實(shí)驗(yàn)三酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

BioengineeringCollegeDalianUniversity定義：

利用抗體分子能與抗原分子特異性結(jié)合的特點(diǎn)，將游離的雜蛋白和結(jié)合于固相載體的目的蛋白分離，并利用特殊的標(biāo)記物對(duì)其定性或定量分析的一種檢測方法。BioengineeringCollegeDalianUniversityBioengineeringCollegeDalianUniversity采用抗原與抗體的特異反應(yīng)將待測物與酶連接，然后通過酶與底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)，用于定量測定。測定的對(duì)象可以是抗體也可以是抗原。在這種測定方法中有3種必要的試劑：①固相的抗原或抗體（免疫吸附劑）②酶標(biāo)記的抗原或抗體（標(biāo)記物）③酶作用的底物（顯色劑）基本原理BioengineeringCollegeDalianUniversity基本原理

三個(gè)基本原理抗原或抗體能物理性地吸附于固相表面，并且保持其免疫活性；抗原或抗體能與酶通過共價(jià)鍵形成酶結(jié)合物，同時(shí)保持各自的免疫活性和酶活性；酶結(jié)合物與相應(yīng)的抗原或抗體結(jié)合后，能通過加入底物的顏色反應(yīng)來確定免疫反應(yīng)的發(fā)生，顏色反應(yīng)的深淺與標(biāo)本中相應(yīng)抗原或抗體的量成正比。BioengineeringCollegeDalianUniversity

是指酶標(biāo)抗原或抗體直接與包被在酶標(biāo)板上的抗體或抗原結(jié)合形成酶標(biāo)抗原-抗體復(fù)合物，加入酶反應(yīng)底物，測定產(chǎn)物的吸光值。直接法：ELISA方法的分類BioengineeringCollegeDalianUniversity

是當(dāng)抗體（一抗）和包被在酶標(biāo)板的抗原結(jié)合形成復(fù)合后，再以酶標(biāo)二抗和復(fù)合物結(jié)合，加入酶反應(yīng)底物，測定產(chǎn)物的吸光值。間接法：BioengineeringCollegeDalianUniversity

是先將未標(biāo)記的抗體包被在酶標(biāo)板上，用于捕獲抗原，再用酶標(biāo)的抗體與抗原反應(yīng)形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物

。夾心法：BioengineeringCollegeDalianUniversityBioengineeringCollegeDalianUniversity96孔酶標(biāo)板

包被抗原（牛血清白蛋白，BSA）；封閉液（3%脫脂奶粉）

兔抗BSA抗體

酶標(biāo)記羊抗兔IgG抗體（酶標(biāo)記物）；

底物

（OPD）；抗體稀釋液（PBS）；

洗滌液（PBS-0.05%Tween20）；

反應(yīng)終止液

（2N硫酸）。試劑BioengineeringCollegeDalianUniversity實(shí)驗(yàn)步驟1.抗原的處理：2.包被抗原：取酶標(biāo)板，加入50μL/孔的抗原稀釋液（5ug/孔）37℃，放置1.5h抗原50ug/ul利用PBS稀釋抗原500倍1234AB56789101112123456789101112BioengineeringCollegeDalianUniversity包被：將抗原或抗體固定在固相載體的過程稱為包被。加樣時(shí)應(yīng)將所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。BioengineeringCollegeDalianUniversity洗滌：PBS-0.05%Tween20洗3次BioengineeringCollegeDalianUniversity4℃，放置一周3封閉加入200μL/孔的3%脫脂奶粉1234AB5678910111212345678910111237℃，放置1hBioengineeringCollegeDalianUniversity封閉：是繼包被之后用高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過程。目的：抗原或抗體包被時(shí)所用的濃度較低，吸收后固相載體表面尚有未被占據(jù)的空隙，封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而排斥在ELISA其后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。BioengineeringCollegeDalianUniversity取出酶標(biāo)板，甩干孔內(nèi)液體以PBS-0.05%Tween20（200μL/孔）洗滌3次洗滌：BioengineeringCollegeDalianUniversity4.加兔抗BSA抗體標(biāo)記各孔，加入相應(yīng)液體100μL/孔陰性陽性37℃，40min1234AB567891011121234567891011122004008001600……陰性陰性…………XXXX抗原+++-一抗+---二抗+-++一抗1234AB5678910111212342004008001600……一抗1234CD5678910111212342ul兔抗BSA抗體+198ulPBS100ul取100ul）100ul取100ul）100ul取100ul100ul取100ul）100ul取100ul）………BioengineeringCollegeDalianUniversity取出酶標(biāo)板，甩干孔內(nèi)液體以PBS-0.05%Tween20（200μL/孔）洗滌3次洗滌：BioengineeringCollegeDalianUniversity4.加二抗：各孔加入酶標(biāo)羊抗兔IgG100μL/孔（4000倍稀釋）37℃，40minBioengineeringCollegeDalianUniversity取出酶標(biāo)板，甩干孔內(nèi)液體以PBS-0.05%Tween20（200μL/孔）洗滌3次洗滌：BioengineeringCollegeDalianUniversity

顯色顯色是ELISA中的最后一步溫育反應(yīng)，此時(shí)酶催化無色的底物生成有色的產(chǎn)物。底物顯色一般在室外溫或37℃反應(yīng)20-30分鐘后即不再加深，再延長反應(yīng)時(shí)間，可使本底值增高。底物液受光照會(huì)自行變色，顯色反應(yīng)應(yīng)避光進(jìn)行，顯色反應(yīng)結(jié)束時(shí)加入終止液終止反應(yīng)。BioengineeringCollegeDalianUniversity5.顯色：加入底物溶液100μL/孔避光顯色，37℃10-20min底物溶液:

鄰苯二胺（OPD）10mg

0.1M檸檬酸6.1ml

0.2MNa2HPO46.4ml

蒸餾水12.5ml

攪拌10min臨用前加入30%H2O24ul每組分2.5mlBioengineeringCollegeDalianUniversity陰性對(duì)照(negativecontrol)1，不加抗原孔

2，不加一抗孔

3，不加二抗孔陽性對(duì)照(positivecontrol)7.觀察結(jié)果6.終止反應(yīng)加入50ul/孔2MH2SO4取出包被好抗原的酶標(biāo)板（4孔/組），甩干孔內(nèi)液體以洗滌液（200μL/孔）洗滌3次，3min/次4.加兔抗BSA抗體標(biāo)記各孔，加入相應(yīng)液體100μL/孔1234陰性空白陽性待測4.加二抗：37℃，濕盒內(nèi)，30min甩干孔內(nèi)液體以洗滌液（200μL/孔）洗滌3次，3min/次各孔加入酶標(biāo)二抗100μL/孔37℃，濕盒內(nèi)，30min5.顯色：甩干孔內(nèi)液體以洗滌液（200μL/孔）洗滌3次，3min/次加入底物溶液100μL/孔避光顯色，10min6.觀察結(jié)果Bioengi