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1麻疹風(fēng)疹實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)指南一、標(biāo)本采集(一)血標(biāo)本。用不含抗凝劑的采血管采集病例出疹后28天內(nèi)靜脈血2—3mL,標(biāo)明采集日期和病例姓名、編號(hào),待血液凝固、血塊收縮后,1500rpm/min離心20分鐘分離血清。如沒有離心機(jī),可在室溫或冷藏條件下放置至血清完全析出。將血清移至帶墊圈的外螺旋無菌管中,避免吸到紅血球。(二)病原學(xué)標(biāo)本。咽拭子標(biāo)本:出疹當(dāng)日至出疹后5天內(nèi)采集,越早越好。在咽喉部用無菌采樣拭子適度用力擦拭,獲得上皮細(xì)胞。將拭子放入有外螺旋蓋非滅活病毒采樣管(加抗生素)中。尿液標(biāo)本:用50mL帶螺旋蓋的無菌塑料離心管無菌收集30mL—50mL中段尿液,2000rpm/min離心5分鐘后,棄上清,沉淀用2mL標(biāo)本維持液或病毒運(yùn)輸液重懸。重懸后的標(biāo)本-70℃凍存。未經(jīng)離心的尿液不得冷凍。二、標(biāo)本運(yùn)送(一)血標(biāo)本。采集后應(yīng)盡快分離血清,分離后的血清標(biāo)本應(yīng)在2—8℃保存,并盡快運(yùn)送到麻疹風(fēng)疹網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室,如7天內(nèi)不能送達(dá)的,應(yīng)于-20℃以下保存,避免反復(fù)凍融。2(二)病原學(xué)標(biāo)本。標(biāo)本2—8℃保存,并盡快送達(dá)麻疹風(fēng)疹網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室。如48小時(shí)內(nèi)不能送達(dá)的,-70℃以下保存。無-70℃保存條件者,可在-20℃保存并于1周內(nèi)送達(dá)。三、實(shí)驗(yàn)室檢測(一)血清學(xué)檢測。常用的血清學(xué)檢測方法是酶聯(lián)免疫吸附(二)核酸檢測。常采用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法進(jìn)行麻疹風(fēng)疹病毒核酸檢測。1.提取核酸。常使用商品化的核酸提取試劑盒提取核酸,提取過程可手動(dòng)或使用自動(dòng)核酸提取儀提取。2.結(jié)果判定。參照試劑盒說明書進(jìn)行結(jié)果分析和判定。(三)基因分型。1.提取核酸。常使用商品化的核酸提取試劑盒提取核酸,提取過程可手動(dòng)或使用自動(dòng)核酸提取儀提取。2.靶基因擴(kuò)增。使用商品化的RT-PCR試劑盒進(jìn)行麻疹風(fēng)疹病毒靶基因的擴(kuò)增。3.序列測定、整理和分析。將靶基因擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列測定,使用序列分析軟件對(duì)獲得的序列進(jìn)行剪輯,獲得靶基因序列,將其與WHO參考株進(jìn)行序列比對(duì),獲得基因分型結(jié)果。(四)病毒分離。病原學(xué)標(biāo)本-70℃至少凍融一次,使病毒從上皮細(xì)胞釋放。取0.3mL—0.5mL標(biāo)本液接種于生長良好的單層傳代細(xì)胞系如Vero/3SLAM上,37℃吸附1小時(shí)—2小時(shí)后棄液,加入維持液,37℃培養(yǎng),次日觀察有無細(xì)胞毒性,必要時(shí)換液。接種后每天觀察細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE連續(xù)觀察7天,如果有特征性的麻疹病毒CPE出現(xiàn),觀察至75%以上的細(xì)胞發(fā)生病變(CPE+++-70℃凍存。若無CPE,-70℃凍化3次,再盲傳1代—2代。風(fēng)疹病毒35℃分離培養(yǎng)效果更好,通常風(fēng)疹病毒在細(xì)胞上沒有明顯的CPE,可直接盲傳三代后,-70℃凍存。收獲的病毒分離物可采用
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