DB21T 2451-2015 玉米品種真實性鑒定 SSR分子檢測方法

ICS65.020.20DB21DB21/T2451—2015玉米品種真實性鑒定SSR分子檢測方法MaizevarietygenuinenessverificationwithSSRmarkers遼寧省質量技術監(jiān)督局發(fā)布IDB21/T2451—2015前言 12規(guī)范性引用文件 13術語、定義和縮略語 14方法原理 25儀器設備、試劑和溶液配制 26檢測步驟 37結果分析和表示 68結果判定 6附錄A（規(guī)范性附錄）核心引物名稱和序列 7附錄B（規(guī)范性附錄）溶液配制 9DB21/T2451—2015本標準按照GB/T1.1-2009給出的規(guī)則起草。本標準由遼寧省農(nóng)村經(jīng)濟委員會提出并歸口。本標準起草單位：遼寧省種子管理局。本標準起草人：朱志成、李波、高振環(huán)、鄒暢、肖國峰、王汝寶、李洪建、趙前程、王見中、溫浩、李鵬、史鴻儒、安輝、徐策、孫麗紅、王東坡。1DB21/T2451—2015本標準規(guī)定了玉米品種真實性鑒定的原理、儀器設備、檢測步驟及結果判定。本標準適用于玉米品種真實性SSR分子鑒定。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T3543.2農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程扦樣GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法3術語、定義和縮略語3.1術語和定義下列術語和定義適用于本標準。3.1.1品種真實性供檢樣品與該品種的對照樣品是否相符。3.1.2對照樣品省級以上種子管理部門收集并保存的與品種名稱相符的種子樣品。3.1.3參照品種已知等位變異SSR位點的品種。3.1.4SSR分子檢測通過SSR分子標記檢測玉米品種基因組DNA的差異，鑒定玉米品種真實性的檢測方法。3.2縮略語2DB21/T2451—2015CTAB：cetyltrimethylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化銨。DNA：deoxyribonucleicacid，脫氧核糖核酸。dNTPs：deoxyribonucleosidetriphosphates，脫氧核苷三磷酸。PAGE：polyacrylamidegelelectrophoresis，聚丙烯酰胺凝膠電泳。PCR：polymerasechainreaction，聚合酶鏈式反應。SDS：sodiumdodecylsulfate，十二烷基苯磺酸鈉。SSR：simplesequencerepeat，簡單重復序列。Taq酶：Taq-DNApolymerase，耐熱DNA聚合酶。4方法原理由于不同玉米品種遺傳組成不同，基因組DNA中簡單重復序列的重復次數(shù)存在差異，這種差異可通過PCR擴增及電泳方法進行檢測，從而能夠鑒定玉米品種真實性。5儀器設備、試劑和溶液配制5.1儀器設備5.1.1PAGE檢測平臺高速冷凍離心機、水浴鍋、紫外分光光度計、PCR擴增儀、微量移液器、電子天平、高壓滅菌鍋、磁力攪拌器、微波爐、冰箱、高壓電泳儀、垂直電泳槽及制膠附件、水平搖床、膠片觀察燈、凝膠成像系統(tǒng)或數(shù)碼相機。5.1.2毛細管電泳檢測平臺高速冷凍離心機、水浴鍋、紫外分光光度計、PCR擴增儀、微量移液器、電子天平、高壓滅菌鍋、磁力攪拌器、微波爐、冰箱、DNA分析儀。5.2試劑5.2.1PAGE電泳CTAB、三氯甲烷、異戊醇、異丙醇、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-Na2?2H2O）、三羥甲基氨基甲烷（Tris-base）、37%的鹽酸、氫氧化鈉（NaOH）、氯化鈉（NaCl）、dNTPs、Taq酶、10×Buffer緩沖液、礦物油、去離子甲酰胺（Formamide）、溴酚藍（BrphBlue）、二甲苯青FF、甲叉雙丙烯酰胺疏水硅烷（RepelSilane）、DNA分子量標準、無水乙醇、四甲基乙二胺（TEMED）、過硫酸銨（APS）、冰醋酸、乙酸銨、硝酸銀、甲醛。5.2.2毛細管電泳CTAB、三氯甲烷、異戊醇、異丙醇、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-Na2?2H2O）、三羥甲基氨基甲烷（Tris-base）、37%的鹽酸、氫氧化鈉（NaOH）、氯化鈉（NaCl）、dNTPs、Taq酶、10×Buffer緩沖液、礦物油、DNA分析儀專用丙烯酰胺膠、DNA分析儀專用分子量內標、DNA分析儀專用電泳緩沖液。5.3溶液配制3DB21/T2451—2015DNA提取、PCR擴增、電泳以及銀染溶液按照附錄B（規(guī)范性附錄）規(guī)定的要求進行配制，所用試劑均為分析純。試劑配制所用水應符合GB/T6682規(guī)定的一級水的要求，其中銀染溶液的配制只需達到三級水的要6檢測步驟6.1送驗樣品及DNA提取6.1.1送驗樣品送驗樣品為種子，重量不低于200g或不少于500粒。送驗樣品為果穗，應不低于5個果穗(總粒數(shù)不低于500粒)；送驗樣品為幼苗、葉片或苞葉的，應至少含有40個個體。對于玉米自交系或單交種，可采用混合樣或單個個體獨立檢測?；旌蠘拥脑嚇討辽俸?0個個體，單個個體獨立檢測的試樣應至少含有5個個體。采用混合樣而檢測結果在某個引物位點出現(xiàn)異質性并影響到結果判定的，應采用單個個體獨立檢測，試樣應至少含有20個個體。6.1.2DNA提取DNA提取方法可任選6.1.2.1至6.1.2.4所列的一種方法。DNA質量應符合PCR擴增的要求。6.1.2.1CTAB法取試樣的幼苗或葉片200mg～300mg置于2.0mL離心管，加液氮充分研磨，或取種子充分磨碎后，移入2.0mL離心管。每管加入700μL經(jīng)65℃預熱的CTAB提取液，充分混勻，65℃水浴60min充分混勻。每管加入等體積的三氯甲烷/異戊醇（24：1）混合液，充分混合后靜置10min，在12000rpm條件下離心15min。吸取上清液轉移至另一離心管內，加入等體積預冷的異丙醇，充分混勻，-20℃放置30min后在4℃、12000rpm條件下離心10min，棄上清液，加入70%乙醇溶液，旋轉2次后棄去乙醇溶液，并倒立于墊有濾紙的實驗臺上，室溫放置10min以上。加入100μL超純水或TE緩沖液1，充分溶解后備此方法為DAN提取的仲裁方法。6.1.2.2SDS法剪取試樣的幼苗或葉片或剝取干種子的胚，置于1.5mL離心管，加入100μL氯仿后研磨，再加入300μLSDS提取液，混勻后在10000rpm條件下離心2min。吸取上清液，轉移至預先裝有300μL異丙醇TE緩沖液1，充分溶解后備用。6.1.2.3堿煮法剝取試樣干種子的胚，或將種子培養(yǎng)至幼苗長度達到3cm左右時剪取每株幼苗1.5cm，放入96孔深孔板中。每孔加入150μL氫氧化鈉溶液，煮沸5min，然后加入150μLTE緩沖液2，充分溶解后備用。6.1.2.4試劑盒法選用適宜SSR標記法的商業(yè)試劑盒，并經(jīng)驗證合格后使用。提取方法，按照提供的使用說明進行。4DB21/T2451—20156.2PCR擴增6.2.1反應體系PCR擴增反應體系的總體積可以依據(jù)具體情況確定。20μL反應體系應符合表1的要求。本標準推薦了40對核心引物，引物名稱和序列見附錄A。選用PAGE電泳，應合成普通引物，采用單引物電泳。選用毛細管電泳，合成引物時需在上游引物的5’端標記熒光染料，可采用單引物電泳或多引物組合電泳。對于近似品種，采用本標準推薦40對核心引物無明顯差異的，可以采用能夠區(qū)分的特異引物作為進行SSR檢測。當使用特異引物時，應在檢驗報告中說明該特異引物的序列信息。表1PCR擴增反應體系原濃度終濃度ddH2O-12.3510×Buffer10×2MgCl225mmol/L2.5mmol/L2dNTP2.5mmol/Leach0.15mmol/Leach1.2Taq酶5U/μL0.220μmol/L0.25μmol/Leach0.25DNA25ng/μL2.5ng/μL26.2.2反應程序反應采用下列程序：94℃預變性5min，1次循環(huán)；94℃變性40s，60℃退火35s，72℃延伸45s，進行35次循環(huán)擴增反應；72℃延伸10min。反應程序的反應參數(shù)可根據(jù)PCR擴增儀型號、酶、引物等不同而進行適當?shù)恼{整。形成的擴增產(chǎn)物于4℃保存。6.3擴增產(chǎn)物檢測6.3.1PAGE電泳6.3.1.1制膠制膠執(zhí)行下列程序：a)蘸洗滌靈用清水將玻璃板反復擦洗干凈，再用雙蒸水、95%乙醇溶液分別擦洗兩遍。玻璃板干燥后，將0.5mL親和硅烷工作液，均勻涂在無凹槽的玻璃板上；將0.5mL疏水硅烷工作液，均勻涂在帶凹槽的玻璃板上。操作過程中兩塊玻璃板分別處理，防止相互污染；b)玻璃板徹底干燥后，將塑料隔條整齊放在無凹槽玻璃板兩側，蓋上凹槽玻璃板，夾子固定后，用水平儀檢測玻璃膠室是否水平；c)取100mL4.5%PAGE膠，加入TEMED、25%過硫酸銨各100μL，迅速混勻，將膠灌入玻璃膠室，灌膠過程應防止氣泡的出現(xiàn)。待膠室灌滿后，在凹槽處將鯊魚齒朝外輕輕插入樣品梳，在室溫下聚合1h以上。6.3.1.2變性5DB21/T2451—2015取20μl擴增產(chǎn)物（見6.2.2加入4μL6×加樣緩沖液，混勻。在PCR擴增儀上運行94℃變性5min，4℃冷卻10min后備用。6.3.1.3電泳電泳執(zhí)行下列程序：a)正極槽（下槽）加入1×TBE緩沖液600mL，負極槽（上槽）加入經(jīng)65℃預熱的1×TBE緩沖液600mL，拔出樣品梳，在90W恒功率下預電泳10min～20min；b)用移液器清除加樣槽孔氣泡和雜質，插入樣品梳（鯊魚齒朝下），每一個加樣孔點入5μL樣品（6.3.1.2），在80W恒功率下電泳；c)電泳時間因擴增產(chǎn)物預期片段大小不同而有所不同，一般來說，DNA擴增產(chǎn)物的預期片段，泳動到膠板中部位置，效果較好，可采用上部的二甲苯青指示帶進行確定；d)達到電泳時間后關閉電源，結束電泳，取下玻璃板并輕輕撬開，通常凝膠附著在無凹槽的玻璃板上。6.3.1.4染色染色執(zhí)行下列程序：a)將附著凝膠的玻璃板浸入固定液中，輕輕晃動3min后取出，在雙蒸水中快速漂洗，時間不超過b)將膠板放入染色液中，輕輕晃動5min后取出，在雙蒸水中快速漂洗，時間不超過10s；c)將膠板放入顯影液中，輕輕晃動待條帶清晰后取出，再迅速放入固定液中定影5min取出，在雙蒸水中漂洗1min；d)取出膠板，晾干，放在膠片觀察燈上觀察，記錄結果，拍照保存。注：固定液、染色液、雙蒸水和顯影液的用量，可依據(jù)膠板數(shù)量和大小調整，以浸過膠面為準。6.3.1.5數(shù)據(jù)記錄供檢樣品與對照樣品在同一電泳板上并排電泳時，每個位點進行逐對比較，并記錄比較結果。供檢樣品與對照樣品DNA指紋庫中的指紋數(shù)據(jù)進行比較時，執(zhí)行下列程序：a)將供檢樣品與參照品種在同一電泳板上并排電泳，逐個位點進行逐對比較，并記錄比較結果。b)將該樣品的純合位點基因型數(shù)據(jù)記錄為X/X，雜合位點基因型數(shù)據(jù)記錄為X/Y，其中X、Y分別為該位點上兩個等位變異，小片段數(shù)據(jù)在前，大片段數(shù)據(jù)在后，缺失位點基因型數(shù)據(jù)記錄為0/0；c)與數(shù)據(jù)庫中對照樣品指紋數(shù)據(jù)進行比較，記錄比較結果。6.3.2熒光毛細管電泳檢測6.3.2.1變性分別取等體積的擴增產(chǎn)物和不同熒光標記的產(chǎn)物，混勻后從混合液中吸取1μL，加入到DNA分析儀專用96孔板孔中，各孔再分別加入0.1μL分子量內標和8.9μL去離子甲酰胺。在PCR儀上95℃變性5min，取出立即置于碎冰上，冷卻10min以上。離心10s后備用。6.3.2.2電泳打開DNA分析儀，檢查儀器工作狀態(tài)，更換緩沖液、灌膠。將裝有樣品的微孔板放置于樣品架基座上，打開數(shù)據(jù)收集軟件。按照DNA分析儀使用手冊進行操作，DNA分析儀將自動運行，并保存電泳數(shù)據(jù)文6DB21/T2451—20157結果分析和表示位點差異記錄分為下列三種情形：——位點存在差異的或完全相同的，記錄為有差異或無差異；——位點數(shù)據(jù)缺失的，記錄為缺失；——位點顯示無法判定的，記錄為無法判定。檢驗結果用比較供檢樣品和對照樣品的位點差異數(shù)目表示。統(tǒng)計位點差異記錄的結果，計算比較位點數(shù)、差異位點數(shù)及差異位點。8結果判定供檢樣品和對照樣品的差異位點數(shù)目≥3，，判定為與對照樣品不相符。供檢樣品和標準樣品的差異位點數(shù)目＜3，判定為與對照樣品相符。屬于下列情形之一的，需要在檢驗報告中注明：——采用的對照樣品數(shù)據(jù)來自對照樣品DNA指紋數(shù)據(jù)庫的；——使用特異引物進行檢測的，應提供該特異引物的序列信息。7DB21/T2451—2015（規(guī)范性附錄）核心引物名稱和序列編號引物名稱染色體位置分組引物序列熒光染料P01bnlg439w1I上游：AGTTGACATCGCCATCTTGGTGAC下游：GAACAAGCCCTTAGCGGGTTGTCNEDP02umc1335y5I上游：CCTCGTTACGGTTACGCTGCTG下游：GATGACCCCGCTTACTTCGTTTATGPETP03umc2007y42.04I上游：TTACACAACGCAACACGAGGC下游：GCTATAGGCCGTAGCTTGGTAGACACFAMP04bnlg1940k72.08I上游：CGTTTAAGAACGGTTGATTGCATTCC下游：GCCTTTATTTCTCCCTTGCTTGCCPETP05umc2105k33.00I上游：GAAGGGCAATGAATAGAGCCATGAG下游：ATGGACTCTGTGCGACTTGTACCGPETP06phi053k23.05I上游：CCCTGCCTCTCAGATTCAGAGATTG下游：TAGGCTGGCTGGAAGTTTGTTGCNEDP07phi072k44.01I上游：GCTCGTCTCCTCCAGGTCAGG下游：CGTTGCCCATACATCATGCCTCVICP08bnlg2291k44.06I上游：GCACACCCGTAGTAGCTGAGACTTG下游：CATAACCTTGCCTCCCAAACCCVICP09umc1705w15.03I上游：GGAGGTCGTCAGATGGAGTTCG下游：CACGTACGGCAATGCAGACAAGVICP10bnlg2305k45.07I上游：CCCCTCTTCCTCAGCACCTTG下游：CGTCTTGTCTCCGTCCGTGTGNEDP11bnlg161k86.00I上游：TCTCAGCTCCTGCTTATTGCTTTCG下游：GATGGATGGAGCATGAGCTTGCVICP12bnlg1702k16.05I上游：GATCCGCATTGTCAAATGACCAC下游：AGGACACGCCATCGTCATCAVICP13umc1545y27.00I上游：AATGCCGTTATCATGCGATGC下游：GCTTGCTGCTTCTTGAATTGCGTNEDP14umc1125y37.04I上游：GGATGATGGCGAGGATGATGTC下游：CCACCAACCCATACCCATACCAGVICP15bnlg240k18.06I上游：GCAGGTGTCGGGGATTTTCTC下游：GGAACTGAAGAACAGAAGGCATTGATACPETP16phi080k158.08I上游：TGAACCACCCGATGCAACTTG下游：TTGATGGGCACGATCTCGTAGTCPETP17phi065k99.03I上游：CGCCTTCAAGAATATCCTTGTGCC下游：GGACCCAGACCAGGTTCCACCNEDP18umc1492y139.04I下游：AACCAAGTTCTTCAGACGCTTCAGGPETP19umc1432y610.02I上游：GAGAAATCAAGAGGTGCGAGCATC下游：GGCCATGATACAGCAAGAAATGATAAGCPETP20umc1506k1210.05I上游：GAGGAATGATGTCCGCGAAGAAG下游：TTCAGTCGAGCGCCCAACACFAMP21umc1147y4II上游：AAGAACAGGACTACATGAGGTGCGATAC下游：GTTTCCTATGGTACAGTTCTCCCTCGCNEDP22bnlg1671y17II上游：CCCGACACCTGAGTTGACCTG下游：CTGGAGGGTGAAACAAGAGCAATGFAM8DB21/T2451—2015P23phi96100y12.00II上游：TTTTGCACGAGCCATCGTATAACG下游：CCATCTGCTGATCCGAATACCCFAMP24umc1536k92.07II上游：TGATAGGTAGTTAGCATATCCCTGGTATCGNEDP25bnlg1520K12.09II上游：CACTCTCCCTCTAAAATATCAGACAACACC下游：GCTTCTGCTGCTGTTTTGTTCTTGFAMP26umc1489y33.07II上游：GCTACCCGCAACCAAGAACTCTTC下游：GCCTACTCTTGCCGTTTTACTCCTGTNEDP27bnlg490y44.04II上游：GGTGTTGGAGTCGCTGGGAAAG下游：TTCTCAGCCAGTGCCAGCTCTTATTANEDP28umc1999y34.09II上游：GGCCACGTTATTGCTCATTTGC下游：GCAACAACAAATGGGATCTCCGFAMP29umc2115k35.02II上游：GCACTGGCAACTGTACCCATCG下游：GGGTTTCACCAACGGGGATAGGVICP30umc1429y75.03II上游：CTTCTCCTCGGCATCATCCAAAC下游：GGTGGCCCTGTTAATCCTCATCTGVICP31bnlg249k26.01II上游：GGCAACGGCAATAATCCACAAG下游：CATCGGCGTTGATTTCGTCAGVICP32phi299852y26.07II上游：AGCAAGCAGTAGGTGGAGGAAGG下游：AGCTGTTGTGGCTCTTTGCCTGTVICP33umc2160k37.01II上游：TCATTCCCAGAGTGCCTTAACACTG下游：CTGTGCTCGTGCTTCTCTCTGAGTATTVICP34umc1936k47.03II上游：GCTTGAGGCGGTTGAGGTATGAG下游：TGCACAGAATAAACATAGGTAGGTCAGGTCPETP35bnlg2235y58.02II上游：CGCACGGCACGATAGAGGTG下游：AACTGCTTGCCACTGGTACGGTCTVICP36phi233376y18.09II上游：CCGGCAGTCGATTACTCCACG下游：CAGTAGCCCCTCAAGCAAAACATTCPETP37umc2084w29.01II上游：ACTGATCGCGACGAGTTAATTCAAAC下游：TACCGAAGAACAACGTCATTTCAGCNEDP38umc1231k49.05II上游：ACAGAGGAACGACGGGACCAAT下游：GGCACTCAGCAAAGAGCCAAATTCFAMP39phi041y610.00II上游：CAGCGCCGCAAACTTGGTT下游：TGGACGCGAACCAGAAACAGACPETP40umc2163w310.04II上游：CAAGCGGGAATCTGAATCTTTGTTC下游：CTTCGTACCATCTTCCCTACTTCATTGCNED9DB21/T2451—2015（規(guī)范性附錄） 溶液配制B.1DNA提取B.1.10.5mol/LEDTA溶液186.1gNa2EDTA.2H2O溶于800mL水中，用固體NaOH調pH值至8.0，定容至1000mL，高壓滅菌。B.1.21mol/LTris-HCl溶液60.55gTris堿溶于適量水中，加HCl調pH至8.0，定容至500mL，高壓滅菌。B.1.30.5mol/LHCl溶液25mL濃鹽酸(36-38%)，加水定容至500mL。B.1.4CTAB提取液81.7g氯化鈉和20gCTAB溶于適量水中，然后加入1mol/LTris-HCl100mL，0.5mol/LEDTA40mL，定容至1000mL，4℃貯存。B.1.5SDS提取液1mol/LTris-HCl50mL，0.5mol/LEDTA50mL，5mo