該消毒劑10min抑殺指示菌99．9％以上的最低有效濃度。

A5．3取消毒劑10min抑殺指示菌的最低有效濃度與待選擇中和劑進(jìn)行試驗(yàn)，選出中和劑種類并依據(jù)等當(dāng)量中和原則，調(diào)整中和劑濃度，選出試驗(yàn)濃度的消毒劑使用中和劑的濃度。

A5．4中和劑選擇試驗(yàn)時(shí)，先將消毒劑1．0mL與中和劑溶液9．0mL混合，制成中和產(chǎn)物溶液，再按表

A1分組進(jìn)行。

表A1中和劑選擇試驗(yàn)

photo-2

A6中和試驗(yàn)結(jié)果報(bào)告方法（如表A2）

表A2中和試驗(yàn)結(jié)果舉例

photo-3

3、4、5組間誤差率計(jì)算公式

A7判定標(biāo)準(zhǔn)

A7．13、4、5組菌數(shù)相似，其誤差率≤10％。

A7．26組無(wú)菌生長(zhǎng)。

A7．32組菌數(shù)明顯少于3、4、5組。

A7．41組不長(zhǎng)菌或明顯少于2組。

符合上述標(biāo)準(zhǔn)的中和劑表明可消除消毒劑對(duì)指示菌的作用，中和劑及其與消毒劑的中和產(chǎn)物對(duì)指示菌無(wú)毒害，判定為該消毒劑的中和劑。

A8消毒試驗(yàn)用中和劑濃度的選擇

按A5．4步驟進(jìn)行，按A7．1～7．4的標(biāo)準(zhǔn)判定。

附錄B

消毒劑定性消毒試驗(yàn)

（補(bǔ)充件）B1內(nèi)容提要

定性消毒試驗(yàn)是測(cè)定受消毒因子作用后的樣本有無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的試驗(yàn)方法。用于對(duì)消毒因子滅菌效果的鑒定和消毒劑殺滅細(xì)菌效果的初步評(píng)價(jià)。

B2培養(yǎng)基與試劑

B2．1普通肉湯培養(yǎng)基

B2．1．1成分：蛋白胨10．00g

氯化鈉5．00g

肉浸液1000．00mL

B2．1．2制法：取蛋白胨、氯化鈉加入肉浸液內(nèi)，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH至弱堿性，煮沸、濾清，調(diào)節(jié)pH使滅菌后為7．2～7．4，壓力蒸汽滅菌備用。

B2．2試劑

B2．2．1稀釋液：含1％蛋白胨的0．03mol/LPBS（pH7．2～7．4）。

B2．2．2滅菌蒸餾水。

B2．2．3中和劑：按本標(biāo)準(zhǔn)附錄A選擇。

B3器材

B3．1滅菌刻度吸管（1．0，5．0，10．0mL）。

B3．2滅菌試管。

B3．3滅菌三角燒瓶。

B3．4酒精燈。

B3．5恒溫水浴箱。

B3．6恒溫培養(yǎng)箱。

B4試驗(yàn)方法

B4．1將菌液進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，并用稀釋液配制成含菌量為5×105～5×106cfu/mL的菌懸液。

B4．2將滅菌試管10支排列于試管架上，標(biāo)記管號(hào)。

B4．3每個(gè)試管加滅菌蒸餾水2．5mL，放20±2水浴中。

B4．4于第1管內(nèi)加適當(dāng)濃度消毒液2．5mL，混勻后取2．5mL移入第2管，再次混勻，從第2管中取2．5mL移入第3管，以此類推至第9管，混勻后棄去2．5mL，第10管中不加消毒液作對(duì)照。

B4．5加菌懸液2．5mL于各管中，混勻并記錄各管加菌時(shí)間，使菌藥混合液中含菌量均為105～106cfu/mL。

B4．6各管分別于加菌后4個(gè)不同間隔時(shí)間，取出0．5mL，加入4．5mL中和劑內(nèi)，中和10min后，取出0．5mL加入4．5mL營(yíng)養(yǎng)肉湯管內(nèi)。

B4．7將接種細(xì)菌的肉湯管放37℃培養(yǎng)48h，觀察初步結(jié)果，無(wú)菌生長(zhǎng)管繼續(xù)培養(yǎng)至第7天。

B4．8試驗(yàn)重復(fù)5次。

B5結(jié)果判定

B5．1若肉湯管混濁，則表示有菌生長(zhǎng)，記為陽(yáng)性，以（+）表示。

B5．2若培養(yǎng)至第7天，肉湯管澄清，則表示無(wú)菌生長(zhǎng)，記為陰性，以（—）表示。

B5．3對(duì)難以判定的肉湯管，取0．1mL接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，用滅菌L棒涂勻，放37C1內(nèi)容提要

定量消毒試驗(yàn)是測(cè)定受消毒因子作用后，樣本殘存微生物數(shù)量的試驗(yàn)方法，以殺滅率表示結(jié)果。用于對(duì)消毒劑殺滅效果的評(píng)價(jià)。

C2培養(yǎng)基與試劑

C2．1普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：按本標(biāo)準(zhǔn)A2．1制備。

C2．2試劑

C2．2．1稀釋液：含1％蛋白胨的0．03mol/LPBS（pH7．2～7．4）。

C2．2．2滅菌蒸餾水。

C2．2．3中和劑：按本標(biāo)準(zhǔn)附錄A選擇。

C2．2．40．03mol/LPBS（pH7．2～7．4）。

C2．2．5洗脫液：含中和劑、1％蛋白胨、0．1％吐溫80的PBS。

C3器材

C3．1滅菌刻度吸管（1．0，5．0，10．0mL）。

C3．2滅菌試管。

C3．3滅菌三角燒瓶。

C3．4滅菌平皿（直徑為9cm）。

C3．5恒溫水浴箱。

C3．6恒溫培養(yǎng)箱。

C3．7酒精燈。

C3．8菌落計(jì)數(shù)器。

C3．9微量進(jìn)樣器。

C3．10載體：根據(jù)需要及試驗(yàn)?zāi)康倪x用經(jīng)脫脂處理0．5cm×1．0cm大小的布片、紙片、玻片、橡膠片、塑料片、不銹鋼片或鋁片。

C4試驗(yàn)方法

C4．1定量懸液試驗(yàn)

C4．1．1將菌液進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，并用稀釋液稀釋成含菌量為5×105～5×106cfu/mL的菌懸液。

C4．1．2將消毒劑用滅菌蒸餾水稀釋成3個(gè)不同濃度，各吸取4．5mL分別加入三個(gè)試管內(nèi)，放20±2℃水浴中。

C4．1．3待試管內(nèi)液體溫度與水浴溫度平衡后，在三個(gè)試管中分別加入0．5mL菌懸液（含菌量為5×105～5106cfu/mL），混勻并開(kāi)始記時(shí)。

C4．1．4分別于4個(gè)不同間隔時(shí)間，各取0．5mL菌液混合液移入4．5mL中和劑中混勻。

C4．1．5中和10min，作適當(dāng)稀釋后進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。

C4．1．6陽(yáng)性對(duì)照以洗脫液代替消毒液，同時(shí)按C4．1．2～C4．1．5進(jìn)行。

C4．1．7按不同稀釋度推算出每個(gè)樣本存活菌數(shù)（cfu/mL），按式（C1）計(jì)算殺滅率：

C4．1．8試驗(yàn)重復(fù)5次。

C4．2載體定量試驗(yàn)

C4．2．1將滅菌載體平放于滅菌平皿內(nèi)，每個(gè)載體滴注定量菌液（載體回收菌量達(dá)5×105～5×106cfu/片），涂勻，放37℃培養(yǎng)箱待干。應(yīng)用市售染菌載體時(shí)，回收菌量亦應(yīng)達(dá)5×105～5×106cfu/片）。

C4．2．2用滅菌蒸餾水將消毒劑稀釋成3個(gè)不同濃度，各吸取5mL分別加入三個(gè)試管內(nèi)，放20±2℃水浴中。

C4．2．3待試管內(nèi)液體溫度與水浴溫度平衡后，加入染菌載體，作用至規(guī)定時(shí)間，將染菌載體移入含中和劑的5mL洗脫液試管內(nèi)，中和10min，振打80次，適當(dāng)稀釋，接種兩個(gè)平板。放37℃D1內(nèi)容提要

有機(jī)物保護(hù)試驗(yàn)是測(cè)定消毒劑對(duì)有機(jī)物保護(hù)條件下的微生物的殺滅作用，以殺滅率表示之，其結(jié)果與該消毒劑定量消毒試驗(yàn)相比較，用于評(píng)價(jià)有機(jī)物對(duì)消毒劑的殺菌能力的影響。

D2培養(yǎng)基與試劑

D2．1普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，按本標(biāo)準(zhǔn)A2．1制備。

D2．2試劑：

D2．2．1稀釋液：同C2．2．1。

D2．2．2滅菌蒸餾水。

D2．2．3中和劑：按本標(biāo)準(zhǔn)附錄A進(jìn)行選擇。

D2．2．40．03mol/L磷酸緩沖液（pH7．2～7．4）（簡(jiǎn)稱PBS）。

D2．2．5洗脫液：含1％蛋白胨，0．1％吐溫80的生理鹽水。

D2．2．6小牛血清加入菌懸液中，使其最終濃度為10％。

D3器材

同本標(biāo)準(zhǔn)C3。

D4試驗(yàn)方法

D4．1實(shí)驗(yàn)前預(yù)先將菌液進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，用稀釋液稀釋，加入小牛血清，使其最終含血清量為10％，含菌數(shù)為5×105～5×106cfu/mL，以此作為試驗(yàn)菌懸液。

D4．2以下步驟同本標(biāo)準(zhǔn)C4．1．2～C4．1．8。

D5結(jié)果判定

D5．15次試驗(yàn)的殺滅率均大于99．9％所需最低濃度和最短時(shí)間，判為該消毒劑在有機(jī)物存在下，可以達(dá)到消毒的有效濃度和時(shí)間。

D5．2此有效濃度和時(shí)間與定量消毒試驗(yàn)達(dá)到消毒的有效濃度和時(shí)間相同或相近，判為有機(jī)物對(duì)消毒劑殺菌作用無(wú)明顯影響。達(dá)到消毒最低有效濃度增加一倍以上或最短作用時(shí)間延長(zhǎng)一倍以上者可視為有明顯影響。

附錄E

乙型肝炎表面抗原破壞試驗(yàn)

（補(bǔ)充件）E1內(nèi)容提要

乙型肝炎表面抗原（HBsAg）破壞試驗(yàn)是以HBsAg的抗原活性為間接標(biāo)志，評(píng)價(jià)消毒因子對(duì)乙型肝炎病毒（HBV）滅活能力的試驗(yàn)方法。

適用于評(píng)價(jià)化學(xué)消毒劑、紫外線對(duì)HBV的消毒效果。

E2試劑

E2．1小牛血清（56℃，30min滅活）。

E2．20．01mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS，pH7．2～7．4）。

E2．3純化HBsAg（1．0mg/mL）。

E2．4固相放射免疫分析法試劑，要求特異性100％，精密性CV≤15％，靈敏度≤1．0ng/mL，線性r＞0．95。

E2．5酶聯(lián)免疫吸附法試劑，要求特異性100％，精密性CV≤15％，靈敏度≤3．2ng/mL，線性r＞0．95。

E3器材

E3．1吸量器：包括試管、吸管（0．1，1．0，5．0和10．0mL4種）和微量進(jìn)樣器（100．0μL）。

E3．2載體（直徑1．大小的不銹鋼片）。

E3．3免疫計(jì)數(shù)儀。

E3．4酶聯(lián)免疫測(cè)定儀。

E⒊5低溫冰箱（—30℃～—70℃）。

E4HBsAg懸液的配制

E4．1取0．01mol/LPBS（pH7．2～7．4）9．4mL加入小牛血清0．6mL，配成含6％小牛血清的懸液。再取該P(yáng)BS9．0mL，加入濃度為1．0mg/mL的純化HBsAg懸液1．0mL，使成含5．4％小牛血清，HBsAg濃度為100μg/mL的試驗(yàn)用HBsAg懸液。

E4．2將試驗(yàn)用HBsAg懸液1．0mL盛裝入容量為1．5mL的玻璃安瓿中，封口，放－30℃～－70℃冰箱保存?zhèn)溆谩１４嫫跒槿齻€(gè)月。

E5HBsAg的檢測(cè)方法

E5．1固相放射免疫分析法（SPRIA）。

E5．2酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）。

E6中和劑選擇

在測(cè)定消毒劑對(duì)HBsAg的破壞效果時(shí)，應(yīng)先選出適宜的中和劑及其使用濃度，再進(jìn)行破壞試驗(yàn)。

所用中和劑：a．應(yīng)能有效而及時(shí)中止消毒劑的殘余作用；b．中和劑及其與消毒劑的中和產(chǎn)物對(duì)HBsAg的抗原活性沒(méi)有影響，亦不影響檢測(cè)方法對(duì)HBsAg檢出的靈敏度。

E6．1將消毒劑用無(wú)菌蒸餾水配成不同濃度，取1．2mL消毒液與0．3mLHBsAg懸液混勻，置20水浴條件下，作用10min，測(cè)定該消毒劑10min抑制或破壞HBsAg抗原性的最低有效濃度。

E6．2取消毒劑10min抑制或破壞HBsAg抗原性的最低有效濃度與待選中和劑進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)可按下列組別進(jìn)行：a．消毒液0．9mL+HBsAg懸液0．1mL；b．消毒液0．4mL+HBsAg懸液0．1mL作用10min后+含20％小牛血清的中和劑0．5mL；c．先取含20％小牛血清的中和劑1mL與消毒液1mL，混勻，作用10～30min，制成中和產(chǎn)物溶液，再行試驗(yàn)。中和產(chǎn)物溶液0．9mL+HBsAg懸液0．1mL；d．含10％小牛血清的PBS0．9mL+HBsAg懸液0．1mL；e．含10％小牛血清的中和劑0．9mL+HBsAg懸液0．1mL；f．中和產(chǎn)物溶液0．9mL+PBs0．1mL。經(jīng)檢測(cè)只有在c、d、e組HBsAg活性的測(cè)定值相近（相差10％以下）并都明顯多于b組，a組HBsAg活性不能檢出或檢出活性明顯少于b組，f組陰性對(duì)照正常，方可證明所選中和劑及其使用劑量是適宜的。

E6．3進(jìn)行消毒試驗(yàn)時(shí)，依據(jù)消毒劑與中和劑等當(dāng)量中和原則，適當(dāng)調(diào)整中和劑的用量。再次按E6．2步驟測(cè)定中和效果后，方可進(jìn)行抗原性破壞試驗(yàn)。

E7破壞試驗(yàn)方法

E7．1懸液法

懸液法指將HBsAg在懸液中與消毒劑相互作用并進(jìn)行抗原性破壞效果觀察的試驗(yàn)方法。

E7．1．1HBsAg懸液的濃度為檢測(cè)試劑靈敏度的104倍。如檢測(cè)試劑的靈敏度為1ng/mL，HBsAg的濃度應(yīng)為10μg/mL。

E7．1．2取含5％小牛血清的PBS2．7mL加到含0．3mL濃度為100μg/mL的HBsAg懸液中，混勻。

E7．1．3取小牛血清20mL加到含80mL滅菌的中和劑溶液中，混勻。

E7．1．4破壞試驗(yàn)：將預(yù)定消毒液濃度1．25倍的消毒液與HBsAg懸液按4∶1比例混合，混合液容量不少于1．5mL。然后置20±2水浴條件下，作用達(dá)規(guī)定時(shí)間，即刻取0．3mL混合液與等體積含20％小牛血清的中和劑混勻，作用10～30min，取樣測(cè)定殘留HBsAg的活性，每一樣本平行測(cè)定2份，每份0．1mL，取其平均值，判定破壞效果。每種消毒劑觀察3個(gè)濃度，每一濃度觀察4個(gè)作用時(shí)間。試驗(yàn)重復(fù)5次。

E7．1．5陽(yáng)性對(duì)照：取含20％小牛血清的中和劑1mL，加到含1mL試驗(yàn)用消毒液的試管中混勻，作用10～30min，制成中和產(chǎn)物溶液。取該中和產(chǎn)物溶液0．9mL加入試驗(yàn)濃度的HBsAg懸液0．1mL取樣檢測(cè)，每一樣本檢測(cè)3份，每份0．1mL，取其平均值為陽(yáng)性對(duì)照值。

E7．1．6陰性對(duì)照：取含20％小牛血清的中和劑1mL加到含1mL試驗(yàn)用消毒液的試管中，混勻，作用10～30min，取樣檢測(cè)，每一樣本檢測(cè)3份，每份0．1mL取其平均值為陰性對(duì)照值。

應(yīng)注意陰性對(duì)照不能用試劑盒的陰性對(duì)照樣本。

E7．2載體法

載體法指將在載體表面的HBsAg與消毒因子相互作用，并進(jìn)行抗原性破壞效果觀察的試驗(yàn)方法。

E7．2．1HBsAg載體的制備

E7．2．1．1載體為直徑1．5cm大小的不銹鋼片，經(jīng)洗滌劑煮沸洗滌脫脂、壓力蒸汽滅菌備用。

E7．2．1．2HBsAg懸液的濃度為檢測(cè)方法靈敏度的5×104倍。如靈敏度為1ng/mL，HBsAg的濃度應(yīng)為50μg/mL。

E7．2．1．3HBsAg的污染方法為滴染法。滴染時(shí)，將滅菌載體平鋪于無(wú)菌平皿內(nèi)，用微量進(jìn)樣器吸取HBsAg懸液，滴注于載體中央，每個(gè)載體20μL。然后用L型白金絲將懸液涂布均勻，放37培養(yǎng)箱40～60min，待懸液干燥后進(jìn)行抗原性破壞試驗(yàn)。

E7．2．2抗原性破壞試驗(yàn)

取污染HBsA