2020版脊髓性肌萎縮癥遺傳學(xué)診斷專家共識(shí)(全文)

2020版：脊髓性肌萎縮癥遺傳學(xué)診斷專家共識(shí)（全文）脊髓性肌萎縮癥（spinalmuscularatrophy，SMA）是兒童最常見(jiàn)的神經(jīng)肌肉病，以脊髓前角α-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元退化變性導(dǎo)致的肌無(wú)力和肌萎縮為主要臨床特征。本共識(shí)中SMA特指位于5q13的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活基因1（SMN1；OMIM600354）致病性變異所導(dǎo)致的5q-SMA。SMA發(fā)病率約為1/10000，人群攜帶率約為1/50[\t"/CN112137202040/_blank"1]。2019年中國(guó)大陸上市了疾病修正治療藥物諾西那生鈉注射液，也相繼發(fā)表了SMA多學(xué)科管理專家共識(shí)[\t"/CN112137202040/_blank"2]，標(biāo)志著SMA在我國(guó)進(jìn)入了一個(gè)全新的精準(zhǔn)診治和管理時(shí)期。SMA的攜帶者和新生兒篩查在一些國(guó)家和地區(qū)已常規(guī)開(kāi)展[\t"/CN112137202040/_blank"3,\t"/CN112137202040/_blank"4]，我國(guó)一些地區(qū)也逐漸開(kāi)始篩查[\t"/CN112137202040/_blank"5,\t"/CN112137202040/_blank"6]，SMA預(yù)防窗口進(jìn)一步提前。SMA的致病基因SMN1和修飾基因SMN2（OMIM601627）高度同源，SMN1決定疾病的發(fā)生，SMN2影響疾病的嚴(yán)重程度和進(jìn)展，使得SMA的遺傳學(xué)診斷不同于絕大多數(shù)單基因遺傳病。規(guī)范SMA遺傳學(xué)診斷及應(yīng)用對(duì)于臨床診治、管理、預(yù)防和遺傳咨詢將提供重要幫助。本共識(shí)參照國(guó)內(nèi)外近年SMA臨床診療實(shí)踐和指南共識(shí)[\t"/CN112137202040/_blank"2,\t"/CN112137202040/_blank"7,\t"/CN112137202040/_blank"8,\t"/CN112137202040/_blank"9,\t"/CN112137202040/_blank"10]，由具有實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)的多學(xué)科專家研究起草，包括了患者和攜帶者基因型、基因診斷技術(shù)的適用性和局限性，以及基因診斷、產(chǎn)前診斷、植入前遺傳學(xué)檢測(cè)和攜帶者篩查的要點(diǎn)及遺傳咨詢等內(nèi)容，并對(duì)SMN2拷貝數(shù)的臨床價(jià)值提出了一些建議。旨在為醫(yī)生和實(shí)驗(yàn)室人員的臨床實(shí)踐提供指導(dǎo)幫助。臨床表現(xiàn)與分型SMA患者起病年齡差異性大，從出生前至成人期均可發(fā)病。主要表現(xiàn)為以四肢近端為主的進(jìn)行性肌無(wú)力和肌萎縮，隨著疾病進(jìn)展，可出現(xiàn)呼吸、消化、骨骼等多系統(tǒng)受累。根據(jù)起病年齡、運(yùn)動(dòng)里程碑及病情進(jìn)展程度，SMA分為五型。近年的臨床實(shí)踐趨于將每型SMA進(jìn)一步分為亞型，以便更好地理解自然病程和觀察藥物療效（\t"/CN112137202040/_blank"表1）[\t"/CN112137202040/_blank"11,\t"/CN112137202040/_blank"12,\t"/CN112137202040/_blank"13]。表1脊髓性肌萎縮癥的分型和臨床表現(xiàn)診斷與鑒別診斷1．SMA一般臨床診斷過(guò)程如下：（1）臨床評(píng)估：臨床醫(yī)師根據(jù)病史查體擬診，主要臨床特點(diǎn)為進(jìn)行性、對(duì)稱性四肢和軀干的肌無(wú)力，近端重于遠(yuǎn)端，下肢重于上肢，有時(shí)可見(jiàn)舌肌纖顫、手震顫；（2）臨床檢測(cè)：包括血肌酶譜，肌酸激酶（CK）值正?；蜉p度升高，絕大多數(shù)患者不超過(guò)正常值的10倍，肌電圖提示神經(jīng)源性損害；（3）基因檢測(cè)顯示SMN1外顯子7純合缺失或SMN1復(fù)合雜合突變，陽(yáng)性結(jié)果可確診SMA；（4）基因檢測(cè)陰性結(jié)果患者需行肌電圖及肌肉活檢，幫助診斷與鑒別診斷[\t"/CN112137202040/_blank"11]（\t"/CN112137202040/_blank"圖1）。SMA的臨床分型主要依據(jù)患者起病年齡和獲得的運(yùn)動(dòng)里程碑，并參考SMN2拷貝數(shù)（\t"/CN112137202040/_blank"表1）。部分患者的運(yùn)動(dòng)里程碑獲得遲于健康個(gè)體，因此，建議對(duì)患者進(jìn)行定期隨訪。圖1SMA診斷流程圖2．SMA鑒別診斷：當(dāng)疑似患者的基因檢測(cè)未見(jiàn)SMN1雙等位基因致病變異，或癥狀不典型，或伴有非SMA臨床表現(xiàn)時(shí)，進(jìn)行以肌無(wú)力為主要癥狀的其他疾病的鑒別診斷非常必要。6個(gè)月以下患兒需鑒別其他軟嬰綜合征，6~18個(gè)月患兒需鑒別嬰幼兒時(shí)期起病的神經(jīng)肌肉病。成年期患者需鑒別成人期起病的神經(jīng)肌肉病。因需鑒別的疾病種類繁多，常選擇二代測(cè)序技術(shù)（NGS）及其他高通量診斷技術(shù)（\t"/CN112137202040/_blank"表2）。表2SMA的鑒別診斷致病機(jī)制與遺傳學(xué)診斷基礎(chǔ)SMA為常染色體隱性遺傳病。致病基因SMN1（NG_008691.1）定位于5q13.2，轉(zhuǎn)錄本編號(hào)NM_000344.3，其編碼的全長(zhǎng)SMN蛋白（NP_000335.1）在各組織細(xì)胞廣泛表達(dá)，參與剪接體蛋白復(fù)合體的組裝，是真核細(xì)胞生物生存所必需的管家蛋白[\t"/CN112137202040/_blank"14]。SMN1雙等位基因發(fā)生致病性變異通常導(dǎo)致SMA發(fā)生。SMA病理生理學(xué)表現(xiàn)為脊髓前角α-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元退行性病變和神經(jīng)肌肉接頭發(fā)育異常。一、SMN1突變基因型和變異頻率98%的SMA患者的SMN1雙等位基因變異分別遺傳自雙親，2%患者有一個(gè)等位基因發(fā)生新生變異[\t"/CN112137202040/_blank"15]。SMA突變基因型主要有兩類：95%由SMN1雙等位基因純合缺失所致，即[0+0]基因型；5%由SMN1復(fù)合雜合突變所致，即一個(gè)等位基因缺失，另一個(gè)等位基因發(fā)生微小致病性變異，為[0+1d]基因型。SMN1雙等位基因均為微小致病性變異，即[1d+1d]基因型，非常罕見(jiàn)，目前僅有白種人近親婚配的病例報(bào)道。SMN1缺失大部分為外顯子7合并外顯子8共同缺失，少部分僅為外顯子7缺失。由于外顯子8位于非編碼區(qū)，SMN1缺失通常指外顯子7缺失。SMN1微小致病性變異在不同種族患者中表現(xiàn)不同的變異譜系，目前國(guó)內(nèi)外已報(bào)道的微小致病性變異約90種（http://www.hgmd.cf.ac.uk），中國(guó)患者已報(bào)道[\t"/CN112137202040/_blank"16,\t"/CN112137202040/_blank"17,\t"/CN112137202040/_blank"18,\t"/CN112137202040/_blank"19,\t"/CN112137202040/_blank"20,\t"/CN112137202040/_blank"21,\t"/CN112137202040/_blank"22]近30種，其中檢測(cè)頻次≥2，并經(jīng)美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳與基因組學(xué)學(xué)會(huì)（ACMG）致病性評(píng)估[\t"/CN112137202040/_blank"23,\t"/CN112137202040/_blank"24]確認(rèn)為是致病性微小變異有7種（\t"/CN112137202040/_blank"表3）。表3中國(guó)SMA較常見(jiàn)的微小致病性變異二、SMN2表型修飾及臨床意義SMN2全長(zhǎng)mRNA編碼與SMN1相同的SMN蛋白。SMN2與SMN1的序列同源性>99.9%，兩者僅存在5個(gè)堿基差異，其中在第7外顯子第6位c.840的C/T，導(dǎo)致90%的SMN2mRNA外顯子7被選擇性剪接，僅有10%的SMN2表達(dá)全長(zhǎng)有功能SMN蛋白[\t"/CN112137202040/_blank"25]。SMN1和SMN2均位于5q13.2，該區(qū)域存在包括SMN在內(nèi)的多對(duì)同源基因?qū)е禄蚪M不均等的互換和基因轉(zhuǎn)換，出現(xiàn)SMN1和SMN2拷貝數(shù)的多種變化。在SMA患者中可以見(jiàn)到SMN1真實(shí)缺失，SMN1∶SMN2拷貝數(shù)通常為0∶2，約占中國(guó)SMA人群28%[\t"/CN112137202040/_blank"16]；還有SMN1轉(zhuǎn)換為SMN2導(dǎo)致的SMN1缺失和SMN2增加，或者SMN1真實(shí)缺失伴隨SMN2重復(fù)，這兩類情況SMN1∶SMN2拷貝數(shù)為0∶3或者0∶4，約占62%[\t"/CN112137202040/_blank"16]；同時(shí)，SMN1和SMN2之間還存在部分轉(zhuǎn)換，出現(xiàn)SMN1-SMN2融合基因，患者僅見(jiàn)SMN1外顯子7缺失，外顯子8不缺失，約占6%[\t"/CN112137202040/_blank"16]。在一般人群中正常個(gè)體的SMN1基因至少為1拷貝，而SMN2基因可以為0拷貝，絕大數(shù)個(gè)體的SMN1∶SMN2拷貝數(shù)為2∶2，但也有正常個(gè)體SMN1基因多于2拷貝。SMN2拷貝數(shù)是目前公認(rèn)的SMA修飾因子，患者攜帶SMN2拷貝數(shù)越多表型越輕，盡管其與表型的相關(guān)性不完全一致，在國(guó)內(nèi)外管理共識(shí)中仍將SMN2拷貝數(shù)作為SMA診斷的標(biāo)準(zhǔn)步驟之一[\t"/CN112137202040/_blank"2,\t"/CN112137202040/_blank"7]。一般認(rèn)為，攜帶1個(gè)SMN2拷貝的患者是最嚴(yán)重的0型，宮內(nèi)發(fā)病，出生后1個(gè)月內(nèi)死亡；攜帶2個(gè)SMN2拷貝的患者通常為1型，大部分在2歲前死亡，早期給予藥物治療及呼吸和營(yíng)養(yǎng)支持可降低死亡率；攜帶3個(gè)SMN2拷貝的患者主要為2型和3型，需要藥物治療和前瞻性干預(yù)及定期隨訪；攜帶4個(gè)SMN2拷貝數(shù)的患者通常為4型，發(fā)病晚，病情進(jìn)展緩慢[\t"/CN112137202040/_blank"26,\t"/CN112137202040/_blank"27]。SMN2拷貝數(shù)在以調(diào)控SMN蛋白為治療策略的藥物臨床試驗(yàn)中常常被作為重要參考數(shù)據(jù)[\t"/CN112137202040/_blank"28]，而在新生兒篩查中則被作為癥狀出現(xiàn)前患者治療評(píng)估的重要生物學(xué)標(biāo)志物[\t"/CN112137202040/_blank"9]。三、攜帶者及人群攜帶率SMA攜帶者指表型正常但一條染色體上的SMN1基因功能正常而另一條染色體的SMN1基因存在致病性變異的個(gè)體。在正常等位基因中，將攜帶1個(gè)SMN1基因拷貝定義為1拷貝（1-copy）；將攜帶2個(gè)SMN1基因拷貝定義為2拷貝（2-copy）。在致病等位基因中，將攜帶SMN1缺失或因轉(zhuǎn)換導(dǎo)致的SMN1缺失定義為0拷貝（0-copy）；將攜帶微小變異的SMN1基因定義為1d[\t"/CN112137202040/_blank"8]。因此，SMA攜帶者的SMN1基因型主要分為4種：[1+0]基因型，即外顯子7拷貝數(shù)為1，該攜帶者的一條染色體上SMN1功能正常，另一條染色體上存在SMN1缺失或轉(zhuǎn)換；[2+0]基因型，即SMN1外顯子7拷貝數(shù)為2，該攜帶者2個(gè)功能正常的SMN1基因拷貝位于同一條染色體，另一條染色體上存在SMN1缺失或轉(zhuǎn)換；[1+1d]和[2+1d]基因型，即SMN1外顯子7拷貝數(shù)≥2，一條染色體上的SMN1功能正常，并且拷貝數(shù)為1或2，另一條染色體上的SMN1基因存在微小變異而功能異常[\t"/CN112137202040/_blank"8]。世界范圍內(nèi)SMA攜帶率為1/100~1/45[\t"/CN112137202040/_blank"1]，亞洲人群攜帶率約為1/48。一般人群中，[1+0]、[2+0]、[1+1d]和[2+1d]基因型的人群頻率分別為2.58×10-2、1.09×10-3、4.72×10-4和1.99×10-5[\t"/CN112137202040/_blank"29]。而在肯定攜帶者人群中[2+0]頻率約為4%[\t"/CN112137202040/_blank"30]，[1+1d]頻率約為5%[\t"/CN112137202040/_blank"16]。基因診斷SMN1發(fā)生雙等位基因的致病性變異是SMA診斷的主要依據(jù)，臨床診斷或臨床疑似SMA的患者均應(yīng)進(jìn)行基因檢測(cè)確診。檢測(cè)的目標(biāo)基因?yàn)镾MN1和SMN2。其中SMN1拷貝數(shù)和致病性變異的檢測(cè)結(jié)果用于疾病診斷或排除診斷，SMN2拷貝數(shù)的檢測(cè)結(jié)果作為患者診斷后的治療、臨床管理和預(yù)后評(píng)估的參考指標(biāo)。一、基因診斷原則SMA基因診斷應(yīng)滿足各種SMN1突變基因型患者的診斷，包括SMN1純合缺失患者，即[0+0]基因型；以及SMN1基因復(fù)合雜合突變患者，即[0+1d]基因型：（1）在人類基因組中SMN1與SMN2高度同源，基因診斷技術(shù)須分別針對(duì)SMN1和SMN2。SMN1與SMN2全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本在外顯子7（c.840C/T）和外顯子8（c.*239G/A）的差異堿基位點(diǎn)作為區(qū)分兩個(gè)基因座的主要參考位點(diǎn)。（2）SMN1與SMN2均存在多個(gè)轉(zhuǎn)錄本，為減少致病性變異的誤判，推薦SMN1NM_000344.3和SMN2NM_017411.3全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本分別作為SMN1與SMN2基因分析的參考序列。（3）應(yīng)用定量分析技術(shù)進(jìn)行基因檢測(cè)時(shí)，建議同時(shí)報(bào)告SMN1和SMN2的拷貝數(shù)。（4）基因診斷明確的患者，其父母有必要進(jìn)行SMN1檢測(cè)，以便確定父母SMN1基因型和患者變異基因的來(lái)源，進(jìn)行遺傳咨詢。二、基因診斷流程：由于95%的SMA患者為SMN1外顯子7純合缺失，應(yīng)首先進(jìn)行SMN1拷貝數(shù)定量分析。當(dāng)受檢者為SMN1外顯子7或外顯子7與8純合缺失，即可診斷為SMN1純合缺失型患者。當(dāng)受檢者為SMN1雜合缺失，提示需進(jìn)行另一個(gè)SMN1等位基因的序列分析：如檢測(cè)到微小致病性變異，該個(gè)體診斷為SMN1缺失和微小變異的復(fù)合雜合突變患者；如未查到微小致病性變異且臨床表現(xiàn)又不典型，該個(gè)體可能僅為SMN1缺失攜帶者，可能是其他疾病患者，需進(jìn)一步鑒別診斷。當(dāng)受檢者沒(méi)有檢測(cè)出SMN1純合缺失或復(fù)合雜合變異，但具有明確的SMA臨床診斷，則可能存在檢測(cè)范圍外的致病性變異，特別當(dāng)患者父母為近親婚配時(shí)，應(yīng)進(jìn)行SMN1基因全序列分析，以確診SMN1雙等位基因均為致病性微小變異的患者?；蛟\斷流程見(jiàn)\t"/CN112137202040/_blank"圖1。三、SMA相關(guān)的基因診斷技術(shù)（一）拷貝數(shù)檢測(cè)技術(shù)1．多重連接探針擴(kuò)增（MLPA）：MLPA方法針對(duì)SMN1與SMN2基因第7和第8外顯子堿基差異位點(diǎn)（c.840位點(diǎn)C/T和c.*239位點(diǎn)G/A）設(shè)計(jì)雜交探針，采用其他染色體位點(diǎn)的多個(gè)管家基因作為內(nèi)參基因，以SMN1∶SMN2不同拷貝數(shù)的樣本作為平行對(duì)照，在完成雜交連接等系列反應(yīng)后，根據(jù)熒光峰面積的比值比來(lái)判斷目標(biāo)基因序列的拷貝數(shù)。MLPA技術(shù)通過(guò)直接檢測(cè)SMN1拷貝數(shù)，明確區(qū)分患者、攜帶者及正常人；還可同時(shí)檢測(cè)患者的SMN2拷貝數(shù)，是目前國(guó)內(nèi)外SMA管理共識(shí)推薦使用診斷SMA的金標(biāo)準(zhǔn)[\t"/CN112137202040/_blank"2,\t"/CN112137202040/_blank"7]。但是該方法不能檢測(cè)SMN1基因微小變異與SMN1[2+0]基因型。2．熒光定量PCR：主要原理是通過(guò)多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，以管家基因序列為內(nèi)參，采用Taqman探針?lè)ǚ謩e對(duì)SMN1基因第7和第8外顯子進(jìn)行拷貝數(shù)相對(duì)定量，來(lái)判斷是否發(fā)生缺失變異。該方法優(yōu)勢(shì)是操作簡(jiǎn)便、成本低廉，適用于人群篩查，但其特異性相比MLPA方法略遜，且SMN2拷貝數(shù)需要另外設(shè)計(jì)探針進(jìn)行檢測(cè)。同樣不能檢測(cè)SMN1基因微小變異和[2+0]基因型。（二）SMN1微小變異檢測(cè)技術(shù)SMN1復(fù)合雜合突變患者需要確認(rèn)發(fā)生在SMN1基因的微小變異。由于SMN1和SMN2高度同源，通常采用SMN1特異性長(zhǎng)片段PCR結(jié)合巢式PCR的方法或SMN1基因逆轉(zhuǎn)錄（RT）-克隆測(cè)序進(jìn)行SMN1的變異分析。1．SMN1特異性長(zhǎng)片段PCR結(jié)合巢式PCR：根據(jù)SMN1和SMN2差異堿基，設(shè)計(jì)等位基因特異性引物用以特異性擴(kuò)增整個(gè)SMN1來(lái)源的基因組DNA序列，再以長(zhǎng)片段擴(kuò)增產(chǎn)物作為模板通過(guò)巢式PCR擴(kuò)增每個(gè)外顯子及鄰近的內(nèi)含子進(jìn)行序列分析，檢測(cè)SMN1序列是否存在基因變異?？梢詸z測(cè)SMN1外顯子和鄰近內(nèi)含子區(qū)域的微小變異。2．RT-克隆測(cè)序方法：提取患者外周血總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后非特異性擴(kuò)增全長(zhǎng)SMN基因（含SMN1和SMN2）cDNA，根據(jù)SMN1和SMN2差異堿基挑選SMN1克隆，通過(guò)Sanger測(cè)序的方法檢測(cè)來(lái)源于SMN1cDNA的基因變異。該方法可以檢測(cè)外顯子的變異，也可以檢測(cè)內(nèi)含子區(qū)域影響剪接的變異的異常轉(zhuǎn)錄本，但是不能檢測(cè)到調(diào)控區(qū)域的變異。3．常規(guī)Sanger測(cè)序：因操作簡(jiǎn)便，可用于篩查SMN1雜合缺失患者是否存在SMN基因微小變異。但因該方法無(wú)法區(qū)分微小變異發(fā)生在SMN1還是SMN2，需要進(jìn)一步驗(yàn)證。（三）NGS由于高通量且商業(yè)化，NGS已成為單基因遺傳病基因診斷的首選技術(shù)。由于SMN1和SMN2基因高度同源性，并且存在因相互部分轉(zhuǎn)換形成的SMN1-SMN2融合基因，而目前的測(cè)序技術(shù)讀長(zhǎng)短（比如Illumina測(cè)序平臺(tái)讀長(zhǎng)為100-150bp），因此NGS數(shù)據(jù)的常規(guī)比對(duì)拼接方法無(wú)法區(qū)別SMN1和SMN2基因的變異，gnomAD數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)關(guān)于SMN1基因變異位點(diǎn)的信息描述也說(shuō)明這個(gè)事實(shí)。但由于SMN1和SMN2基因存在2個(gè)堿基差異位點(diǎn)（exon7的c.840C/T；exon8的c.*239G/A），實(shí)驗(yàn)室可利用該位點(diǎn)的堿基類型的read比例來(lái)推測(cè)SMN1基因是否存在雜合或純合缺失，但無(wú)法確定SMN1基因缺失長(zhǎng)度和SMN2基因拷貝數(shù)。2017年一項(xiàng)研究證實(shí)通過(guò)改進(jìn)實(shí)驗(yàn)操作和生物信息學(xué)分析流程[\t"/CN112137202040/_blank"31]，NGS可同時(shí)檢測(cè)SMN1基因拷貝數(shù)和篩查SMN基因微小變異。與MLPA技術(shù)相比，其檢測(cè)SMN1基因拷貝數(shù)變異的靈敏度可達(dá)100%，特異性可達(dá)99.6%，但應(yīng)用該技術(shù)篩選出的微小變異未能直接明確存在于SMN1或SMN2基因。2020年，另一項(xiàng)研究也建立了用于篩查SMN1和SMN2拷貝數(shù)的NGS，應(yīng)用已知陽(yáng)性病例通過(guò)MLPA技術(shù)驗(yàn)證，該技術(shù)準(zhǔn)確率達(dá)到100%[\t"/CN112137202040/_blank"32]。值得注意的是，以上兩項(xiàng)研究均將SMN1和SMN2基因（chr5∶70220768-70248838和chr5∶69345350-69373418）都作為靶向區(qū)域篩選變異，基于SMN1和SMN2基因的差異性位點(diǎn)對(duì)常規(guī)測(cè)序和生物信息學(xué)流程進(jìn)行改進(jìn)，使用已知陽(yáng)性樣本的NGS數(shù)據(jù)作為內(nèi)標(biāo)構(gòu)建SMN1基因的拷貝數(shù)計(jì)算公式。以上研究表明，NGS直接計(jì)算SMN1拷貝數(shù)的技術(shù)將逐漸成熟和準(zhǔn)確，但篩查或診斷SMN1微小變異仍存在很大困難。目前在我國(guó)，NGS尚未成為SMA的常規(guī)檢測(cè)方法，但是其適用于SMA鑒別診斷，即對(duì)非5qSMA的神經(jīng)肌肉病，或者以肌無(wú)力為臨床癥狀需要排除診斷的患者開(kāi)展致病基因變異篩查。如果診斷實(shí)驗(yàn)室只是利用SMN1和SMN2基因的差異位點(diǎn)來(lái)推測(cè)SMN1基因的雜合或純合缺失，而沒(méi)有如以上文獻(xiàn)建立SMN1基因拷貝數(shù)變異的計(jì)算方法，則必須使用經(jīng)典拷貝數(shù)診斷方法（比如MLPA）進(jìn)行驗(yàn)證。如果利用NGS篩查SMN1基因的微小變異，則需要說(shuō)明如何確定該變異發(fā)生在SMN1基因。（四）其他檢測(cè)技術(shù)SMA傳統(tǒng)的檢測(cè)方法還有雙側(cè)雙重等位基因特異性PCR（AS-PCR）與聚合酶鏈反應(yīng)-變性高效液相色譜（PCR-DHPLC）等。對(duì)于不具備定量檢測(cè)技術(shù)條件的檢測(cè)機(jī)構(gòu)可以應(yīng)用定性檢測(cè)技術(shù)診斷SMN1外顯子7純合缺失病例，例如PCR-酶切分析或者Sanger測(cè)序等。但定性檢測(cè)技術(shù)不能檢測(cè)SMN1基因的雜合缺失，可能導(dǎo)致復(fù)合雜合突變患者的漏診或誤診。四、基因診斷報(bào)告要點(diǎn)1．基本信息：包括被檢測(cè)者的個(gè)體識(shí)別信息，如姓名、性別、出生日期、采集樣本時(shí)間、樣本性質(zhì)、門(mén)診號(hào)及住院號(hào)、送檢醫(yī)生信息等。2．病歷信息：包括患兒癥狀、體征、輔助檢查結(jié)果和臨床診斷。3．基因檢測(cè)方法：應(yīng)說(shuō)明使用的檢測(cè)方法、檢測(cè)試劑名稱和型號(hào)、列出檢測(cè)方法的適用范圍、檢測(cè)技術(shù)的局限性。還應(yīng)說(shuō)明SMA的基因型分布的背景資料。4．檢測(cè)的目標(biāo)基因：檢測(cè)的基因名稱、基因組位置、基因的轉(zhuǎn)錄本號(hào)。5．檢測(cè)結(jié)果和結(jié)果解讀：（1）拷貝數(shù)檢測(cè)報(bào)告應(yīng)包含如下信息：SMN1基因和SMN2基因外顯子7和外顯子8的拷貝數(shù)；（2）基因微小變異分析報(bào)告或基因序列分析報(bào)告應(yīng)包含如下信息：SMN1微小變異信息、遺傳模式、變異來(lái)源、致病性分析等；（3）建議拷貝數(shù)和基因微小變異的檢測(cè)結(jié)果報(bào)告以表格形式報(bào)告，并提供原始的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。6．SMN1變異的致病性分析和命名：SMN1基因外顯子7拷貝數(shù)缺失為明確的致病性變異，單堿基或幾個(gè)堿基的微小變異建議參照ACMG制定的基因變異解讀指南[\t"/CN112137202040/_blank"23]，將變異的臨床意義依據(jù)評(píng)估證據(jù)進(jìn)行五級(jí)分類：致病性、可能致病性、臨床意義不明、可能良性和良性。致病性和可能致病性變異通常認(rèn)為是導(dǎo)致疾病發(fā)生的變異，臨床意義不明變異建議結(jié)合臨床診斷進(jìn)行后期數(shù)據(jù)重分析。對(duì)于測(cè)序發(fā)現(xiàn)的未報(bào)道、變異，尤其錯(cuò)義變異，由于缺乏SMN1基因區(qū)域的正常人群頻率，致病性評(píng)估中PM2證據(jù)可能無(wú)法使用。致病性變異命名參照國(guó)際變異命名網(wǎng)站（/）的標(biāo)準(zhǔn)。7．檢測(cè)結(jié)論和建議：檢測(cè)報(bào)告應(yīng)給出明確的檢測(cè)結(jié)論。如本檢測(cè)方法不能完成患者基因診斷，則應(yīng)給出是否需要進(jìn)一步驗(yàn)證以及驗(yàn)證方法的建議。五、基因診斷后的臨床管理和遺傳咨詢首先判讀基因檢測(cè)報(bào)告是否明確了患者的基因型及變異的致病性等，檢測(cè)結(jié)果是否可以解釋患者的臨床表現(xiàn)，確認(rèn)遺傳學(xué)診斷的有效性。對(duì)患者及時(shí)進(jìn)行臨床分型及病情評(píng)估，解釋疾病的發(fā)生發(fā)展，開(kāi)展藥物治療、多學(xué)科管理和定期隨訪。延長(zhǎng)患者生存周期，提高運(yùn)動(dòng)功能，延緩和減輕并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展。提供患者及監(jiān)護(hù)人遺傳咨詢，包括：遺傳病因、傳遞模式、再發(fā)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、產(chǎn)前診斷或植入前遺傳學(xué)檢測(cè)等再生育選擇以及家庭成員攜帶者篩查建議等相關(guān)信息和指導(dǎo)（\t"/CN112137202040/_blank"圖1）。產(chǎn)前診斷由于SMA的病情嚴(yán)重、治療費(fèi)用昂貴，現(xiàn)階段產(chǎn)前診斷仍然是SMA主要的預(yù)防手段。1．SMA產(chǎn)前診斷原則：SMA的產(chǎn)前診斷應(yīng)在具備產(chǎn)前診斷資質(zhì)的醫(yī)療機(jī)構(gòu)由具有資質(zhì)的專業(yè)人員進(jìn)行。實(shí)施產(chǎn)前診斷之前必須預(yù)分析或驗(yàn)證先證者及父母的變異基因型，明確先證者的SMN1變異類型，據(jù)此制定該家系實(shí)施產(chǎn)前診斷的策略和診斷技術(shù)。產(chǎn)前診斷通常在母孕的早、中期采集胎兒絨毛組織或羊水細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。2．SMA產(chǎn)前診斷的對(duì)象：（1）生育過(guò)SMA患兒的夫妻；（2）夫妻雙方均為SMA攜帶者；（3）生育過(guò)臨床診斷SMA的患兒，但患兒夭折前未行基因診斷，再生育前通過(guò)SMN1基因檢測(cè)明確雙方為SMA攜帶者的夫妻。3．產(chǎn)前診斷的基因和基因型：SMA產(chǎn)前診斷的檢測(cè)基因?yàn)镾MN1。由于SMN1基因的特殊性，大部分產(chǎn)前診斷機(jī)構(gòu)僅針對(duì)SMN1缺失型SMA進(jìn)行產(chǎn)前檢測(cè)；復(fù)合雜合變異的SMA家庭行產(chǎn)前診斷前應(yīng)到有檢測(cè)SMN1微小變異經(jīng)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行微小變異的確定，再進(jìn)行產(chǎn)前檢測(cè)。對(duì)于SMN1缺失型SMA，要參考父母的基因型對(duì)胎兒進(jìn)行基因型判斷。當(dāng)父母皆為[1+0]基因型，胎兒為SMN1純合缺失型時(shí)診斷為SMA受累胎兒。建議進(jìn)一步檢測(cè)SMN2的拷貝數(shù)，在產(chǎn)前遺傳咨詢中可以給予胎兒父母更多關(guān)于SMA臨床表型信息，幫助他們對(duì)胎兒去留進(jìn)行決策[\t"/CN112137202040/_blank"33,\t"/CN112137202040/_blank"34]。當(dāng)胎兒SMN1為1拷貝時(shí)，診斷為缺失型攜帶者，表型正常。當(dāng)胎兒SMN1為2拷貝時(shí)，孕胎為基因型和表型正常的個(gè)體。如果父母之一基因型為[2+0]時(shí)，胎兒SMN1雖有2拷貝，胎兒仍為[2+0]型攜帶者個(gè)體，只有拷貝數(shù)為3時(shí)，胎兒才是正常個(gè)體。4．SMA產(chǎn)前診斷的技術(shù)和局限性：SMN1缺失型SMA產(chǎn)前診斷推薦采用MLPA或qPCR技術(shù)對(duì)胎兒進(jìn)行SMN1基因拷貝數(shù)分析。這兩個(gè)方法均為拷貝數(shù)劑量的檢測(cè)，檢測(cè)范圍有一定的局限性：（1）如果沒(méi)有父母的基因型數(shù)據(jù)，無(wú)法檢測(cè)胎兒新生的SMN1微小變異；（2）無(wú)法檢測(cè)胎兒為SMN1[2+0]基因型的攜帶者；（3）無(wú)法檢測(cè)胎兒SMN1缺失的低比例嵌合體。需要注意的是，由于SMA以SMN1純合缺失型為主，母源污染是導(dǎo)致錯(cuò)誤產(chǎn)前診斷的重要根源。對(duì)絨毛組織要盡可能去除可能的母源組織，當(dāng)羊水有血性污染時(shí)要進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，無(wú)論是絨毛還是羊水均應(yīng)同時(shí)以STR或SNPs為標(biāo)記進(jìn)行連鎖分析，排除母源污染的可能。5．SMA產(chǎn)前診斷前后的遺傳咨詢[\t"/CN112137202040/_blank"34]：產(chǎn)前診斷前的遺傳咨詢需告知以下要點(diǎn)：（1）SMA產(chǎn)前診斷的目的是了解孕胎攜帶致病基因的情況。孕胎產(chǎn)前診斷的可能結(jié)果包括正常個(gè)體、攜帶者或受累胎兒。獲得產(chǎn)前診斷結(jié)果后胎兒的取舍由其父母知情選擇。（2）SMA為常染色體隱性遺傳病，父母均為攜帶者時(shí)，每次生育SMA患兒的再發(fā)風(fēng)險(xiǎn)為25%，男女患病機(jī)會(huì)均等。SMN1[1+0]和[2+0]基因型攜帶者家庭的再發(fā)風(fēng)險(xiǎn)和產(chǎn)前診斷策略相同。（3）產(chǎn)前診斷的基因檢測(cè)范圍僅限于檢測(cè)SMN1和SMN2基因的拷貝數(shù)或某個(gè)特定的微小變異；（4）產(chǎn)前檢測(cè)所用的方法及原理，方法的敏感度、特異度、局限性和準(zhǔn)確度；（5）胎兒取材的種類和時(shí)間，產(chǎn)前診斷的價(jià)格和報(bào)告時(shí)間；（6）還要特別告知，產(chǎn)前診斷取材中可能會(huì)無(wú)法避免母源污染，有需要重新取材的可能；（7）獲得SMA產(chǎn)前檢測(cè)報(bào)告后需進(jìn)行遺傳咨詢。產(chǎn)前診斷后的遺傳咨詢主要包括：（1）針對(duì)目前檢測(cè)結(jié)果是否還需進(jìn)一步的檢測(cè)；（2）告知產(chǎn)前檢測(cè)結(jié)果，如為受累胎兒，告知疾病相關(guān)信息；（3）當(dāng)胎兒診斷為SMA受累胎兒并選擇出生時(shí)，應(yīng)給予相關(guān)治療和干預(yù)措施等醫(yī)學(xué)信息和建議；（4）需要強(qiáng)調(diào)SMN2的拷貝數(shù)與胎兒出生后的臨床表型不完全相關(guān)，SMN2拷貝數(shù)僅作為胎兒臨床表型預(yù)測(cè)的參考。植入前遺傳學(xué)檢測(cè)胚胎植入前遺傳學(xué)檢測(cè)（PGT）是指將輔助生殖技術(shù)（ART）和遺傳學(xué)分析技術(shù)相結(jié)合，對(duì)生育遺傳病患兒高風(fēng)險(xiǎn)家庭進(jìn)行胚胎活檢和遺傳檢測(cè)，選擇已知疾病不受累的胚胎植入子宮從而獲得健康的子代。一、SMA的PGT原則（1）由于胚胎基因診斷技術(shù)仍為有創(chuàng)檢測(cè)，PGT原則上僅針對(duì)嚴(yán)重致畸、致殘、致死性或者治療費(fèi)用極其昂貴的遺傳性疾病，大部分SMA屬于此類型遺傳疾病，滿足單基因遺傳病PGT（PGT-M）的指征；（2）基因突變攜帶者或先證者基因檢測(cè)結(jié)果明確；（3）夫妻雙方對(duì)胚胎基因診斷的流程和風(fēng)險(xiǎn)充分了解，接受并出于主觀愿望進(jìn)行胚胎植入前基因診斷。二、SMA-PGT適宜人群（1）夫妻雙方均為SMA基因突變攜帶者；（2）夫妻中有一方或雙方血液基因組SMN1未見(jiàn)異常，如僅有一次SMA患兒生育或妊娠史，首先推薦產(chǎn)前診斷；如有2次及以上SMA患兒生育史或妊娠史，不排除生殖腺嵌合或一方為SMN1[2+0]基因型的可能性，這種情況符合PGT指征；（3）由于基因和突變類型的特殊性，攜帶SMN1基因突變的遺傳家系進(jìn)行PGT，需提供試驗(yàn)所需的完整核心家系成員的樣本（血液、組織或者DNA等）；（4）夫妻雙方無(wú)不適宜實(shí)施輔助生殖術(shù)的禁忌癥。三、PGT的目標(biāo)基因及SMN1突變基因型1．PGT檢測(cè)的目標(biāo)基因?yàn)镾MA的致病基因SMN1，SMN2不在檢測(cè)范圍。2．PGT技術(shù)目前大多采用堿基位點(diǎn)（SMN1和SMN2外顯子7差異位點(diǎn)或微小變異位點(diǎn)）直接檢測(cè)聯(lián)合家系連鎖分析的檢測(cè)策略，這種策略在必需家系成員樣本滿足要求的條件下，理論上對(duì)SMN1突變類型并無(wú)特殊限制。缺失型突變選擇SMN1與SMN2在外顯子7上的差異位點(diǎn)c.840C/T作為檢測(cè)目標(biāo)，以區(qū)分SMN1純合缺失和非純合缺失。對(duì)于SMN1致病性微小變異的檢測(cè)，由于SMN2的干擾，應(yīng)用PCR技術(shù)直接檢測(cè)變異位點(diǎn)存在一定的困難。近年來(lái)NGS在PGT上逐漸運(yùn)用，大大提高了SMN1微小變異的檢出率。該項(xiàng)技術(shù)將含有微小變異位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物與胚胎單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增產(chǎn)物混合，進(jìn)行全基因組測(cè)序，通過(guò)直接分析目標(biāo)位點(diǎn)比對(duì)的堿基，可清晰地判斷變異堿基所占的比例。但無(wú)論缺失突變還是微小變異，均需聯(lián)合家系連鎖分析，以判斷胚胎基因攜帶突變的準(zhǔn)確情況[\t"/CN112137202040/_blank"35,\t"/CN112137202040/_blank"36]。四、SMA胚胎基因檢測(cè)的技術(shù)和局限性（一）PGT檢測(cè)樣本PGT檢測(cè)樣本可以來(lái)源于胚胎植入前的三個(gè)階段：（1）極體（第一極體和第二極體）；（2）卵裂期單個(gè)卵裂球（發(fā)育到第3天胚胎）；（3）囊胚期滋養(yǎng)層細(xì)胞（發(fā)育到第5至6天胚胎）。目前大多采用囊胚期進(jìn)行滋養(yǎng)層細(xì)胞活檢[\t"/CN112137202040/_blank"37]。（二）PGT-M關(guān)鍵技術(shù)1．胚胎單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增技術(shù)（WGA）：胚胎活檢樣本通常為單個(gè)或極少量細(xì)胞，需經(jīng)過(guò)全基因組擴(kuò)增后方能用于后續(xù)遺傳學(xué)檢測(cè)。多種單細(xì)胞基因組擴(kuò)增方法各有優(yōu)勢(shì)，可選擇性應(yīng)用于PGT-M[\t"/CN112137202040/_blank"38,\t"/CN112137202040/_blank"39]。2．SMA的PGT-M檢測(cè)技術(shù)：如上所述，PGT-M檢測(cè)包括堿基位點(diǎn)直接檢測(cè)聯(lián)合家系連鎖分析。單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行位點(diǎn)檢測(cè)的方法，可采用特異性PCR或酶切等方法。家系連鎖分析主要依靠基因上下游或基因內(nèi)部的特異性STR或SNP。采用NGS，可獲得基因上下游充足的SNP位點(diǎn)，選用靠近基因上下游各三個(gè)以上有效SNP進(jìn)行一代驗(yàn)證（盡量在基因上下游1~2Mb以內(nèi)）。這種方法相對(duì)于STR分型，更利于確定染色體重組的具體位置，從而能更準(zhǔn)確判斷基因突變攜帶情況。目前這種檢測(cè)策略被廣泛用于PGT-M中[\t"/CN112137202040/_blank"35]。3．局限性：這種主要依賴家系連鎖分析的檢測(cè)策略可以對(duì)大部分遺傳家系胚胎進(jìn)行準(zhǔn)確診斷。但對(duì)于家系不全的夫妻的胚胎檢測(cè)，雖然可以借助極體或單個(gè)精子的優(yōu)勢(shì)作為家系連鎖分析的根據(jù)[\t"/CN112137202040/_blank"40]，但由于目前所應(yīng)用的單細(xì)胞擴(kuò)增方法還不能完全解決等位基因脫扣（ADO）的問(wèn)題，給極體和單精子突變位點(diǎn)的檢測(cè)帶來(lái)一定誤差。因此對(duì)于家系不全的夫妻的胚胎檢測(cè)，除PGT-M流程前的風(fēng)險(xiǎn)告知和知情同意外，移植后妊娠中期的產(chǎn)前診斷是必要的。五、SMA胚胎診斷前后的遺傳咨詢與知情同意1．PGT前：試管前遺傳咨詢是PGT的關(guān)鍵環(huán)節(jié)（咨詢內(nèi)容同產(chǎn)前診斷）。生殖科臨床醫(yī)生（具遺傳背景）根據(jù)患者的生育力評(píng)估和家系狀況，告知患者PGT流程、風(fēng)險(xiǎn)和技術(shù)的局限性，簽署知情同意。2．PGT后：胚胎檢測(cè)結(jié)束后，在胚胎移植前，夫婦依據(jù)檢測(cè)報(bào)告再次進(jìn)行遺傳咨詢，確定是否移植和移植順序。簽署移植知情同意后啟動(dòng)移植流程。3．移植后驗(yàn)證與隨訪：PGT胚胎移植后如成功妊娠，孕中期建議進(jìn)行羊水細(xì)胞基因驗(yàn)證。新生兒發(fā)育隨訪與所有植入前胚胎遺傳學(xué)檢測(cè)策略相同。攜帶者篩查由于SMA病情嚴(yán)重、人群攜帶率高、檢測(cè)方法可靠經(jīng)濟(jì)、遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷可行，2008年ACMG建議不僅有SMA家族史的夫婦應(yīng)接受攜帶者篩查，而且所有種族和民族的一般人群都應(yīng)接受SMA攜帶者篩查[\t"/CN112137202040/_blank"10]；2009年美國(guó)婦產(chǎn)科學(xué)會(huì)（ACOG）建議孕前和懷孕早期的婦女應(yīng)進(jìn)行SMA攜帶者篩查[\t"/CN112137202040/_blank"41]。1．?dāng)y帶者篩查的適宜人群：（1）高危人群：確診為SMA患者的家庭成員，SMA患者或攜帶者的配偶。（2）一般人群：目前，我國(guó)尚無(wú)SMA攜帶者篩查的指南，根據(jù)已發(fā)表的文獻(xiàn)報(bào)道，中國(guó)SMA攜帶率為1/42~1/48[\t"/CN112137202040/_blank"3,\t"/CN112137202040/_blank"22,\t"/CN1121