DB21T 2619-2016 傳染性造血器官壞死病毒LAMP檢測方法

DB21DB21/T2619—2016傳染性造血器官壞死病毒LAMP檢測方法Loop-mediatedisothermalamplificationdetectionmethodforInfectioushaematopoieticnecrosisvirus遼寧省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布1DB21/T2619—2016本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：肇慧君，胡強(qiáng)，張雪，劉釗，欒慎順，李2DB21/T2619—2016環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增（loop-mediatedisothermalamplification本標(biāo)準(zhǔn)適用于IHNV病原的流行病學(xué)調(diào)查、診件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)SN/T2123-2008出入境動(dòng)物檢疫實(shí)驗(yàn)樣品EDTA：乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraaceticHEPES：羥乙基呱嗪乙硫磺酸[4-(2-Hydroxyethyl)RNA：核糖核酸（ribonucleiLAMP：環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增（Loop-mediatedBst酶：BstDNA聚合酶（大片段）[BstDNApolymerase(largefraAMV逆轉(zhuǎn)錄酶：AMVreversetranscrdNTP：脫氧核糖苷三磷酸（deoxyribonucleosidetrip4試劑、儀器和耗材）：3DB21/T2619—2016）：）：）：4.1.2BstDNApolymerase：8U/μL，-20℃保存，不要反復(fù)凍融或溫度劇烈變化。4.1.3AMV逆轉(zhuǎn)錄酶：15U/μL，-20℃保存，不要反復(fù)凍融或溫度劇烈4.1.5Rnaseinhibito4.1.10乙醇：分析純，使用前預(yù)冷到-20注：除非另有說明，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水；所有試劑均用無采樣、樣品處理及檢測過程所涉及的實(shí)驗(yàn)操作，應(yīng)遵守SN/T2123-2008的有），4DB21/T2619—2016胞單層的96孔板中，每孔的細(xì)胞單層最多接種100μL稀釋液。15℃~20℃吸附0.5h～1h后，加入M199細(xì)的細(xì)胞培養(yǎng)中出現(xiàn)細(xì)胞病變（CPE應(yīng)立即進(jìn)行鑒定。如果除陽性對(duì)照細(xì)或抽真空干燥，最后加10μLDEPC水溶解后，作為LAMP反應(yīng)模板。112215DB21/T2619—2016-1-按照表1所述配制反應(yīng)體系：63℃恒溫?cái)U(kuò)增45min，80℃2min使在上述反應(yīng)管中加入2μL顯示液，輕輕混勻并在黑色背景下觀察。顯色液優(yōu)選為熒光染料SY在空白對(duì)照和陰性對(duì)照反應(yīng)管液體為橙色，陽性對(duì)照反應(yīng)管液體呈綠6DB21/T2619—2016試劑的配制A.1胰酶-EDTA混合消化液M199培養(yǎng)基，按說明書的要求配制，然后加入10%的胎牛血清，抽濾除菌，4℃保存。開放系統(tǒng)使A.3CTAB溶液按2%CTAB，1.4mol/LNaCL，20.0mmol/LEDTA，20.0mol/LTriA.4抽提液1A.5抽提液2氯仿/異戊醇，將氯仿和異戊醇按24:1的比例混合，密7DB21/T