生乳及巴氏殺菌乳中嗜冷菌的測(cè)定快速培養(yǎng)法

1生乳及巴氏殺菌乳中嗜冷菌的測(cè)定快速培養(yǎng)法本文件描述了生乳及巴氏殺菌乳中嗜冷菌測(cè)定的快速培養(yǎng)法。本文件適用于生乳及巴氏殺菌乳中嗜冷菌的快速測(cè)定。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB4789.1GB/T66823術(shù)語(yǔ)和定義食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)總則分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法本文件沒(méi)有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義。4原理試樣懸浮液與44℃-47℃的乳平板計(jì)數(shù)（MPC）瓊脂于平板中混合，于21℃條件下培養(yǎng)25h，菌落計(jì)數(shù)，算出每mL（g）檢樣中的嗜冷菌數(shù)量。5試劑或材料除非另有規(guī)定，僅使用分析純?cè)噭?.1水：GB/T6682，一級(jí)。5.2無(wú)菌磷酸鹽緩沖液儲(chǔ)備液：稱取34.0g的磷酸二氫鉀溶于500mL蒸餾水中，用約175mL的1mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7.2，用蒸餾水稀釋至1000mL后，4℃貯存。25.3無(wú)菌磷酸鹽緩沖液工作液：取磷酸鹽緩沖液儲(chǔ)備液（5.2）1.25mL，用蒸餾水稀釋至1000mL，分裝于適宜容器中，121℃高壓滅菌15min。5.4無(wú)菌生理鹽水：稱取8.5g氯化鈉溶于1000mL蒸餾水中，121℃高壓滅菌15min。5.5MPC瓊脂：稱取5.0g酪蛋白胨、2.5g酵母提取物、1.0g無(wú)水葡萄糖和1.0g不含抑制性物質(zhì)的脫脂奶粉溶于1000mL蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH至7.0±0.1。加入9.0~18.0g瓊脂1，煮沸溶解，分裝于適宜容器，密封后，121℃高壓滅菌15min。6儀器設(shè)備6.1恒溫培養(yǎng)箱：溫度為21℃±1℃。6.2高壓滅菌鍋。6.3培養(yǎng)皿：直徑90mm。6.4pH計(jì)：25℃時(shí)精度為±0.1。6.5移液器：0.1mL和1mL，配無(wú)菌槍頭。6.6天平：精度為±0.1g。6.7水浴鍋。6.8振蕩器。6.9均質(zhì)器。6.10菌落計(jì)數(shù)裝置（可選例如，由帶黑暗背景的發(fā)光基座、裝有輔助菌落數(shù)檢測(cè)的放大鏡和（可選）機(jī)械或電子式數(shù)字計(jì)數(shù)器組成。7樣品樣品的采集按GB4789.1執(zhí)行。8檢驗(yàn)程序嗜冷菌的快速檢驗(yàn)程序見(jiàn)圖1。1）基于瓊脂的凝膠程度。3圖1嗜冷菌快速檢驗(yàn)程序9試驗(yàn)步驟9.1取25mL（g）樣品置于盛有225mL無(wú)菌磷酸鹽緩沖液（5.3）或無(wú)菌生理鹽水（5.4）的無(wú)菌錐形瓶或無(wú)菌均質(zhì)袋中，混勻，制成1:10的樣品勻液。9.2用1mL移液器（6.5）吸取樣品勻液（9.1）1mL，沿管壁緩慢注于盛有9mL稀釋液的無(wú)菌試管中（注意槍頭尖端不應(yīng)觸及稀釋液面），振蕩混勻，制成1:100的樣品勻液。9.3按9.2操作，制備10倍系列稀釋樣品勻液。每次稀釋均使用新的無(wú)菌槍頭。9.4選擇適宜稀釋度的樣品勻液（至少2個(gè)連續(xù)稀釋度），取1mL樣品勻液于培養(yǎng)皿（6.3）內(nèi)，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)培養(yǎng)皿。同時(shí)，分別吸取1mL空白稀釋液加入兩個(gè)培養(yǎng)皿（6.3）內(nèi)作空白對(duì)照。49.5將12mL~15mL冷卻至44℃~47℃的MPC瓊脂（5.5）傾注培養(yǎng)皿，從初始懸浮液制備結(jié)束到將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿（6.3）之間的時(shí)間不應(yīng)超過(guò)45min。轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿使樣品勻液與培養(yǎng)基均勻混合，冷9.6待瓊脂凝固后，將培養(yǎng)皿（9.5）倒置，21℃±1℃培養(yǎng)25h±1h。10菌落計(jì)數(shù)10.1可用肉眼觀察，必要時(shí)用放大鏡或菌落計(jì)數(shù)裝置（6.10），記錄稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的菌落數(shù)量。菌落計(jì)數(shù)以菌落形成單位（ColonyFormUnit,CFU）表示。10.2選取菌落數(shù)在10CFU～300CFU之間、無(wú)蔓延菌落生長(zhǎng)的平板計(jì)數(shù)菌落總數(shù)。低于10CFU的平板記錄具體菌落數(shù)，大于300CFU的可記錄為“多不可計(jì)”。10.3當(dāng)平板上出現(xiàn)菌落間無(wú)明顯界線的鏈狀生長(zhǎng)時(shí)，則將每條單鏈作為一個(gè)菌落計(jì)數(shù)。其中平板有較大片狀菌落生長(zhǎng)時(shí)，則不宜采用，而應(yīng)以無(wú)較大片狀菌落生長(zhǎng)的平板作為該稀釋度的菌落數(shù)；若片狀菌落不到平板的四分之一，而其余四分之三中菌落分布又很均勻，可通過(guò)推算，以代表一個(gè)平板的菌落數(shù)。11試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理結(jié)果計(jì)算11.1若只有1個(gè)稀釋度平板上的菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)，計(jì)算兩個(gè)平板菌落數(shù)的平均值，再將平均值乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)，作為每mL（g）試樣中嗜冷菌計(jì)數(shù)結(jié)果。11.2若有兩個(gè)及以上連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)時(shí)，按下列公式計(jì)算：試樣中嗜冷菌數(shù)量以N計(jì)，單位為菌落形成單位每毫升（克）[CFU/mL（g）]，按式（1）計(jì)算。式中：ΣC——平板（含適宜范圍菌落數(shù)的平板）菌落數(shù)之和，單位為菌落形成單位（CFUn1——第一稀釋度（低稀釋倍數(shù)）平板個(gè)數(shù)；n2——第二稀釋度（高稀釋倍數(shù)）平板個(gè)數(shù)；d——第一稀釋度稀釋因子。12結(jié)果報(bào)告512.1若所有稀釋度培養(yǎng)皿中菌落數(shù)均少于10CFU，結(jié)果報(bào)告為“樣品中嗜冷菌計(jì)數(shù)小于10×1/dCFU/mL（g）,式中d為最低稀釋液的稀釋度。12.2若所有稀釋度的平板上菌落數(shù)均大于300CFU，則對(duì)稀釋度最高的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，其他平板可記錄為多不可計(jì)，結(jié)果按平均菌落數(shù)乘以最高稀釋倍數(shù)計(jì)算。12.3嗜冷菌計(jì)數(shù)小于100CFU時(shí)，按“四舍五入”原則修約，以整數(shù)報(bào)告。12.4嗜冷菌計(jì)數(shù)大于或等于100CFU時(shí)，第三位數(shù)字采用“四舍五入”原則修約后，保留兩位有效數(shù)字，后面用0代替位數(shù)；也可用10的指數(shù)形式來(lái)表示，按“四舍五入”原則修約后，保留兩位有效數(shù)字。12.5若空白對(duì)照上有菌落生長(zhǎng)，則此次檢驗(yàn)結(jié)果無(wú)效。6結(jié)構(gòu)編號(hào)對(duì)照一覽表和技術(shù)差異及其原因一覽表結(jié)構(gòu)編號(hào)對(duì)照一覽表見(jiàn)表A.1,技術(shù)差異及其原因一覽表見(jiàn)表A.2。表A.1本文件與ISO17410:2019結(jié)構(gòu)編號(hào)對(duì)照一覽表本文件結(jié)構(gòu)編號(hào)ISO17410:2019結(jié)構(gòu)編號(hào)1AnnexBB.122334455-5.2-5.3-5.4AnnexAA.3.1666.36.26.46.36.56.46.66.56.86.6-6.76.106.8-6.9-6.10778-9AnnexBB.39.2AnnexBB.3.2.1、B.3.2.29.3AnnexBB.3.2.39.4AnnexBB.3.2.49.5AnnexBB.3.2.5、B.3.2.69.6AnnexBB.3.2.79.39.3.1、AnnexBB.3.1-9.3.2-------表A.2本文件與ISO17410:2019技術(shù)差異及其原因的一覽表本文件結(jié)構(gòu)編號(hào)技術(shù)差異原因2規(guī)范性引用文件更改為中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)ISO17410:2019引用ISO標(biāo)準(zhǔn)為規(guī)范性引用文件，本文件更改為中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)8刪除嗜冷微生物定義本文件僅進(jìn)行嗜冷菌檢測(cè)增加無(wú)菌磷酸鹽緩沖液儲(chǔ)備液的配制方法增加可操作性，便于本文件的應(yīng)用5.2增加無(wú)菌磷酸鹽緩沖液工作液的配制方法增加可操作性，便于本文件的應(yīng)用5.3增加無(wú)菌生理鹽水的配制方法增加可操作性，便于本文件的應(yīng)用5.4增加天平增加可操作性，便于本文件的應(yīng)用6.6增加振蕩器增加可操作性，便于本文件的應(yīng)用6.8增加均質(zhì)器增加可操作性，便于本文件的應(yīng)用7明確樣品采集的要求增加可操作性，便于本文件的應(yīng)用8增加檢驗(yàn)程序的說(shuō)明增加可操作性，便于本文件的應(yīng)用9.4增加空白對(duì)照增加