測序與疾病研究系列01高通量測序技術(shù)在人體微生態(tài)研究中的應(yīng)用

?高通量測序技術(shù)在人體微態(tài)研究中的應(yīng)用解

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長知識金牌01020304人體微生態(tài)研究前沿微生態(tài)組學介紹研究思路與案例分享取樣方法CONTENTS課程目錄微生態(tài)研究前沿01微生物具有維持生態(tài)系統(tǒng)平衡、多樣性的重要功能，并與人類/動/植物健康、環(huán)境和食品安全等諸多方面密切相關(guān)解

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長知識金微生牌物組微生物組生活在某一生境（土壤、大氣、水體、人體、動/植物等）中微生物的總和。研究微生物 解讀大世界解

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|陪伴醫(yī)生科研成長微知生識物金組牌計劃巴西微生物組計劃美國國家微生物組計劃(NMI)非洲土壤微生物組計劃2016年微生物組計劃2017年微生物組計劃2017年12月-中國科學院微生物組計劃聚焦微生物組的功能網(wǎng)絡(luò)解析與調(diào)節(jié)機制創(chuàng)建微生物組功能解析技術(shù)與計算方法學建設(shè)中國微生物組數(shù)據(jù)庫與資源庫2017年10月-全球微生物基因組測序計劃計劃完成超過覆蓋人體、環(huán)境、海洋等主要方向的1000個微生物組樣本測序建立微生物基因組、微生物組資源共享和挖掘的國際標準體系建立全球權(quán)威的微生物組學參考數(shù)據(jù)庫和數(shù)據(jù)分析平臺DOI：10.1021/acsnano.5b07826;

10.1007/978-3-319-59997-7_1;

10.1038/539152a解螺

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長知識金牌人體微生態(tài)IF：29.886目前對人體微生物組的認知①人體菌群已證實與多種疾病相關(guān)，菌群研究正從描述和關(guān)聯(lián)性研究，向機制和應(yīng)用性研究轉(zhuǎn)變；②每個人高度個性化的菌群受許多因素共同影響：發(fā)育早期的遺傳和免疫互作、所處身體部位、飲食、抗生素、生活方式；③人體菌群不斷發(fā)生著動態(tài)變化，彈性和穩(wěn)定性在不同時間尺度上并存，菌群的變化率存在個體差異；④研究菌群在疾病中的作用機制應(yīng)注意：深入菌株層面，在人群研究中鑒定疾病相關(guān)菌群特征并用動物實驗驗證，菌群本身可作為疾病標志物；DOI:

10.1038/nm.4517解

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長Hooper

LV

et

al.,

Science,

2001;

Sender

R,

et

al.,

Cell,

2016;Lynch

S

V,et

al.,

New

England

Journal

of

Medicine,

2016.知識金牌腸道菌群——尚待被認知的器官腸道微生態(tài)：菌群+宿主的互作統(tǒng)一體人體重1-3%由細菌組成人體糞便干重50%以上為細菌及其“尸體”人腸道微生物：常見1000多種腸道細菌：約4×1013個99%以上由30-40種細菌構(gòu)成健康人腸道共生菌占99%以上腸道非冗余基因集：11.4

million腸道微生態(tài)促進營養(yǎng)吸收改善腸易激癥狀增強免疫功能防治腫瘤疾病緩解腸道炎癥調(diào)節(jié)血糖血脂①有益菌（如F.prausnitzii）寄生在表皮細胞粘膜層時，其分泌的短鏈脂肪酸（SCFA）進入細胞，會激活免疫抑制細胞（如T輔助細胞），阻斷炎癥反應(yīng)的發(fā)生；②當有益菌缺失或致病菌存在時，粘膜屏障會被破壞，粘膜層變薄、細胞間隙擴大，病原菌極其有毒代謝物進入細胞內(nèi)，從而激發(fā)炎癥反應(yīng)。解

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|陪伴醫(yī)生科研成長知識金牌DOI：10.1038/518S3a;10.1056/NEJMra1607547IF：40.137IF：72.406IBD：炎癥性腸?。║C、CD）IBS：腸易激綜合癥腸道微生態(tài)解

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科研成長知識金牌IF：30.41DOI：10.1016/j.cell.2016.10.027腸道微生物通過多種直接或間接機制向大腦傳遞訊息腸道菌群影響血腦屏障、髓鞘、神經(jīng)形成，小膠質(zhì)細胞成熟等基礎(chǔ)性神經(jīng)發(fā)育進程，調(diào)控動物的多種行為在焦慮、抑郁、認知缺陷和自閉癥中，腸道與大腦聯(lián)系密切中樞神經(jīng)系統(tǒng)和腸道微生物組血腦屏障神經(jīng)形成小膠質(zhì)細胞髓鞘形成腸道微生態(tài)醫(yī)生科研成長解

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伴B.

Sampaio-Maiaet

al.,Oral

Microbiome

in

Health

and

Disease.

2016；Baker

J

Let

al.,Trends

in

Microbiology,2017知識金牌口腔微生態(tài)口腔不同部位常見菌群不同口腔微生物類群之間和內(nèi)部互作冠心病與口腔菌群口腔是人體菌群多樣性最高的部位之一，與人體健康息息相關(guān)解螺旋|長知識金牌呼吸道微生態(tài)陪伴醫(yī)生科研成10.1038/nrmicro.2017.14；10.1016/j.chom.2017.03.011呼吸道菌群：呼吸道健康的守門人Oh

J

etal.,

Cell,2016;

BrandweinM

etal.,

npj

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Mi|crob陪iom伴es醫(yī),20生16科;E研g(shù)er成tM長et

al.,Clinical

Pharmacology

&

Therapeutics,2017;CampbellDJ

et

al.,

Cell

Host

&

Microbe,2017知識金牌皮膚菌群與肥大細胞互作，防止病原體入侵皮膚健康人群與過敏性皮炎皮膚菌群皮膚菌群調(diào)節(jié)皮膚免疫系統(tǒng)，維持皮膚穩(wěn)態(tài)皮膚的微生物可能通過特定產(chǎn)物如抗菌肽的釋放、代謝或直接捕獲樹突細胞發(fā)揮作用皮膚微生態(tài)解

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科研成長知識金牌常

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菌

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菌

（Lactobacillus）、普氏菌屬（Prevotella）、鏈接菌屬（Streptococcus）、陰道加德菌（gardnerella vaginalis）、纖毛菌屬（Sneathia）。乳酸菌（Lactobacillus）作用：產(chǎn)生乳酸，降低陰道pH，抑菌和殺菌作用；生殖系統(tǒng)微生態(tài)解螺旋|陪伴醫(yī)生科研成長知識金牌IF：37.205腸道菌群與疾病治療腫瘤免疫治療，基于菌群的精準醫(yī)療時代來臨DOI：10.1126/science.aar2946①臨床前動物模型中，細菌可調(diào)節(jié)化療及免疫療法的抗癌效果，近期研究關(guān)注人體腸道菌群對抗癌藥物的影響②PD-1單抗對于肺癌、腎癌等上皮細胞腫瘤的療效受腸道菌群影響，抗生素顯著降低患者的平均生存期，Akk菌可能改善PD-1單抗的療效③PD-1單抗治療黑色素瘤的效果與腸道菌群組成相關(guān)，柔嫩梭菌豐度較高的患者無進展生存期較長④PD-1單抗治療轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的效果與腸道菌群相關(guān)，長雙歧桿菌、產(chǎn)氣柯林斯菌和屎腸球菌的豐度影響療效知識金牌解螺旋|青霉素誘導幼鼠腸道菌群及行為改變陪伴醫(yī)生科研成長大有可為的二代益生菌菊粉或能預防小鼠的心血管疾病飲食、益生菌和藥物等調(diào)節(jié)腸道菌群蔓越莓調(diào)節(jié)腸道菌群，降低心血管疾病風險？

宏基因組方法研究烏龍茶多酚對高脂飲食誘導的肥胖小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)和功能的影響解螺旋|陪伴醫(yī)生科研成長知識金牌微生物多樣性：群落中有哪些微生物？宏基因組：這些微生物能干什么？宏轉(zhuǎn)錄組：這些微生物要干什么？多組學：這些微生物為什么這么干？高通量測序微生態(tài)組學介紹02解

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長微生物知多樣識性金研究牌16Sgenome

size:~5Mb微生物多樣性測序（又稱擴增子測序），是利用二/三代測序平臺，對16S

rDNA/18SrDNA/ITS/功能基因等的特定PCR產(chǎn)物進行高通量測序，突破傳統(tǒng)微生物不可培養(yǎng)的缺點，獲得環(huán)境樣本中的微生物群落結(jié)構(gòu)、進化關(guān)系以及微生物與環(huán)境相關(guān)性等信息。常見Marker

gene：細菌：16S真菌：ITS，18S功能基因：AOA，AOB，nirK，nifH，McrA解

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長知識金牌測序引物選擇-Illumina

MiSeqPlatform解

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長知識金牌同一客戶項目同一實驗員，同一方法，同一條件，同一流程微生物多樣性測序分析流程解螺旋|陪伴醫(yī)生科研成長交互式云平知臺識分金析牌生物信息挖掘進入交互時代http://www.i-/宏基因組云平臺強勢來襲，全面上線！解

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長知識金牌微生物多樣性分析流程知識金牌1、物種注釋與評估數(shù)據(jù)優(yōu)化統(tǒng)計OTU聚類分類學分析Pan/Core物種分析α多樣性指數(shù)分析α多樣性指數(shù)差異檢驗稀釋曲線分析2、物種組成分析物種Venn圖分析群落Heatmap圖群落Bar圖群落Pie圖多級物種Sunburst圖Circos樣本與物種關(guān)系圖稀釋曲線判斷測序深度是否足夠多樣性指數(shù)差異檢驗解

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長物種Venn圖分析微生物多樣性分析內(nèi)容解螺旋多級|

物種陪S伴un醫(yī)b生ur科st圖研成長知識金牌群落Bar圖群落Pie圖Circos樣本與物種關(guān)系圖群落Heatmap2、物種組成分析物種Venn圖分析群落Heatmap圖群落Bar圖群落Pie圖多級物種Sunburst圖Circos樣本與物種關(guān)系圖微生物多樣性分析內(nèi)容解螺旋|陪伴醫(yī)生科研成長ANOSIM/Adnois知識金牌3、樣本比較分析樣本層次聚類分析PCA主成分分析PCoA主坐標分析NMDS非度量多維尺度分析ANOSIM相似性分析ANOSIM相似性分析Adonis多因素方差分析PLS-DA偏最小二乘判別分析NMDS樣本層次聚類樹PCoAPCA微生物多樣性分析內(nèi)容解螺旋知識金牌LEfSe分析屬門4、物種差異分析LDA

Effect

Size(LEfSe

分析)Ternary三元相圖MetagenomeSeq分析多組物種差異分析兩組物種差異分析兩樣本物種差異分析兩樣本差異分析|

陪伴醫(yī)生科研成長兩組物種差異分析多組物種差異分析微生物多樣性分析內(nèi)容解

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長知識金牌5、關(guān)聯(lián)與模型預測分析(層級)相關(guān)性Heatmap圖RDA/CCA分析Mantel

Test分析Network網(wǎng)絡(luò)分析樣本與物種的共線性關(guān)系圖隨機森林分析ROC曲線環(huán)境因子排序回歸分析SourceTracker分析RDA/CCA分析物種物種相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖環(huán)境因子相關(guān)性Heatmap圖隨機森林分類ROC曲線微生物多樣性分析內(nèi)容解

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伴醫(yī)生科研成長知識金牌7、16S功能預測COG功能預測KEGG功能預測KEGG

pathway微生物多樣性分析內(nèi)容解

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|陪伴醫(yī)生科研成長知識金牌如何從大量的多樣性樣本中挑選代表性樣本做宏基因組？多樣性宏基因組MicroPITA解螺旋|陪伴醫(yī)生科研成長知識金牌全球宏基因組研究現(xiàn)狀DOI：10.1007/s00294-017-0693-8全球宏基因組文章發(fā)表統(tǒng)計1580篇Manor

O

et

al.,

Cell

Host

&

Microbe,

2017.解

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|陪伴醫(yī)生科研成長知識金牌宏基因組宏基因組(Metagenome)：生態(tài)環(huán)境中全部微小生物的基因組(Handelsmanetal.,1998)。16SMetagenome多樣性宏基因組物種組成√√物種豐度√√基因預測×√功能注釋×√代謝通路×√功能分析×√……解螺旋|陪伴醫(yī)生科研成長知識金牌物種與功能注釋物種與功能分析宏基因組測序分析流程測序流程分析流程解螺旋|陪伴醫(yī)生科研成長知識金牌宏基因組分析內(nèi)容1、物種與功能注釋物種分類學注釋COG功能注釋KEGG功能注釋碳水化合物活性酶注釋抗生素抗性基因注釋毒力因子注釋PHI病原與宿主互作注釋KEGG

Pathway注釋物種分類注釋COG功能注釋碳水化合物活性酶的注釋 比對CAZy數(shù)據(jù)庫，適用于木質(zhì)纖維素分解、糖代謝、食草動物瘤胃等相關(guān)研究?？股乜剐曰虻淖⑨?比對ARDB/CARD數(shù)據(jù)庫，適用于抗生素、抗菌劑、環(huán)境治理等方面的研究。研究思路與案例分享03解螺旋|陪伴醫(yī)生科研成長知識金牌Doi:10.1038/nrmicro3451研究思路IF：23.574解

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生科研成長知識金牌DOI：10.1038/nrmicro.2016.83IF：24.727研究思路解螺旋|陪伴醫(yī)生科研成D長OI:

10.1016/j.neurobiolaging.2017.09.023知識金牌樣本：糞便樣本(n=25+32)檢測方法：16S多樣性&q-PCR漸凍人(肌萎縮性側(cè)索硬化ALS)糞便菌群與健康人無異IF：5.117文獻案例1-漸凍癥解螺旋|陪伴醫(yī)生科研成D長OI:

10.1016/j.neurobiolaging.2017.09.023知識金牌ALS患者與健康人群基本信息ALS患者與健康人群有相似的年齡、性別比例和BMI。(Functional

vital

capacity)解

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科研成D長OI:

10.1016/j.neurobiolaging.2017.09.023知識金牌ALS患者與健康人群菌群多樣性ALS患者與健康人群細菌總量無顯著 差異(P=0.91)；ALS患者與健康人群菌群多樣性(α多 樣性)無顯著差異(P=0.199)；ALS患者與健康人群菌群組成(β多樣 性)無顯著差異(P=0.42，PERMANOVA:r2=0.02)；解螺旋|陪伴醫(yī)生科研成D長OI:

10.1016/j.neurobiolaging.2017.09.023知識金牌ALS患者與健康人群菌群組成共檢測到336個genus，ALS患者與健康人群菌群無顯著差異(僅uncultured Ruminococcaceae在2組間差異顯著，P=0.027)；解

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醫(yī)生科研成D長OI:

10.1016/j.neurobiolaging.2017.09.023知識金牌ALS患者與健康人群菌群功能組成ALS患者與健康人菌群在功能組成上 無顯著差異；解螺旋|陪伴醫(yī)生科研成D長OI:

10.1016/j.neurobiolaging.2017.09.023知識金牌案例分析內(nèi)容解螺旋

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長知識金牌測序項目：多樣性測序平臺：Illumina

MiSeq

PE300樣本類型：糞便樣本數(shù)量：193分組設(shè)置：實驗組、對照組、驗證組測序量：平均每個樣本34,661cleanreads/10.1136/gutjnl-2016-313332美吉客戶文章仁濟醫(yī)院馬雄團隊IF=

16.658原發(fā)性膽汁性膽管炎患者腸道菌群改變并可以在UDCA治療后部分恢復文獻案例-原發(fā)性膽汁性膽管炎解螺旋|陪伴醫(yī)生科研成長知識金牌PBC初治患者腸道菌群失調(diào)與健康人相比，PBC初治患者腸道菌群豐度降低；PBC初治患者與健康人腸道菌群能夠明顯分離出來；物種豐度可以解釋菌群在PC1軸上的差異。PERMANOVA，p=0.001腸道菌群診斷模型能夠準確區(qū)解分螺PB旋C患|者陪和伴健醫(yī)康生人科研成長知識金牌利用12種PBC相關(guān)的屬作為標記微生物區(qū)別疾病狀態(tài)AUC=0.86AUC=0.84實驗組驗證組健康人富集PBC患者富集解螺旋|陪伴醫(yī)生科研成長知識金牌UDCA治療使得PBC腸道菌群失調(diào)部分改善PBC

富集的屬Haemophilus,Streptococcus和Pseudomonas在UDCA治療后顯著降低；健康人中富集的四種屬，有三種屬（Bacteroidetes,Sutterella和Oscillospira）在治療后的患者中增加；雖然治療后Veillonella在患者腸道內(nèi)并未降低，但其相對豐度在療效欠佳的患者中顯著高于療效好的患者。解螺旋|陪伴醫(yī)生科研成長知識金牌PBC患者菌群功能改變PBC富集的通路：細菌侵入上皮細胞，過氧化物酶增殖激活受體信號通路和己內(nèi)酰胺退化；健康人富集的通路：參與新陳代謝、氨基酸生物合成（如丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸）以及ɑ亞麻油酸新陳代謝的蛋白過表達。16S功能預測分析解

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長知識金牌案例分析內(nèi)容解螺旋|陪伴醫(yī)生科研成長知識金牌DOI:

10.1128/mBio.01926-14IF：6.956齦下微生物組的動態(tài)變化及其用于牙周炎診斷和預后的潛能樣本類型：齦下牙菌斑(n=48)組學技術(shù)：宏基因組測序量：42.3million

reads/樣本文獻案例-牙周炎解螺旋|陪伴醫(yī)生科研成長知識金牌齦下微生物組成及動態(tài)變化DOI:

10.1128/mBio.01926-14共檢測出38個豐度大于1%的屬。其中，Prevotella和Fusobacterium豐度最高；治療前后β多樣性有顯著變化（ANOSIM分析顯示p<0.001）；解螺旋|陪伴醫(yī)生科研成長知識金牌齦下微生物組成及動態(tài)變化疾病狀態(tài)下，大部分是厭氧菌， 而治愈狀態(tài)下，大部分是兼性厭 氧或者好氧菌，8種菌在疾病狀 態(tài)下的豐度較高，包括卟啉單胞 菌（Porphyromonas）、密螺 旋體屬（Treponema）和坦納 菌屬（Tannerella）；治愈情況下有一些豐度高的菌， 說明疾病是由一組病原菌導致的，而不是單個的菌；DOI:

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長知識金牌齦下微生物中與牙周炎相關(guān)的微生物的共存關(guān)系疾病狀態(tài)下菌群共存強度要顯著大于治愈狀態(tài)，表明早期微生物之間的協(xié)同和晚期的定 植促進疾病發(fā)生。治愈后，改變了這些菌群間的關(guān)系；健康相關(guān)菌的豐度有所增加，疾病相關(guān)微生物（紅色和橘色）和健康相關(guān)微生物（黃色、綠色和紫色）之間并無相關(guān)性，證明這兩組微生物之間存在對立關(guān)系；DOI:

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成長知識金牌牙周炎相關(guān)的功能通路疾病狀態(tài)下，與鞭毛裝配、細菌趨 藥性（牙周炎的毒力因子）相關(guān)的 基因豐度較高。趨藥性的運動能力 提高了病原菌對營養(yǎng)的攝取能力， 幫助了病原菌的定植，進而利于滲 透進入口腔上皮細胞；疾病相關(guān)菌的降解過程要多于合成 過程。說明齦下微生物可隨著功能 來改變豐度，進而適應(yīng)宿主的環(huán)境 的變化。DOI:

10.1128/mBio.01926-14解螺旋|陪伴醫(yī)生科研成長知識金牌解

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|陪伴醫(yī)生科研成長知識金牌疾病相關(guān)菌微生物相關(guān)疾病Bacteroidaceae

sp.痛風Bacteroides痛風、類風濕性關(guān)節(jié)炎、全身性紅斑狼瘡、糖尿病Clostridium（梭菌）T2D、痛風Porphyromonadaceae（紫單胞菌科）腸道中機會致病菌（痛風、強直性脊柱炎、克羅恩?。㏑hodococcus（紅球菌屬）痛風、克羅恩病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）Erysipelatoclostridium腸道中機會致病菌（痛風）Anaerolineaceae（厭氧繩菌科）腸道中機會致病菌（痛風）Prevotella（普氏菌）來源于口腔和陰道牙周疾病、類風濕性關(guān)節(jié)炎Klebsiella（克雷伯氏菌）口腔致病菌、高血壓Porphyromonas（卟啉單胞菌屬）口腔致病菌、結(jié)直腸癌Faecalibacterium（糞桿菌屬）腸道有益菌Lactobacillus（乳桿菌）肝硬化Roseburia（羅氏菌）腸道有益菌Bifidobacterium（雙歧桿菌）腸道有益菌propionibacterium

acnes（丙酸痤瘡桿菌）痤瘡Fusobacterium（梭桿菌）肝硬化、結(jié)直腸癌、潰瘍性結(jié)腸炎、高血壓期刊名稱影響因子研究方向Nature

Biotechnology41.667生物工程與應(yīng)用微生物Nature

MicrobiologyNA微生物學Nature40.137綜合性期刊Science37.205綜合性期刊Nature

Reviews

Microbiology26.819微生物學Cell

Host

&

Microbe14.946微生物學FEMS

microbiology

reviews12.198微生物學Nature

Communications12.124綜合性期刊Trends

in

Biotechnology11.126生物工程與應(yīng)用微生物Trends

in

Microbiology11.02微生物學Nucleic

Acids

Research10.162生化與分子生物學Nature

Protocols10.032生化研究方法The

ISME

Journal9.664微生物學PNAS9.661綜合性期刊Annual

Review

of

Microbiology9.415微生物學Microbiome8.496微生物學Water

Research6.942環(huán)境科學與工程學mBio6.956微生物學Current

opinion

in

microbiology6.635微生物學Global

environmental

change6.327環(huán)境科學Environmental

science

&

technology6.198環(huán)境科學與工程學Bioresource

Technology5.651生物工程與應(yīng)用微生物Environmental

Microbio